类病毒组合物颗粒及其使用方法

专利名称：类病毒组合物颗粒及其使用方法
技术领域：
本发明是关于组合物与使用方法，特别是关于类病毒组合物及其使用方法。
背景技术：
本申请主张以2008年11月沈日与2008年12月5日申请的美国临时申请案号 61/118，206与61/201，118作为优先权案，并且上述两案的全文内容皆并入本案作为参考。基孔肯尼亚(chikimgimya)病毒(CHIKV)是披膜病毒科中由蚊子传播的亚法病毒 (alphavirus)，最先是1952年在坦桑尼亚分离而得。此种病毒感染造成的人类疾病特征在于疹子、高烧以及明显特征就是持续数年的关节炎。从2004年在肯尼亚再次出现起，在非洲、欧洲与亚州，基孔肯尼亚病毒(CHIKV)已经感染数百万人。在没有疫苗或是抗病毒治疗之下，病毒的演化与散布进入新的地理区域，以及疾病严重性成为严重的公共务生问题。因此，CHIKV抗病毒的发展与疫苗发展成具有高优先性。CHIKV的系统发生分析显示有三种基因型(genotypes)亚洲、东/中/南非以及西非。亚洲与东/中/南非基因型最相似，然而西非品系较不同。急迫需要用于治疗或预防基孔肯亚病毒疾病的治疗与/或预防方法。

发明内容
如下所述，本发明特征在用于预防或治疗一或多种基孔肯尼亚病毒株与其它亚法病毒(alphavirus)媒介疾病的组合物与方法。在一方面，本发明提供类病毒颗粒(VLP)包含一或多(例如一、二、三、四、五)基孔肯尼亚病毒结构多肽。在一实施例中，结构多肽是壳体与包膜蛋白E3、E2、6K与El其中任一个或多个。在另一方面，本发明提供分离的多核苷酸，它是编码前述或是本申请所述任何其它VLP的类病毒颗粒。在一实施例中，所述多核苷酸编码包含C-E3-E2-6K-E1的基孔肯尼亚病毒多蛋白。在相关方面，本发明提供包含多核苷酸的表现载体，所述多核苷酸编码一或多个基孔肯尼亚病毒结构多肽。在另一方面，本发明提供包含任何前述表现载体或是本申请中任何其它表现载体的原核或真核细胞(例如哺乳动物、人类、昆虫)。在另一方面，本发明提供免疫原组合物(immunogenic composition)，包含有效量的前述的类病毒颗粒或本申请中任何其它VLP0在相关方面，本发明提供免疫原组合物，包含有效量的VLP，含有具有 C-E3-E2-6K-E1的基孔肯尼亚结构多蛋白，以及佐剂。在另一方面，本发明提供免疫原组合物，包含有效量的任何前述或本申请中其它的表现载体(例如DNA疫苗)。在另一方面，本发明提供疫苗，包含有效量的一或多个基孔肯尼亚病毒结构多肽， 是壳体(C)与包膜蛋白E1、E2、E3与6K中的任一个或多个。
在另一方面，本发明提供疫苗，包含有效量的前述类病毒颗粒或是包含具有 C-E3-E2-6K-E1 的多蛋白。在另一方面，本发明提供疫苗，包含编码基孔肯尼亚结构多蛋白或其片段的多核苷酸。在一实施例中，由任何前述的表现载体编码基孔肯尼亚结构多蛋白。在一实施例中， 所述表现载体包刮CMV/R启动子。在另一实施例中，所述疫苗是DNA疫苗。在另一方面，本发明提供在个体(例如人类)中诱导免疫反应对抗基孔肯尼亚病毒的方法，所述方法涉及对所述个体给予有效量的前述免疫原组合物或是本申请中任何其它的免疫原组合物。在一实施例中，所述免疫原组合物包含一或多个基孔肯尼亚病毒结构多肽，亦即壳体(C)与孢膜蛋白E1、E2、E3与6K中的一或多个。在另一个实施例中，所述免疫原组合物包括含有C-E3-E2-6K-E1的多蛋白。在另一实施例中，所述方法在个体中诱导中和抗体。在另一方面，本发明提供一种用于个体中治疗或预防基孔肯尼亚感染的方法，所述方法涉及对所述个体给予有效量的前述疫苗或是任何前述的免疫原组合物。在一实施例中，其中给予所述疫苗或免疫原组合物一次或多次剂量。在另一方面，本发明提供一种用于产生类病毒颗粒的方法，所述方法是涉及在细胞中表现一或多种可自行组合(self-assembly)的基孔肯尼亚结构蛋白，形成类病毒颗粒。在一实施例中，所述方法更包含分离所述类病毒颗粒。在另一方面，本发明提供包含一或多个亚法结构多肽(例如壳体或是包膜多肽) 的类病毒颗粒(VLP)。在一实施例中，亚法病毒是基孔肯尼亚病毒、辛德毕病毒(Sindbis virus)、东方马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis (EEE) virus)、西方马脑炎病毒(Western equine encephalitis (WEE) virus)以及委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis (VEE) virus)巾白勺ftfS]"一禾中$$禾中。在另一方面，本发明提供分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码前述或本申请所述的类病毒颗粒。在另一方面，本发明提供包含编码一或多个亚法病毒结构多肽的表现载体， 其中所述亚法病毒是选自于基孔肯尼亚病毒、辛德毕病毒(Sindbis virus)、东方马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis (EEE) virus)、西方马脑炎病毒(Western equine encephalitis (WEE) virus)以及委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis (VEE) virus)所组成的群组。在另一方面，本发明提供免疫原组合物，包含有效量的前述或本申请所述的类病
毒颗粒。在另一方面，本发明提供疫苗，包含有效量的一种或多种亚法病毒结构多肽或是编码一或多种亚法病毒结构蛋白的多核苷酸，其中所述亚法病毒是选自于基孔肯尼亚病毒、辛德毕病毒(Sindbis virus)、东方马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis (EEE) virus)、西方马脑炎病毒(Western equine encephalitis (WEE) virus)以及委内瑞拉马脑
(Venezuelan equine encephalitis (VEE) virus) MtIj^白勺 1￥砠。在另一方面，本发明提供一种在个体中诱导免疫反应对放亚法病毒的方法，所述方法涉及对所述个体给予有效量的前述免疫原组合物。在一实施例中，所述免疫原组合物包含一或多种亚法病毒结构多肽(例如包膜或是壳体)。
在另一方面，本发明提供一种用于个体中治疗或预防亚法病毒感染的方法，所述方法涉及对所述个体给予有效量的前述任何疫苗或是免疫原组合物。在另一方面，本发明提供包含前述任何VLP以及使用说明的套组(kit)。在另一方面，本发明提供包含前述任何免疫原组合物以及在个体中使用说明的套组。在一实施例中，所述免疫原组合物是提供在第一容器中，以及第二免疫原组合物是提供在第二容器中，以及基础加强免疫(prime boost immunization)的使用说明。在另一实施例中在第二容器中的所述免疫原组合物包含VLP、病毒的多肽或是病毒的多核苷酸。在另一方面，本发明提供一种用于辨识基孔肯尼亚病毒进入真核细胞的抑制剂的方法，所述方法涉及使表现基孔肯尼亚病毒受体的细胞接触选自于C、E3、E2、6K与El的基孔肯尼亚多肽以及候选化合物，以及分析病毒进入，其中相较于控制细胞，减少病毒进入系崩的候选化合物被辨识为基孔肯尼亚病毒进入的抑制剂。在一实施例中，所述候选抑制剂是抗体或是其片段或是小分子。在另一方面，本发明提供一种用于辨识基孔肯尼亚病毒进入的抑制剂的方法， 涉及将表现基孔肯尼亚病毒受体的细胞接触候选抑制剂以及含有受体基因的假型病毒 (pseudotyped virus)；以及测量细胞中受体基因的表现，其中相较于控制细胞，减少受体基因表现的化合物被辨识为抑制病毒进入。在一实施例中，所述假型病毒(例如慢病毒 (Ientivirus))包含一或多种基孔肯尼亚病毒包膜蛋白(例如E3、E2、6K与El)。在一实施例中，所述候选抑制物是抗体或是其片段，或是小分子。在另一方面，本发明提供类病毒颗粒(VLP)包含一或多种基孔肯尼亚病毒结构多肽，用于治疗或预防基孔肯尼亚感染。在另一方面，本发明提供一种用于治疗或预防基孔肯尼亚感染的方法，所述方法涉及给予类病毒颗粒(VLP)，包含一或多个基孔肯尼亚病毒结构多肽，并且是在给予一或多另一免疫原组合物、抗病毒或抗生素剂之前、之后、同时或是任何顺序。在另一方面，本发明提供用于治疗或预防基孔肯尼亚感染的方法，对个体(例如人类)给予对抗本发明VLP所产生的中和抗体(例如哺乳动物、人类)。在上述各方面或是本发明任何其它方面的不同实施例中，所述VLP包含一或多种 (1、2、3、4)包膜蛋白E3、E2、6K与E1。在其它实施例中，所述VLP包含含有C-E3-E2-6K-E1 或其片段的多蛋白。在上述各方面或是本发明任何其它方面的其它实施例中，多核苷酸编码一或多种结构多肽，所述结构多肽是亚法病毒或是基孔肯尼亚病毒壳体(C)与包膜蛋白 E3、E2、6K与El中的任何一种或多种。在其它实施例中，所述多核苷酸编码包膜蛋白E3、 E2、6K与E1。在其它实施例中，所述多核苷酸编码包含C-E3-E2-6K-E1的基孔肯尼亚病毒多蛋白。在其它实施例中，表现载体可在原核或真核细胞(例如哺乳动物、人类)中表现。 在其它实施例中，结构多蛋白取得于基孔肯尼亚株37997或是LR2006。在其它实施例中，载体包括CMV/R启动子。在其它实施例中，表现载体是C-E37997或是C-E0PY-1。在其它实施例中，所述VLP在个体中诱导免疫反应(例如保护性的免疫反应)。在其它实施例中，免疫反应治疗或是预防个体中基孔肯尼亚感染。在上述方面的其它实施例中，所述VLP诱导对抗基孔肯尼亚同源或异源品系的抗体。在上述方面的实施例中，所述佐剂是免疫刺激剂 (例如Ribi、铝盐、胞壁酰肽(muramyl peptides)、细菌细胞壁成分、皂素佐剂)。在上述方面的其它实施例中，所述疫苗或免疫原组合物的给予是一或多次基础免疫以及一或多次加强免疫。在另一实施例中，所述基础免疫是在一、二、三、四、五、六、七或八周间隔给予。在另一实施例中，所述加强免疫是在基础免疫之后两周、一个月、两个月或三个月给予。在上述方面或本申请任何其它方面的其它实施例中，所述免疫保护个体对抗感染的viremia或发炎结果。在其它实施例中，所述方法保护个体免于lethality。在其它实施例中，所述方法在个体中诱导中和抗体。本发明提供免疫原组合物特征在于类病毒颗粒，包括基孔肯尼亚多肽用于预防或治疗基孔肯尼亚病毒疾病。以下所提供的范例，说明分离或制造本发明定义的组合物或物品。由详细说明与权利要求书可知本发明的其它特征与优点。定义“亚法病毒结构蛋白”是指与自然存在的病毒壳体或包膜蛋白具有至少约40%胺基酸序列相似度的多肽或其片段，以及在哺乳动物中具有免疫原活性。在一实施例中，所述亚法病毒结构蛋白与基孔肯尼亚病毒结构蛋白或其免疫原片段具有至少约85%、90%、 95%或更大的氨基酸序列相似度。在一实施例中，所述蛋白质范例亚法病毒包含但不限于西方、东方与委内瑞拉马脑炎病毒、阿尼昂尼昂病毒(ο’ nyong-nyong virus)、罗斯河病毒 (Ross River virus)与斤文德毕斯病毒(Sindbis virus)。“基孔肯尼亚病毒结构蛋白”是指与自然存在的基孔肯尼亚病毒壳体或包膜蛋白具有至少约85%胺基酸序列乡速度的多肽或其片段。在其它实施例中，所述胺基酸序列相似度至少约90%、95%或更高。“剂”是指任何小分子化学化合物、抗体、核酸分子或是多肽，或其片段。如本申请中所使用，“佐剂”是指当在配方中与特定免疫原结合使用时，会增强、改变或修饰造成的免疫反应的化合物。在一些实施例中，所述佐剂与VLP结合使用。在其它实施例中，所述佐剂与DNA疫苗结合使用。免疫反应的修饰包含强化或是扩大抗体与细胞免疫反应的专一性。免疫反应的修饰也可指降低或抑制某些抗原专一性的免疫反应。在一实施例中，所述佐剂是Ribi佐剂。本申请中的“亚法病毒”是指含有RNA的病毒，属于第四类披膜病毒科(group IV Togaviridae family)。范例亚法病毒包含但不限于西方、东方与委内瑞拉马脑炎病毒、 阿尼昂尼昂(O’ nyong-nyong virus)、罗斯河病毒(Ross River virus)与欣德毕斯病毒 (Sindbis virus)。本申请中“诱导免疫性”是指产生对抗抗原的任何免疫反应。在一实施例中，免疫性是由抗体媒介，对抗感染剂，所述免疫性是由脊椎动物(例如人类)所展示，防止或改善感染或是减少至少一症状。本发明的VLP或是DNA疫苗可刺激抗体的产生，例如中和感染剂、抑制感染剂进入细胞、抑制感染剂的复制，以及/或保护宿主细胞不受感染与破坏。所述用词也可指由T淋巴细胞与/或其它白血球细胞媒介的免疫反应对抗感染剂，这是由脊椎动物(例如人类)所展示，预防或是改善感染，例如基孔肯尼亚感染，或是减少至少一症状。“改善”是指减少、抑制、减弱、减小、暂停或是稳定疾病或其症状的发展或进程。“改变”是指由例如本申请所述标准技艺已知的方法侦测到的表现量或是基因或多肽活性的变化(增加或减少)。如本申请所述，改变包含表现量10%变化，较佳为表现量 25%变化，更佳为40%变化，以及最佳为50%或更多的变化。
“类似物”是指不同的分子，但是具有类似功能或结构特征。例如，多肽类似物保留对应自然存在多肽的生物活性，然而具有某些生物化学修饰，相较于自然存在的多肽，更可促进类似物的功能。所述生物化学修饰可增加类似物的蛋白酶抗性、膜穿透性或是半衰期， 而不改变例如与配体(Iigand)的结合。类似物可包含非自然的胺基酸。在本申请中，“包括”(comprises，comprising)、“含有”(containing)以及“具有” (having)可具有美国专利法中所描述的意义，以及可指“包含”(including)与类似词；
(consisting essentically of)(consisting essentially)胃
有美国专利法所描述的意义且此用词是开放式，允许除了所主张内容之外的存在，只要它的基本或是主张的新特征不改变，但排除习知技艺的实施例。“侦测”是指辨识所侦测分析物的存在、不存在或是含量。“疾病”是指任何状态或不适破坏或干扰细胞、组织或器官的正常功能。疾病的例子包含病毒感染，包含但不限于西方、东方与委内瑞拉马脑炎病毒、阿尼昂尼昂 (ο，nyong-nyong virus)、罗其jf河病毒(Ross River virus)与斤文德毕其jf 病毒(Sindbis virus)ο“有效量”是指相较于为治疗的病患，减缓疾病症状所需要的剂量。实施本发明用于预防或治疗疾病的活性化合物有效量视投药方式、个体的年龄、体重与通常健康状况而改变。最后，参加的医师与兽医会决定适当剂量与剂量配方。所述剂量是指“有效”量。本发明提供许多目标用于高专一药物的发展，治疗或预防本申请所述的疾病。除此之外，本发明的方法提供简易的方法辨识安全使用于个体中的治疗。此外，本发明的方法提供高效能、高敏感性与低复杂性，实际分析任何数目的化合物对于本申请所述疾病的效果，“片段”是指多肽或核苷酸分子的一部分。此部分包含较佳为参考核苷酸分子或多肽全长的至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或 90%。。片段可含有 10、20、 30、40、50、60、70、80、90 或 100、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000 个核苷或是胺基酸。“杂交”是指互补核苷碱基之间的氢键，可以是Watson-Crick、Hoogsteen或反 Hogsteen氢键。例如，腺嘌呤与胸腺嘧啶是互补的核苷碱基，它们是经由形成氢键而配对。“分离的多核苷酸”是指核苷酸分子(例如DNA)，它是没有自然存在生物体基因组所得的基因两侧的基因。因此，所述分离的多核苷酸包含例如并入载体中、自动复制质体或病毒中或是原核或真核的基因组DNA中重组的DNA ；或是存在成为个别分子(例如cDNA或是基因组或是PCR或限制酶作用产生的cDNA片段)与其它序列无关。此外，所述分离的多核苷酸包含由DNA转录的RNA分子，以及重组的DNA，它是编码其它多核苷酸序列的融合基因的一部分。“分离的多肽”是指本发明的多肽是从自然伴随的成分中分离的。典型地，当免除至少60%重量与其自然结合的蛋白质与自然存在的有机分子时，所分离而得的所述多肽。 较佳地，所述制备是本发明多肽的重量至少75%，更佳为致使90%，以及更佳为至少99%。 例如，通过从自然来源萃取、通过表现编码所述多肽的重组核酸；或是通过化学合成所述蛋白质，可得到本发明分离的多肽。可使用任何适当的方法，例如管柱层析、聚丙烯酰胺胶体电泳或是HPLC分析，测量纯度。
“标志”(marker)是指与疾病或不适相关且表现量或活性改变的任何蛋白质或多核苷酸。如本申请所述，“得到一剂”中的“得到”包含合成、购买或是取得所述剂。“减少”是指负向改变至少10%、25%、50%、75%或是100%。“参考”是指标准或是控制条件。“参考序列”是被定义的序列，作为序列比较的基础。参考序列可以是特定序列全长的一部分，例如，全长cDNA或基因序列的片段，或全部cDNA或基因序列。关于多肽，参考多肽序列的长度通常至少约16个胺基酸，较佳为至少约20个胺基酸，更佳为至少约25个胺基酸，甚至更佳为约35个胺基酸、约50个胺基酸或约100个胺基酸。关于核苷酸，参考核苷酸序列的长度通常至少约50个核苷酸，较佳为至少约60个核苷酸，更佳为至少约75 个核苷酸，甚至更佳为至少约100个核苷酸，或约300个核苷酸，或任何以上或之间的整数。“专一键结”是指化合物或抗体，辨识与结合本发明的多肽，但不会实质辨识与结合样品中的其它分子，例如生物样品，自然包含本发明的多肽。用于本发明方法中的核苷酸分子包含编码本发明多肽或其片段的任何核苷酸分子。此核苷酸分子不需要与内生(endogenous)核苷酸序列100%相同，但典型具有实质相同性。与内生序列具有“实质相同性”的多核苷酸典型可与双股核苷酸分子的至少一股杂交。用于本发明方法中的核苷酸分子可包含编码本发明多肽或其片段的任何核苷酸分子。此核苷酸分子不需要与内生(endogenous)核苷酸序列100%相同，但典型具有实质相同性。与内生序列具有“实质相同性”的多核苷酸典型可与双股核苷酸分子的至少一股杂交。“杂交”是指在不同严厉条件下，互补多核苷酸序列(例如本申请所述的基因)或是其部分之间配对形成双股分子(参阅Wahl，G.M.与S. L. Berger (1987)发表在Methods Enzymo 1. 152 :399 ；Kimmel，A. R. (1987)发表在 Methods Enzymo 1. 152 :507)。例如，严厉(stringent)盐浓度常低于约750mM NaCl与75mM柠檬酸钠，较佳为低于约500mM NaCl与50mM柠檬酸钠，以及更佳为低于约250mM NaCl与25mM柠檬酸钠。可在没有有机溶剂例如甲醛存在下，得到低严厉杂交，而可在至少约35 %甲醛或更佳至少约 50%甲醛存在下得到高严厉杂交。严厉的温度条件通常包含至少约30°C，较佳为至少约 37°C，以及更佳为约42°C。熟知此技艺的人士可知变化其它参数，例如杂交时间、清洁剂， 例如十二烷基硫酸钠(SDS)，的浓度，以及包含或排除载体DNA。不同程度的严厉是结合需要的不同条件而完成。在较佳实施例中，杂交发生在30°C，750mM NaCl、75mM柠檬酸钠、 SDS、35%甲醛以及1001^/111变质的鲑鱼精子0嫩(％0嫩)。在最佳实施例中，杂交发生在 42°C,250mM NaCl、25mM柠檬酸钠、1 % SDS、50%甲醛以及200 μ g/m ssDNA。这些条件的有用变化对熟知此技艺的人士是明显的。对于大部分的应用，杂交后的清洗步骤也会改变。可由盐浓度与温度定义清洗严厉条件(wash stringent conditions)。如上所述，减少盐浓度或增加温度可增加清洗严厉。例如，清洗步骤的严厉盐浓度较佳是低于约30mM NaCl与3mM柠檬酸钠，以及最佳为低于约15mM NaCl与1. 5mM柠檬酸钠。清洗步骤的严厉温度条件通常包含温度至少约25°C， 更佳为至少约42°C以及甚至更佳为至少约68°C。在一较佳实施例中，清洗步骤发生在 25°C、30mM NaC、3mM柠檬酸钠以及0. 1 % SDS。在一更佳实施例中，清洗步骤发生在42°C、 15mM NaC、l. 5mM柠檬酸钠以及0. 1% SDS0在一更佳实施例中，清洗步骤发生在68°C、15mMNaC、1.5mM柠檬酸钠以及0. SDS。熟知此技艺的人士会明白这些条件的其它变化。杂交技术为熟知此技艺的人士已知的，并且描述在例如Benton与DavisGcience 196 :180， 1977) ；Grunstein 与 Hogness(Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72 :3961,1975) ；Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York,2001)； Berger 与 Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York)；以及 Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York。“实质相同”是指与参考胺基酸序列(例如本申请所描述的任一胺基酸序列)或是核苷酸序列(例如本申请所述的任一核苷酸序列)具有至少约50%相似性的多肽或是核苷酸分子。较佳地，此序列是与用于比较序列的氨基酸程度或核苷酸有至少60%、更佳为 80%或85%，以及更佳为90%、95%或甚至99%相似性。使用序列分析软件(例如 Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison的遗传计算器组的序列分析软件封装、Wis. 53705、BLAST、BESTFIT、GAP或 PILEUP/PRETITB0X程序)测量序列相似性。分配同构型程度制不同取代、删除与/或其它修饰，所述软件符合相同或类似序列。保留取代典型包含以下群组的取代物甘胺酸、丙胺酸、缬胺酸、异白胺酸、白胺酸、天冬胺酸、麸胺酸、天冬酰胺、麸酰胺、丝胺酸、羟丁胺酸、离胺酸、精胺酸、苯丙胺酸以及酪胺酸。在决定相似程度的举例方式中，可使用BLAST程序，可能性分数介在e_3与之间，指示接近相关序列。“结构多蛋白”是指组合胺基酸分子，包括至少两个不同多肽，贡献于病毒壳体或包膜。在一实施例中，所述多肽可切除病毒酵素(例如自动蛋白酶与信息酶)。例如结构多蛋白序列在Genbank存取编号ABX40006. 1，如下所示。MEFIPTQTFYNRRYQPRPWTPRPTIQVIRPRPRPQRQAGQLAQLISAVNKLTMRAVPQQKPRRNRKNKKQKQKQQAPQNNTNQKKQPPKKKPAQKKKKPGRR ERMCMKIEND CIFEVKHEGKVTGYACLVGDKVMKPAHVKGTIDNADLAKLAFKRSSKYDLECAQIPVHMKSDASKFTHEKPEGYYNWHHGAVQYSGGRFTIPTGAGKP⑶SGRPIFDNKGRWAIVLGGANEGARTALSWTWNKDIVTKITPEGAEEffSLAIPVMCLLANTTFPCSQPPCTPCCYE KEPEETLRMLEDNVMRPGYYQLLQASLTCSPHRQRRSTKDNFNVYKATRPYLAHCPDCGEGHSCHSPVALERIRNEA TDGTLKIQVSLQIGIKTDDSHDWTKLRYMDNHMPADAERAGLFVRTSAPCTITGTMGHFILARCPKGETLTVGFTDS RKISHSCTHPFHHDPPVIGREKFHSRPQHGKELPCSTYVQSTAATTEEIEVHMPPDTPDRTLMSQQSGNVKITVNGQ TVRYKCNCGGSNEGLTTTDKVINNCKVDQCHAAVTNHKKWQYNSPLVPRNAEL⑶RKGKIHIPFPLANVTCRVPKAR NPTVTYGKNQVIMLLYPDHPTLLSYRNMGEEPNYQEEWVMHKKEWLTVPTEGLEVTffGNNEPYKYffPQLSTNGTAHG HPHEIILYYYELYPTMTWWSVATFILLSMVGMAAGMCMCARRRCITPYELTPGATVPFLLSLICCIRTAKAATYQEAAIYLWNEQQPLFWLQALIPLAALIVLCNCLRLLPCCCKTLAFLA VMSVGAHTVS AYEHVTVIPNTVGVPYKTLVNRPGYSPMVLEMELLSVTLEPTLSLDYITCEYKTVIPSPYVKCCGTAECKDKNLPDY SCKVFTGVYPFMWGGAYCFCDAENTQLSEAHVEKSESCKTEFASAYRAHTASASAKLRVLYQGNNITVTAYANGDHA VTVKDAKFIVGPMSSAWTPFDNKIVWK⑶VY匪DYPPFGAGRPGQFGDIQSRTPESKDVYANTQLVLQRPAVGTVHV PYSQAPSGFKYWLKERGASLQHTAPFGCQIATNPVRAVNCAVGNMPISIDIPEAAFTRWDAPSLTDMSCEVPACTHS SDFGGVAIIKYAASKKGKCAVHSMTNAV TIREAEIEVEGNSQLQISFSTALASAEFRVQVCSTQVHCAAECHPPKD HIVNYPASHT
TLGVQDI SATAMSffVQK I TGGVGLVVAVAALILIVVLCVSFSRH例如编码上述结构多蛋白的表现载体在Genbank存取编号为EU224268 (图24)。第二例子，结构蛋白序列在Genbank存取编号为ABX40011. 1”，如下所示。MEFIPTQTFYNRRYQPRPWAPRPTIQVIRPRPRPQRQAGQLAQLISAVNKLTMRAVPQQKPRRNRKNKKQRQKKQAPQNDPKQKKQPPQKKPAQKKKKPGRR ERMCMKIEND CIFEVKHEGKVMGYACLVGDKVMKPAHVKGTIDNADLAKLAFKRSSKYDLECAQIPVHMKSDASKFTHEKPEGYYNW HHGAVQYSGGRFTIPTGAGKP⑶SGRPIFDNKGRWAIVLGGANEGARTALSWTWNKDIVTKITPEGAEEWSLALPVL CLLANTTFPCSQPPCTPCCYEKEPESTLRMLEDNVMRPGYYQLLKASLTCSPHRQRRSTKDNFNVYKATRPYLAHCP DCGEGHSCHSPIALERIRNEATDGTLKIQVSLQIGIKTDDSHDWTKLRYMDSHTPADAERAGLLVRTSAPCTITGTM GHFILARCPKGETLTVGFTDSRKISHTCTHPFHHEPPVIGRERFHSRPQHGKELPCSTYVQSTAATAEEIEVHMPPD TPDRTLMTQQSGNVKITVNGQTVRYKCNCGGSNEGLTTTDKVINNCKIDQCHAAVTNHKNWQYNSPLVPRNAEL⑶RKGKIHIPFPLAIWTCRVPKARNPTVTYGKNQVTMLLYPDHPTLLSYRN MGQEPNYHEE WVTHKKEVTLTVPTEGLEVTWGNNEPYKYffPQMSTNGTAHGHPHEIILYYYELYPTMTfflVSVASFVLLSMVGTAVG MCVCARRRCITPYELTPGATVPFLLSLLCCVRTTKAATYYEAAAYLWNEQQPLFWLQALIPLAALIVLCNCLKLLPC CCKTLAFLAVMSIGAHTVSAYEHVTVIPNTVGVPYKTLVNRPGYSPMVLEMELQSVTLEPTLSLDYITCEYKTVIPS PYVKCCGTAECKDKSLPDYSCKVFTGVYPFMWGGAYCFCDAENTQLSEAHVEKSESCKTEFASAYRAHTASASAKLR VLYQGNNITVAAYAN⑶HAVTVKDAKFWGPMSSAWTPFDNKIWYK⑶VYNMDYPPFGAGRPGQFGDIQSRTPESKDV YANTQLVLQRPAAGTVHVPYSQAPSGFKYWLKERGASLQHTAPFGCQIATNPVRAVNCAVGNIPISIDIPDAAFTRW DAPSVTDMSCEVPACTHSSDFG6VAIIKYTASKKGKCAVHSMTNAVTIREADVEVEGNSQLQISFSTALASAEFRVQ VCSTQVHCAAACHPPKDHIVNYPASHTTLGVQDISTTAMSWVQKITGGVGLIVAVAALILIVVLCVSFSRH“个体”是指哺乳动物，包含但不限于人类或非人类哺乳动物，例如牛、马、犬或猫。本申请所提供的范围是范围内所有值的速记。例如1至50的范围是包含1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 组成群处中的任何数目、数目的组合或是次范围。如本申请所述，“治疗”是指减少或减缓不适与/或相关症状。应理解虽然不排除， 但治疗不适或状况并不需要所述不适、状态或相关症状完全消除。“疫苗”是指包含本发明VLP或DNA或其它基因为基础的疫苗载体，它的形式是可被给予至脊椎动物，以及诱导保护性免疫反应，足以诱导免疫性预防与/或减缓感染与/或减少感染的至少一症状，以及/或促进VLP或DNA疫苗其它剂量的有效性。典型地，所述疫苗包括习知的盐类或缓冲液容易培养液，本发明的组合物悬浮或溶解于其中。在此形式中，本发明的组合物可方便使用于预防、简焕或治疗感染。在导入宿主之后，所述疫苗可诱导免疫反应，包含但不限于产生抗体与/或细胞激素与/或活化细胞毒性T细胞、抗原表现细胞、助手T细胞、星状细胞以及/或其它细胞反应。在一些实施例中，疫苗也可以是蛋白质。例如，由遗传工程细胞产生一或多个外来基因所产生的重组蛋白，而后产生作为免疫原的蛋白质。如本申请所述，“类病毒颗粒”(VLP)是指结构至少贡献组成病毒但已知不具有感染性。根据本发明，类病毒颗粒不带有类病毒颗粒不带有编码类病毒颗粒的蛋白质的遗传信息。通常，类病毒颗粒缺少病毒基因组，因此不具感染性。此外，通常可通过异质表现而大量产生且容易纯化类病毒颗粒。除非特别声明或是由内容明显可知，如本申请所述，“或”是包含在其中的意思。除非特别声明或是由内容明显可知，如本申请所述，“一”与“所述”是单一或复数的意思。除非特别声明或是由内容明显可知，如本申请所述，“约”是技艺中正常容忍范围内的意思，例如平均值的两个标准偏差内。约可理解为所述值的lO^j^^S^j^j^、 5%,4%,3%,2%U%>0. 5%,0. 1%、0. 05%或0. 01%之内。除非申请内容中清楚表明，否则所有数值皆由约这个字修饰。本申请任何定义中的化学官能基列示主张包含任何单一官能基或所列官能基组合的变化定义。本申请变化的实施例包含任何单一实施例或是任何其它实施例或其部分的组合。本申请的任何组合物或方法可与本申请的一或多个任何其它组合物与方法结合。


图IA至ID说明CHIKV E假型慢病毒在体的特征。图1概示说明CHIKV基因组， 以及CHIKV E表现载体用于将37997与LR2006 OPY-I株CHIKV E并入假型慢病毒载体。 CHIKV基因组包含非结构多蛋白NS1、NS2、NS3与NS4以及结构多蛋白壳体(C)与包膜(E E3、E2、6K与El)(顶部)。来自37997与LR20060PY-1株的多肽E基因被插入表现载体(底部)。图IB包含两图。左图说明所指假型慢病毒载体在几个CHIKV允许的细胞株中的感染性，所述细胞株包含人类肾表皮细胞、HeLa子宫颈表皮细胞、Vero肾表皮细胞、A549 鳞状表皮细胞以及婴儿仓鼠肾(BHK)细胞。假型载体由HIV-IGag p24(左)或是pM所指浓度标准化，以及用于感染细胞(右)。在与假型载体培养M小时之后，溶解细胞并且测量荧光酵素(Iuciferase)活性。实验进行三重复。图IC包含两图，说明CHIKV假型慢病毒载体PH依附性的进入。在所指示的氯化铵(左)与氯喹(chloroquine)(右)浓度存在中培养假型慢病毒载体。实验进行三重复。数据的呈现是相较于没有处理的活性，在所指剂量的活性百分比。图ID说明以注射CHIKV(S-27株)老鼠血清中的假型慢病毒载体测量的中和作用。以所指稀释倍数将血清与VSV-G、CHIKV 37997或R2003 0PY-1E假型慢病毒载体及感染四3々细胞的混合物培养。感染M小时之后，分析荧光酵素活性。实验进行三重复。观察得知控制组无免疫抗血清没有抑制作用。图2A制图2C说明质体表现载体与CHIKV VLP的特征。图2A提供说明用于DNA疫苗与VLP生产的CHIKV C-E或E表现载体。来自37997与LR2006 0PY-1株的CHIKV结构多蛋白壳体加包膜(C-E)或是单独E被插入表现载体。将所指的各个质体转染四31~细胞。 转染M小时之后，用西方转印以先前描述的09)用与CHIKV的抗血清反应测量表现。图 2B包含图标、西方转印与电子显微图。从转软C-E表现载体(^37997)(左)细胞的上清液纯化VLP。在转染72小时之后，收取上清液，而后Optift^p密度梯度离心。依浮力密度(左上)划分每一部分，以及藉由用CHIKV的抗血清西方转印分析定性每一部分的蛋白量(左下)。通过穿透式电子显微镜20，OOOx (左，IOOnm)(右)倍率观察每一部分的VLP。 图2C提供比较CHIKV VLP的cryo-EM重组与辛德毕病毒(Sindbis virus)，说明CHIKV VLP 结构类似亚法病毒。CHIKV VLP (左上部)与辛德毕病毒(右上部)的3D密度图沿着二十面体的二重对称轴的阴影表面呈现。白色三角形标示二十面体不对称单元的边界。数字表示二十面体二重、三重与五重轴限制不对称单元的位置。中心横切面通过CHIKV VLP (左下部)与辛德毕病毒(右下部)的cryo-EM图。二十面体(二重、三重与五重)轴与类三重 (q3)轴的位向以白线显示。图计算为1.8A分辨率。图3A-3D说明在老鼠与猴子中DNA或VPL疫苗作用之后CHIKV 37997与LR2006 0PY-1细胞株的中和作用。以最终免疫作用后10天的免疫老鼠的血清测试CHIKV细胞株 37997 (图3A)或是LR2006 OPY-1 (图E假型慢病毒载体。用所指的DNA或VLP37997免疫老鼠。在0、3与6周注射每一个C-E或是E(细胞株37997与LR2006 OPY-1)质体。在第2与6周注射含与不含Ribi佐剂的VLP37997。实验进行三重复。符号显示五只老鼠的平均，横杠显示平均的标准偏差。用Prism软件计算曲线符合。图3C说明在第0、4与对周VLP37997或PBS (控制组)免疫猴子的结果。在免疫之后10天，在收集免疫猴子的血清中进行中和作用分析CHIKV细胞株37997 (左)或LR2006 0PY-1 (右)E假型慢病毒载体。 符号显示六只猴子的平均，横杠显示平均的标准偏差。图3D说明标准蚀斑减数中和试验 (PRNT)确认第二次与第三次免疫作用之后，在免疫的猴子血清中对CHIKV LR2006 0PY-1的中和活性。符号显示六只猴子的平均，横杠显示平均的标准偏差。图4A至图4D说明在被动转换纯化的IgG之后，在VLP免疫的猴子与CHIKV老鼠模式中，保护对抗CHIKV LR2006 0PY-1挑战。图4A定量猴子注射PBS(控制组)或用 VLP37997免疫得到的结果。在最终刺激后15周，用IOiqPFU的CHIKV细胞株LR2006 0PY-1 挑战猴子。在挑战后M小时，用蚀斑分析测量顶峰病毒血症(peak viremia)。血清稀释从 1 200(侦测限制=1000PFU/ml)开始。误差横杠代表平均值的标准偏差。图4B说明猴子白血球中的单核细胞比例。在用CHIKV挑战之前与7天之后，使用血液分析器测量单核细胞比例。使用非参数两t-测试进行统计分析(在第7天，控制组vs. VLP, ρ = 0. 0036 ；第 0天控制组vs.第7天控制组，p = 0. 0015 ；第0天VLP vs.第7天VLP，P > 0. 5)。图4C 说明在被动转换从VLP免疫猴子(免疫)或是控制组猴子(控制组IgG)的纯化IgG至老鼠(每只老鼠2!^的总186，每组11 = 5)之后，存在的病毒RNA复制数。在IgG转换之后M 小时，受体老鼠皮下注射致命的LR2006 0PY-1挑战(30PFU)。在挑战之后，用定性RT-PCR 测量老鼠的病毒血症(侦测限制=40RNA复制数/ml)。误差横杠代表平均值的标准偏差。 图4D说明用控制组IgG或是CHIKV免疫的IgG被动转换的老鼠对抗致命LR2006 0PY-1挑战的存活曲线。图5说明浮力密度沉降与西方转印分析的CHIKV E假型慢病毒在体的特性。编码所指CHIKV Env细胞株的植体与慢病毒表现载体共同转染制四31~细胞。转染48小时之后， 收取上清液进行上述的沉降梯度。以所指的细胞株显示梯度部分的定量，显示Env与慢病毒颗粒(1.08-1. lg/ml)预期的浮力密度有共同落点(上部)。显示CHIKV E1/E2与Gag梯度部分的西方转印分析(下部)。图 6 说明 CMV/R-CHIKV C-E3-E2-6K-E1 质体(细胞株 37997)。图7A说明插入的序列(SEQ ID NO :1)。图7B说明整个质体序列(SEQ ID NO 2)。图8A显示CMV/R-CHIKV C-E3-E2-6K-E1质体(细胞株0PY1)。图8B显示插入序列(SEQ ID NO 3)。图8C显示整个质体序列(SEQ ID NO 4)。图9A显示CMV/R-Middleburg病毒VLP质体。图9B显示整个质体序列(SEQ ID NO 5)。
图IOA显示CMV/R-睡眠症病毒VLP质体。图IOB显示整个质体序列(SEQ ID NO 6)。图11 (A与B) A显示CMV/R-Getah病毒VLP质体，B显示整个质体序列(SEQ ID NO 7)。图12A显示CMV/R-委内瑞拉马脑炎病毒VLP质体。图12B显示整个质体序列(SEQ ID NO 8)。图13A显示CMV/R-西方马脑炎病毒VLP质体。图1 显示整个质体序列(SEQ ID NO 9)。图14A显示CMV/R-东方马脑炎病毒VLP质体。图14B显示整个质体序列(SEQ ID NO 10)。图15A显示CMV/R-辛德毕病毒VLP质体。图15B显示整个质体序列(SEQ ID NO 11)。图16A显示CMV/R-西门利克森林病毒VLP质体。图16B显示整个质体序列(SEQ ID NO 12)。图17A显示CMV/R-鲑鱼胰脏病病毒VLP质体。图17B显示整个质体序列(SEQ ID NO 13)。图18A显示CMV/R-罗斯河病毒VLP质体。图18B显示整个质体序列(SEQ ID NO 14)。图19A显示CMV/R-阿尼昂尼昂病毒VLP质体。图19B显示整个质体序列(SEQ ID NO 15)。图20A显示CMV/R-马亚罗病毒VLP质体。图20B显示整个质体序列(SEQ ID NO 16)。图21A显示CMV/R-巴马森林病毒VLP质体。图21B显示整个质体序列(SEQ ID NO 17)。图22A显示CMV/R-奥拉病毒VLP质体。图22B显示整个质体序列(SEQ ID NO 18)。图23A显示CMV/R-CHIKV E3-E2-6K-E1质体(细胞株37997)以及没有壳体(C) 的插入序列(SEQ ID NO: 19)。图 23B 显示 CMV/R-CHIKV E3-E2-6K-E1 质体(细胞株 0PY1) 以及没有壳体(C)的插入序列(SEQ ID NO 20)。图M显示Genbank存取编号EU224268序列，它是转殖载体pCHIKV-LR ic完整序列。参阅 Tsetsarkin, K. , Higgs, S. , McGee, C. Ε. , De Lamballerie, X. , Charrel, R. N 与 Vanlandingham, D. L.载体补偿研究基孔肯尼亚病毒的感染转殖，Vector Borne Zoonotic Dis. 6(4) ,325-337(2006)。图M显示Genbank存取编号EU224270序列，它是转殖载体pCHIKV-37997ic完整序列。
具体实施例方式从2004年在肯尼亚再次出现起，在非洲、欧洲与亚州，基孔肯尼亚病毒(CHIKV) 已经感染数百万人。在没有疫苗或是抗病毒治疗之下，病毒的演化与散布进入新的地理区域，以及疾病严重性成为严重的公共务生问题。本发明提供组合物与方法用于诱导保护免疫性。本发明至少部分基于发现在非人类灵长类中重组类病毒颗粒(VLP)疫苗保护对抗CHIKV感染。通过表现病毒结构蛋白来产生VLP。这些与复制补偿病毒 (replication-competent virus)具有类似的浮力密度与外型。以VLP免疫作用引起中和抗体对抗同质与异质外膜。用VLP免疫的猴子产生高量的交叉反应中和抗体，保护对抗高剂量表皮CHIKV挑战。再者，从免疫猴子被动转换这些抗体产生对抗免疫缺陷老鼠中致命的CHIKV挑战，说明保护是由体液免疫反应媒介。以VLP疫苗免疫作用是策略，防止对人类感染与传播CHIKV以及相关的致病病毒。因此，本发明提供免疫原组合物包含一或多亚法病毒(例如基孔肯尼亚病毒)结构多肽。特别地，所述免疫原组合物(例如疫苗)包含包膜或壳体多肽，足以形成类病毒颗粒。本发明更提供编码亚法病毒(基孔肯尼亚)结构多肽的核苷酸分子、包括这些编码序列的表现载体以及使用这些核苷酸分子用于制备类病毒颗粒的方法。在其它实施例中，本发明提供DNA疫苗，用于在个体的细胞中表现一或多个病毒多肽。免疫原组合物本发明提供用于在个体中，特别是在人类，诱导免疫反应的组合物与方法，涉及所述个体预防接种包括一或多病毒或CHIKV多肽的VLP或其片段，是在合适载体中用于诱导或增进免疫反应。在一实施例中，免疫反应保护个体免于CHIKV感染或是其发炎结果(例如关节炎)。给予此免疫原组合物可治疗已受CHIVK感染的个体或是用于预防CHIKV感染。 在一些实施例中，比较西非的37997与东/中/南非的最新0PY-1两种不同细胞株基因产物的免疫原性，用来发展CHIKV候选疫苗。这些细胞株分享95%胺基酸序列相似性，但具有不同的生物差异性，特别是关于它们的宿主范围。本发明的VLP可用于制备疫苗与免疫原组合物。VLP的一重要特征是比现表面蛋白的能力，因而脊椎动物的免疫系统包含对抗所述蛋白质的免疫反应。然而，并不是所有蛋白质都可以表现在VLP的表面。某些蛋白质不表现或在VLP表面上表现差有许多原因。一个原因是所述蛋白质未到达宿主细胞的细胞膜或是所述蛋白质没有穿膜区域。对熟知此技艺的人士而言，免疫原组合物与疫苗的制备是已知的。所述疫苗包含 VLP,所述VLP包括一或多CHIKV多肽或其片段。本发明亦提供编码一或多CHIKV多肽或其片段或其变异的表现载体。所述免疫原组合物在细胞内传送，用以诱导或促进个体中的免疫反应，例如体液反应。例如，在体内传送包括一或多CHIKV多肽或其片段的VLP，用来诱导免疫反应。疫苗典型制备为可注射型式，液体溶液或是悬浮液。也可制备适合注射的固体型式，例如乳状液或是脂肪体包覆的多肽。疫苗抗原通常结合医药可接受的载体，可以是任何载体只要不会诱导产生抗体伤害接收所述载体的个体。适合的载体典型包括代谢缓慢的巨分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚甘醇酸、聚胺基酸、胺基酸共聚物、脂肪凝聚物以及非活性病毒颗粒。所述载体是熟知此技艺的人士已知的。所述载体也可作为佐剂。包括一或多CHIKV多肽或其片段或变异的VLP可与佐剂(例如Ribi) —起被给予。 佐剂是促进疫苗效果的免疫刺激剂。视需要，包括一或多CHIKV多肽或其片段或变异的VLP 可与佐剂一起被给予，所述佐剂促进免疫反应对抗目标抗原。有效的佐剂包含但不限于铝盐，例如氢氧化铝与磷酸铝、胞壁酰肽(muramyl peptides)、细菌细胞壁成分、皂素佐剂，以及其它做为免疫刺激剂促进组合物有效性的物质。免疫原组合物，亦即包括一或多CHIKV多肽的VLP，医药可接受的载体与佐剂典型也包含稀释剂，例如水、盐水、甘油、乙醇。也可以有辅助物质，例如湿润或乳化剂、PH缓冲物质等。蛋白质可配方在疫苗中成为中性或盐形式。免疫原组合物典型为腹腔注射给予， 例如皮下注射或肌肉注射。其它配方适合用于其它形式的给予，例如栓剂或口服。口服组合物可投予成为溶液、悬浮液、锭剂、药丸、胶囊或是缓释剂型。免疫原组合物给予方式与剂量剂型兼容。免疫原组合物包括免疫有效量的VLP以及其它上述成分。免疫有效量是指单一剂量，或是多剂量排程给予的组合物，有效治疗或预防感染。投药剂量随治疗个体、个体健康与生理状况、个体免疫系统产生抗体的能力、所要的保护程度以及相关参数而改变。需要的活性成分精确量取决于从业人员的判断，但每一剂量通常是在5微克至250微克之间的抗原。本发明提供VLP，用于治疗或预防亚法病毒感染(例如基孔肯尼亚感染)。多肽表现通常，用合适表现在体中全部或部分编码多派的核苷酸分子或其片段，转型宿主细胞，产生包括一或多本发明CHIKV多肽的VLP。熟知分子生物领域的人士会了解用于提供重组蛋白质的任一个表现系统。所使用的确切宿主细胞并不是本发明的关键。可在原核宿主Gf^BE. coli)或真核宿主(例如酿酒酵母、昆虫细胞，例如Sf21细胞或哺乳动物细胞，例如NIH 3T3、HeLa, COS细胞)产生本发明的多肽。这些细胞可取自许多来源范围(例如美国形式培养收集，Rockland，Md.参阅例如Ausubel et al.，supra)。昆虫细胞不限为秋年虫(Sf)细胞，例如Sf9、Sf21、粉斑夜蛾，例如高五细胞与果蝇S2细胞。真菌(包含酵母菌)宿主细胞例如酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母(K lactis)、念珠菌物种包含白色念珠菌与光滑假丝酵母、小巢状曲菌、粟酒裂殖酵母(S. pombe)、毕赤酵母以及耶罗威亚酵母。哺乳动物细胞例如COS细胞、婴儿仓鼠肾细胞、 老鼠L细胞、LNCaP细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人类胚胎肾(HEK)细胞、非洲绿猴细胞、 CVl细胞、HeLa细胞、MDCK细胞、Vero与Hep_2细胞。也可使用非洲爪蟾卵母细胞或是两栖动物的其它细胞。原核宿主细胞包含细菌细胞，例如E. coli, B. subtilis与分枝杆菌。转殖(cloning)所述蛋白质的方法是此技艺已知的。例如，从已被所述病毒感染的细胞萃取的多腺嘌呤(polyadenylayted)mRNA，用RT-PCR分离编码特定CHIKV或任何亚法病毒蛋白的基因。所得的产物基因可被转殖成为DNA插入载体。“载体”是指可以在生物体、细胞或细胞成分之间增殖与/或转换的核苷酸。载体包含质体、病毒、噬菌体、前病毒、噬菌质体、转位子(transposon)、人工染色体等，可自行复制或是可以并入宿主细胞的染色体。载体也可以是不会自行复制的裸露的RNA多核苷酸、裸露的DNA多核苷酸、在同一股中由DNA与RNA组成的多核苷酸、多离胺酸结合的DNA或RNA、多肽结合的DNA或RNA、 脂肪体结合的DNA等。通常但并非全部的实施例中，本发明的载体是质体或杆状病毒质粒 (bacmid) 0本发明更提供核苷酸，所述核苷酸是编码包含嵌合分子的蛋白质，转殖至表现载体中，在细胞中表现用于形成VLP。“表现载体”是一载体，例如质体，可促进比现与合并在内的核苷酸的复制。典型地，要表现的所述核苷酸分子是“操作连结”至与启动子/或促进子，由所述启动子与/促进子进行转录调节控制。在一实施例中，所述VLP包括一或多亚法病毒包膜蛋白，特别是CHIKV病毒包膜蛋白。在另一实施例中，所述一或多包膜蛋白是E3、 E2、6K与El中任一个或多个。在另一实施例中，所述VLP更包括CHIKV病毒壳体蛋白。在相关实施例中，使用所述基孔肯尼亚病毒壳体蛋白。在另一实施例，所述VLP包括壳体、E3、 E2、6K与E1。在另一实施例，所述表现载体是哺乳动物表现载体或是杆状病毒载体。转型或转染的方法以及表现载体的选择取决于所选的宿主系统。转型与转染方法描述在例如Ausubel等人(supra)；表现载体可从中选择，例如转殖载体实验室手册 (P. H. Pouwels et al.，1985 supp. 1987)。许多表现系统用于产生本发明的多肽。可用于产生所述多肽的表现载体包含但不限于染色体、游离基因(episome)与得自病毒的载体，例如得自于细菌质体、噬菌体、转位子、酵母菌游离基因、插入元素、酵母菌染色体元素、例如杆状病毒、乳突多瘤病毒(papova virus)例如SV40、痘苗病毒、腺病毒、鸡痘病毒、伪狂犬病毒与反转录病毒的载体以及来自其组合的载体。本申请所提供的建构与/或载体包括CHIKV多核苷酸，编码结构多肽，包含包膜蛋白或是壳体蛋白或是其部分。所述载体可以是例如噬菌体、质体、病毒或反转录病毒。包括多核苷酸的所述建构与/或载体应运作连结至适当的启动子，例如但不限于CMV启动子、噬菌体浪达(Iambda)PL启动子、E. coli lac、phoA与tac启动子、SV40早与晚启动子以及反转录病毒LTR启动子。熟知此技艺的人士知道其它合适的启动子取决于所要的宿主细胞与 /或表现速度。表现建构更包含转录区域中的转录起始、终止位置以及转译的核醣体结合位置。建构所表现的转录编码部分较佳包含所要转译的多肽的开始处的起始编码子以及结束处的终止编码子。表现载体较佳包含至少一可选择的标示(marker)。所述标示包含用于真核细胞的二氢叶酸还原酶抑制剂、G418或新霉素抗性以及用于培养E. coli与其它细菌的四环霉素、卡那霉素或青霉素抗性基因。这些载体中较佳为病毒在体，例如杆状病毒、痘病毒(例如痘苗病毒、鸡痘病毒、金丝雀痘病毒、鸡痘病毒、浣熊痘病毒、猪痘病毒等)、腺病毒(例如犬腺病毒)、泡疹病毒以及反转录病毒。可用于本发明的其它载体包括用于细菌的载体，包括 pQE70、pQE60 以及 pQE_9、pBluescript 载体、Phagescript 载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、 pNH46A、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。真核载体较佳为 pFastBacl、pWINEO、 pSV2CAT、p0G44、pXTl以及pSG、pSVK3、pBPV、pMSG与pSVL。熟知此技艺的人士会明白其它适合的载体。重组架构可被制备并且用于在真核细胞与/或原核细胞，转染、感染或是转型，以及可以表现病毒蛋白，包含本申请所述的病毒蛋白。因此，本发明提供宿主细胞，包括载体， 含有编码CHIKV结构基因的核苷酸，包含壳体、E3、E2、6K与El或其部分，以及/或上述任何嵌合分子，并且允许CHIKV结构基因的表现，包含壳体、E3、E2、6K与El或其部分，以及/ 或上述任何嵌合分子在所述宿主细胞中与可形成VLP的条件。在一实施例中，所述载体是重组的杆状病毒。在另一实施例中，所述重组的杆状病毒转染至昆虫细胞中。在较佳实施例中，所述细胞是昆虫细胞。在另一实施例中，所述昆虫细胞是Sf9细胞。在另一实施例中，所述载体与/或宿主细胞包括核苷酸，编码CHIKV基因，包含壳体、E3、E2、6K与El或是上述其部分。在另一实施例中，所述载体与/或宿主细胞主要包含CHIKV壳体、E3、E2、6K与El或上述其部分。在另一实施例中，所述载体与/或宿主细胞包含CHIKV蛋白质，包括壳体、E3、E2、6K与El或上述其部分。如本申请所述，这些载体与/ 或宿主细胞包含CHIKV核心E3、E2、6K与El或其部分，以及可包含其它细胞组成，例如细胞蛋白、杆状病毒蛋白、脂质、醣类等。用于多肽产生的一特定细菌表现系统是E. Coli pET表现系统(Novagen，Inc.， Madison, Wis) 0根据此表现系统，编码多肽的DNA以一能表现的位向插入pET载体中。由于编码所述多肽的基因是在T7调节信号控制下，所以通过诱导宿主细胞中T7RNA聚合酶的表现来达到多肽的表现。典型是使用响应IPTG诱导表现T7RNA聚合酶的宿主细胞株来达到。一旦产生之后，根据此记忆中已知的标准方法，例如本申请所述的方法，分离重组多肽。用于多肽产生的另一细菌表现系统是pGEX表现系统(Pharmacia)。此系统使用 GST基因融合系统，用于高量表现基因或基因片段成为融合蛋白，可快速纯化与回收功能性的基因产物。目标蛋白质融合至日本血吸虫(Schistosoma japonic·)的麸胺基硫转移酵素的羟基端，以及可使用麸胺基琼脂糖凝胶4B的亲和性层析，从细菌溶融液中纯化。可在温和条件以麸胺基冲提来回收融和蛋白质。在麸胺基硫转移酵素区域上游位置专一性的蛋白酶辨认位置存在，促使从融合蛋白质切除麸胺基硫转移酵素区域。例如，在PGEX-2T中表现的蛋白质可用凝血酶(thrombin)切除；在pGEX_3X中表现的蛋白质可用因子fe切除。一旦表现本发明的重组多肽，分离所述重组多肽，例如使用亲和性层析。在一范例中，对抗本发明多肽的抗体(如本申请所描述产生的)可接合在管柱，用以分离重组多肽。 在亲和性层析之前，可用标准方法(例如Ausubel等人，supra)进行具有多肽细胞的溶融与划分。分离之后，如有需要，可进一步分离所述重组蛋白质，例如用高效能脂质层析(参阅例如Fisher，生化与分子生物中的实验室技术，Work与Burdon，Elservier，1980)。也可用化学合成产生本发明的多肽，特别是短多肽片段(例如用固相胜肽合成，第二版，1984， The Pierce Chemical Co.，Rockford，III)。这些一般的多肽表现技术与纯化也可用于产生以及分离有用的胜肽片段或类似物(如本申请所述)。CHIKV多肽与类似物本发明提供包括一或多CHIKV多肽的VLP。本发明也包含包括一或多CHIKV多肽或其片段的的VLP，由许多方式修饰或是不抑制调整免疫反应的功能。在一实施例中，本发明提供通过产生改变来优化CHIKV胺基酸序列或核苷酸序列的方法。所述改变可包含一些突变、删除、插入或是转译后修饰。本发明更包含任何本发明自然存在多肽的类似物。类似物可与本发明自然存在的多肽胺基酸序列不同、转译后修饰不同或是二者皆不同。本发明的类似物与本发明自然存在的胺基酸序列通常具有至少85%、较佳为90%以及更佳为 95%或甚至99%相似性。序列比较的长度至少10、13、15个胺基酸，较佳为至少25个胺基酸，及更佳为超过35个胺基酸。亚法病毒或CHIKV多肽的改变包含但不限于位置直接或随机突变、同质重组(DNA 改组)、使用含有模板尿嘧啶的突变、寡核苷酸突变、硫代寡核苷酸修饰的DNA突变、使用间隔的双DNA的突变等。其它适合的方法包含点错配修补、使用修复缺陷宿主细胞株的突变、 限制-选择与限制-纯化、删除突变、总基因合成突变、双股锻炼修补等。本发明中，突变也包含例如涉及嵌合架构。在一实施例中，自然存在的、改变的分子信息，或是突变的自然存在分子的信息，例如序列、序列比较、生理性质、结晶结构等可领导突变，。在一实施例中，本发明提供多肽变异，它不同于参考多肽。相较于参考序列，“变异”是指胺基酸序列改变一或多个胺基酸。所述变异可具有“保留的”(conservative)改变，其中取代的氨基酸具有类似的结构化或化学性质，例如用异白胺酸取代白胺酸。或者， 变异可具有“非保留的”(nonconservative)改变，例如用色胺酸取代甘胺酸。类似的较小变异也可包含胺基酸删除或插入，或二者都有。使用此技艺已知的计算器程序，可发现决定那些胺基酸可被取代、插入或删除而不会破坏生物或免疫活性的指南，例如DNASTAR软件。 较佳为变异显示实质的生物活性。在一实施例中，蛋白质变异形成VLP以及给予至个体时， 具有抗体反应。蛋白质中的突变可发生自然变异。在感染剂的个别群组内，例如CHIKV，这些突变可造成抗原变异性。因此，感染特定菌株的人发展抗体对抗病毒，当较新的病毒株出现，对抗较老菌株的的抗体不再辨识较新的病毒，以及可发生再次感染。本发明包括来自感染剂的蛋白质的所有的抗原性与遗传变异，用于制造VLP。再次，在决定相似性程度的示范方法中，可使用BLAST软件，或然率在e_3与e—· 之间指示接近相关的序列。修饰包含体内与体外多肽的化学衍生作用，例如乙酰化、羟基化、磷酸化或醣基化；所述修饰可发生在多肽合成过程或是处理过程或是在以分离的修饰酵素处理之后。类似物也可以通过在初级序列改变而不同于本发明自然存在的多肽。这些包含遗传变异，自然的与诱导的(例如得自于辐射或暴露在硫酸乙基甲基酯随机突变或是位置专一性突变，如SambrooKFritsh与Maniatis，分子转殖实验室手册(第二版)，CSH ft~ess，1989，或Ausubel等人，supra)。也包含环化的胜肽、分子与类似物，包含除了 L-胺基酸之外的基，例如D-胺基酸或非自然存在或合成的胺基酸，例如贝塔或加码胺基酸。除了全长多肽之外，本发明也包含本发明任一多肽的的片段。如本申请所述，“片段”是指至少5、10、13或15。在其它实施例中，片段是至少20个连续的胺基酸、至少30个连续的胺基酸或至少50个连续的胺基酸，以及在其它实施例中，至少60至80个或更多个连续胺基酸。本发明的片段可由熟知此技艺的人士已知的方法产生，或是来自于正常的蛋白质程序(例如从初期不需要生物活性的多肽移除胺基酸或是改变mRNA切除来改变胺基酸或是其它的蛋白质处理作用)。根据本发明的方法，可给予具有化学结构设计仿真CHIKV VLP或一或多个CHIKV 多肽功能活性的非蛋白质类似物。CHIKV类似物可超过自然CHIKV的生理活性。类似物设计的方法是此技艺已知的，以及可根据所述方法，通过修饰化学结构进行类似物的合成，因而所得的类似物具有自然CHIKV多肽的免疫调节活性。这些化学修饰包含但不限于在自然的CHIKV分子的特定碳原子处取代其它R基，以及变化饱和程度。较佳地，所述类似物对于体内降解较有抗性，造成给予后较长的治疗效果。量测功能活性的分析包含但不限于以下范例所描述的内容。CHIKV 多月太通常，本发明包含任何核苷酸序列，编码包括一或多个CHIKV多肽或其片段的 VLP，其中所述片段诱导免疫反应。可通过此技艺已知的重组DNA技术，操作分离的核苷酸分子。因此，载体中的核苷酸序列被认为是分离的，其中5’与3’限制处为已知，或是聚合酶链反应(PCR)引子序列已被揭露，但是以自然状态存在的核苷酸序列则认为不是分离的。在一些范例中，所述载体包括基孔肯尼亚37997或基孔肯尼亚0PY-1核苷酸段，或其片段。 所述载体更包括CMV/R启动子。所述载体也包括壳体蛋白或其片段。在其它实施例中，所述载体包括包膜蛋白，选自于E3、E2、6K与El组成的群组。在一些范例中，疫苗可包括壳体、E3、E2、6K与E1。在其它范例中，疫苗可包括E3、E2、6K与El。根据本发明的一些较佳实施例，C-Env37997是 SEQ ID NO 1 ；Env37997 是 SEQ ID NO: 19 ；C-Env0PH 是 SEQID NO 3 ；Envop^1 是 SEQ ID NO :20。以下所示是对应于所述CMV/R-CHIKV C-E3-E2-6K-E1质体(37997)的壳体(SEQ ID NO 21)以及E3、E2、6K与E1(SEQ ID NO 19)的核苷酸序列。例如，所述CMV/R表现载体描述在美国专利号7，094，598中，所述专利全部内容并入本申请中。E3-E2-6K-E1SEQ ID NO 19Atgagcctcgccctcccggtcttgtgcctgttggcaaacactacattcccctgctctcagccgccttgc acaccctgctgctacgaaaaggaaccggaaagcaccttgcgcatgcttgaggacaacgtgatgagacccggatactaccagctactaaaagcatcgc tgacttgctctccccaccgccaaagacgcagtactaaggacaattttaatgtctataaagccacaagaccatatctagctcattgtcctgactgcg gagaagggcattcgtgccacagccctatcgcattggagcgcatcagaaatgaagcaacggacggaacgctgaaaatccaggtctctttgcagatcggg ataaagacagatgacagccacgattggaccaagctgcgctatatggatagccatacgccagcggacgcggagcgagccggattgcttgtaaggac ttcagcaccgtgcacgatcaccgggaccatgggacactttattctcgcccgatgcccgaaaggagagacgctgacagtgggatttacggacagc agaaagatcagccacacatgcacacacccgttccatcatgaaccacctgtgataggtagggagaggttccactctcgaccacaacatggtaaaga gttaccttgcagcacgtacgtgcagagcaccgctgccactgctgaggagatagaggtgcatatgcccccagatactcctgaccgcacgctgatgac gcagcagtctggcaacgtgaagatcacagttaatgggcagacggtgcggtacaagtgcaactgcggtggctcaaacgagggactgacaaccacag acaaagtgatcaataactgcaaaattgatcagtgccatgctgcagtcactaatcacaagaattggcaatacaactcccctttagtcccgcgcaac gctgaactcggggaccgtaaaggaaagatccacatcccattcccattggcaaacgtgacttgcagagtgccaaaagcaagaaaccctacagtaact tacggaaaaaaccaagtcaccatgctgctgtatcctgaccatccgacactcttgtcttaccgtaacatgggacaggaaccaaattaccacgaggag tgggtgacacacaagaaggaggttaccttgaccgtgcctactgagggtctggaggtcacttggggcaacaacgaaccatacaagtactggccgcaga tgtctacgaacggtactgctcatggtcacccacatgagataatcttgtactattatgagctgtaccccactatgactgtagtcattgtgtcggtgg cctcgttcgtgcttctgtcgatggtgggcaca
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atgccaacactcagttggtactacagaggccagcagcaggcacggtacatgtaccatactctcaggcaccatctggcttcaagtattggctgaagga acgaggagcatcgctacagcacacggcaccgttcggttgccagattgcgacaaacccggtaagagctgtaaattgcgctgtggggaacataccaa tttccatcgacataccggatgcggcctttactagggttgtcgatgcaccctctgtaacggacatgtcatgcgaagtaccagcctgcactcactcctc cgactttgggggcgtcgccatcatcaaatacacagctagcaagaaaggtaaatgtgcagtacattcgatgaccaacgccgttaccattcgagaagccg acgtagaagtagaggggaactcccagctgcaaatatccttctcaacagccctggcaagcgccgagtttcgcgtgcaagtgtgctccacacaagt acactgcgcagccgcatgccaccctccaaaggaccacatagtcaattacccagcatcacacaccacccttggggtccaggatatatccacaacggc aatgtcttgggtgcagaagattacgggaggagtaggattaattgttgctgttgctgccttaattttaattgtggtgctatgcgtgtcgtttagcag gcac核心SEQ ID NO :21Atggagttcatcccgacgcaaactttctataacagaaggtaccaaccccgaccctgggccccacgccct acaattcaagtaattagacctagaccacgtccacagaggcaggctgggcaactcgcccagctgatctccgcagtcaacaaattgaccatgcgcgcggtacctcaacagaagcctcgcagaaatcggaaaaacaagaagcaaaggcagaagaagcaggcgccgcaaaacgacccaaagcaaaagaagcaac caccacaaaagaagccggctcaaaagaagaagaaaccaggccgtagggagagaatgtgcatgaaaattgaaaatgattgcatcttcgaag tcaagcatgaaggcaaagtgatgggctacgcatgcctggtgggggataaagtaatgaaaccagcacatgtgaagggaactatcgacaatgccga tctggctaaactggcctttaagcggtcgtctaaatacgatcttgaatgtgcacagataccggtgcacatgaagtctgatgcctcgaagtttaccca cgagaaacccgaggggtactataactggcatcacggagcagtgcagtattcaggaggccggttcactatcccgacgggtgcaggcaagccgggagac agcggcagaccgatcttcgacaacaaaggacgggtggtggccatcgtcctaggaggggccaacgaaggtgcccgcacggccctctccgtggtg acgtggaacaaagacatcgtcacaaaaattacccctgagggagccgaagagtgg以下所示是对应于 CMV/R-CHIKV ΟΕ3-Ε2_6Κ_Ε1 质体(0ΡΥ-1)的壳体(SEQ ID NO 22)以及E3、E2、6K与E1(SEQ ID NO 20)的核苷酸序列。Ε3-Ε2-6Κ-Ε1SEQ ID NO 20Atgagtcttgccatcccagttatgtgcctgttggcaaacaccacgttcccctgctcccagcccccttgc acgccctgctgctacgaaaaggaaccggaggaaaccctacgcatgcttgaggacaacgtcatgagacctgggtactatcagctgctacaagcatcct taacatgttctccccaccgccagcgacgcagcaccaaggacaacttcaatgtctataaagccacaagaccatacttagctcactgtcccgactgtg gagaagggcactcgtgccatagtcccgtagcactagaacgcatcagaaatgaagcgacagacgggacgctgaaaatccaggtctccttgcaaatcg gaataaagacggatgacagccacgattggaccaagctgcgttatatggacaaccacatgccagcagacgcagagagggcggggctatttgtaag aacatcagcaccgtgtacgattactggaacaatgggacacttcatcctggcccgatgtccaaaaggggaaactctgacggtgggattcactgacag taggaagattagtcactcatgtacgcacccatttcaccacgaccctcctgtgataggtcgggaaaaattccattcccgaccgcagcacggtaaaga gctaccttgcagcacgtacgtgcagagcaccgccgcaactaccgaggagatagaggtacacatgcccccagacacccctgatcgcacattaatgtc acaacagtccggcaacgtaaagatcacagtcaatggccagacggtgcggtacaagtgtaattgcggtggctcaaatgaaggactaacaactaca gacaaagtgattaataactgcaaggttgatcaatgtcatgccgcggtcaccaatcacaaaaagtggcagtataactcccctctggtcccgcgtaat gctgaacttggggaccgaaaaggaaaaattcacatcccgtttccgctggcaaatgtaacatgcagggtgcctaaagcaaggaaccccaccgtgacgtacgggaaaaaccaagtcatcatgctactgtatcctgaccacccaacactcctgtcctaccggaatatgggagaagaaccaaactatcaagaagag tgggtgatgcataagaaggaagtcgtgctaaccgtgccgactgaagggctcgaggtcacgtggggcaacaacgagccgtataagtattggccgcag ttatctacaaacggtacagcccatggccacccgcatgagataattctgtattattatgagctgtaccccactatgactgtagtagttgtgtcagt ggccacgttcatactcctgtcgatggtgggtatggcagcggggatgtgcatgtgtgcacgacgcagatgcatcacaccgtatgaactgacaccaggagcta ccgtccctttcctgcttagcctaatatgctgcatcagaacagctaaagcggccacataccaagaggctgcgatatacctgtggaacgagcagcaacc tttgttttggctacaagcccttattccgctggcagccctgattgttctatgcaactgtctgagactcttaccatgctgctgtaaaacgttggctttt ttagccgtaatgagcgtcggtgcccacactgtgagcgcgtacgaacacgtaacagtgatcccgaacacggtgggagtaccgtataagactctagtcaatag acctggctacagccccatggtattggagatggaactactgtcagtcactttggagccaacactatcgcttgattacatcacgtgcgagtacaaaa ccgtcatcccgtctccgtacgtgaagtgetgcggtacagcagagtgcaaggacaaaaacctacctgactacagctgtaaggtcttcaccggcgtctacc catttatgtggggcggcgcctactgcttctgcgacgctgaaaacacgcagttgagcgaagcacacgtggagaagtccgaatcatgcaaaacagaatt tgcatcagcatacagggctcataccgcatctgcatcagctaagctccgcgtcctttaccaaggaaataacatcactgtaactgcctatgcaaacg gcgaccatgccgtcacagttaaggacgccaaattcattgtggggccaatgtcttcagcctggacacctttcgacaacaaaattgtggtgtacaaagg tgacgtctataacatggactacccgccctttggcgcaggaagaccaggacaatttggcgatatccaaagtcgcacacctgagagtaaagacgtctatgc taatacacaactggtactgcagagaccggctgtgggtacggtacacgtgccatactctcaggcaccatctggctttaagtattggctaaaagaac gcggggcgtcgctgcagcacacagcaccatttggctgccaaatagcaacaaacccggtaagagcggtgaactgcgccgtagggaacatgcccatct ccatcgacataccggaagcggccttcactagggtcgtcgacgcgccctctttaacggacatgtcgtgcgaggtaccagcctgcacccattcctca gactttgggggcgtcgccattattaaatatgcagccagcaagaaaggcaagtgtgcggtgcattcgatgactaacgccgtcactattcgggaagctga gatagaagttgaagggaattctcagctgcaaatctctttctcgacggccttagccagcgccgaattccgcgtacaagtctgttctacacaagtaca ctgtgcagccgagtgccaccccccgaaggaccacatagtcaactacccggcgtcacataccaccctcggggtccaggacatctccgctacggcgatg tcatgggtgcagaagatcacgggag
gtgtgggactggttgttgctgttgccgcactgattctaatcgtggtgctatgcgtgtcgttcagcaggc ac核心SEQ ID NO 22Atggagttcatcccaacccaaactttttacaataggaggtaccagcctcgaccctggactccgcgccct actatccaagtcatcaggcccagaccgcgccctcagaggcaagctgggcaacttgcccagctgatctcagcagttaataaactgacaat gcgcgcggtaccacaacagaagccacgcaggaatcggaagaataagaagcaaaagcaaaaacaacaggcgccacaaaacaacacaa atcaaaagaagcagccacctaaaaagaaaccggctcaaaagaaaaagaagccgggccgcagagagaggatgtgcatgaaaatc gaaaatgattgtattttcgaagtcaagcacgaaggtaaggtaacaggttacgcgtgcctggtgggggacaaagtaatgaaaccagca cacgtaaaggggaccatcgataacgcggacctggccaaactggcctttaagcggtcatctaagtatgaccttgaatgcgcgcaga tacccgtgcacatgaagtccgacgcttcgaagttcacccatgagaaaccggaggggtactacaactggcaccacggagcagtacagtac tcaggaggccggttcaccatccctacaggtgctggcaaaccaggggacagcggcagaccgatcttcgacaacaagggacgcgtggt ggccatagtcttaggaggagctaatgaaggagcccgtacagccctctcggtggtgacctggaataaagacattgtcactaaaatca cccccgagggggccgaa gagtgg在一特定实施例中，核苷酸分子SEQ ID NO :1、19、3或20包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽与编码选自壳体、E3、E2、6K与El或E3、E2、6K与El的包膜蛋白的多肽具有至少约 50%、60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或更高的相似性(例如当和胺基酸序列全长比较时)。在本发明的一些实施例中，蛋白质可包括含有改变的突变，产生无声取代(silent substitutions)、加成或删除，但不改变编码蛋白质的性质或活性，或是蛋白质如何制造。 可由许多理由制造核苷酸变异，例如优化在特定宿主的密码子表现。参阅美国专利公开案号2005/0118191，所述公开案的全文并入本申请作为参考。除此之外，可定序核苷酸，确认转殖正确的编码区域并且不包含任何不想要的突变。核苷酸可次转殖至表现载体(例如杆状病毒)中，用于任何细胞中的表现。熟知此技艺的人士理解不同的次转殖方法是可获得且可能的。可实质纯化但不需要纯化分离的核苷酸。例如，在转殖或表现在体内分离的核苷酸并不纯，可包括所在细胞内的一点物质。所述核苷酸被分离，如本申请所用的词，是用熟知此技艺的人士已知的标准技术来进行操作。CHIKV VLP 产生本发明也提供建构与方法，用于产生包括CHIKV多肽或其片段的VLP，以及增加VLP产生效率的组合物与方法。例如，增加领导序列至CHIKV壳体、E3、E2、6K与El或其部分，可改善在细胞内运输的蛋白质效率。在另一范例中，异质信号序列可融合至CHIKV壳体、E3、E2、6K与El或其部分。在一实施例中，所述信号序列可得自于昆虫细胞的基因。对于特定的细胞型式，增加VLP产生效率的其它方法是优化核苷酸的密码子，编码CHIKV壳体、E3、E2、6K与El或其部分。选殖所述蛋白质的方法是此技艺中已知的。例如，编码特定CHIKV或任何亚法蛋白的基因可用RT-PCR从细胞萃取的多腺嘌呤化的mRNA中分离，所述细胞已经被所述病毒感染。所得的基因可被转殖成为DNA插入载体中。“载体”是指核苷酸可在生物体、细胞或细胞成分间增殖与/或转换。载体包含质体、病毒、噬菌体、前病毒、噬菌质体、转位子、人工染色体等，自动复制或是可整合至宿主细胞的染色体。载体也可以是裸露的RNA多核苷酸、 裸露的DNA多核苷酸、在同一股中由DNA与RNA组成的多核苷酸、多离胺酸结合的DNA或 RNA、胜肽结合的DNA或RNA、脂肪体结合的DNA等，不自动复制。在许多并非全部的实施例中，本发明的载体是质体或杆状病毒质粒。因此，本发明包括编码蛋白质的核苷酸，包含嵌合分子，转殖在可表现载细胞中的表现载体中，诱导形成本发明的VLP。“表现载体”是载体，例如质体，可促进表现以及并入其中的核苷酸复制。典型地，要表现的核苷酸是“操作连结”至启动子与/或促进子，以及用于由所述启动子与/或促进子转录调节控制。在一实施例中，VP包括一或多个亚法病毒包膜蛋白，特别是CHIKV病毒包膜蛋白。在另一实施例中，所述一或多个包膜蛋白是选自E3、 E2、6K与El组成的群组中。在另一实施例中，VLP包括CHIKV病毒壳体蛋白。在相关的实施例中，使用基孔肯尼亚病毒壳体蛋白。在另一实施例中，所述VLP是由E3、E2、6K与El组成。在另一实施例中，VLP是由壳体、E3、E2、6K与El组成。在另一实施例中，表现载体是杆状病毒载体。本发明也提供产生包括CHIKV多肽或其片段的VLP。在一范例中，所述方法涉及在细胞中表现编码CHIKV多肽的多核苷酸，以及培养所述细胞，因而产生VLP。在一实施例中， 用DNA疫苗感染细胞(例如人类细胞)，其中所述DNA疫苗是DNA载体，包括编码亚法病毒壳体蛋白或一或多亚法病毒包膜蛋白或其片段的核苷酸片段，产生亚法病毒VLP。特别地， 所述亚法病毒是CHIKV。取决于选择的表现系统与宿主细胞，在条件下成长表现载体转型的宿主细胞，因而表现重组蛋白以及形成VLP。在一实施例中，本发明包括产生VLP的方法，涉及转染编码至少一亚法病毒蛋白的载体至合适的宿主细胞中，以及在条件下表现所述亚法病毒蛋白， 产生VLP。在另一实施例中，所述真核细胞是选自于酵母菌、昆虫、两栖类、鸟类或哺乳动物细胞。合适成长条件的选择是熟知此技艺的人士已知的。成长产生本发明VLP的细胞的方法包含但不限于批次、批次-喂养、连续与灌注细胞培养技术。在一实施例中，包括CHIKV或亚法病毒多肽的细胞生长在生物反应器或发酵槽中，细胞增生与表现蛋白质(例如重组蛋白)用于纯化与分离。典型地，在无菌、控制温度与气压条件下，进行细胞培养。生物反应器是用于培养细胞的腔室，其中可监视例如温度、气压、搅动与/或PH环境条件。在一实施例中，生物反应器是不锈钢腔室。在另一实施例中，所述生物反应器是预先消毒的塑料袋(例如Celling. RTM.，Wave Biotech, Bridge, N. J.)。在其它实施例中，所述预先消毒的塑料袋是约50公升至1000公升的袋子。
VLP的分离方法保留其完整性，例如梯度离新，例如氯化铯、蔗糖与碘克沙醇，以及标准的纯化技术，包含例如离子交换与胶体过滤层析。以下是如何制造、分离与纯化本发明VLP的范例。熟知此技艺的人士理解可使用其他方法制造与纯化VLP。因此，本发明不限于本申请所述的方法。通常，本发明产生VLP是通过培养哺乳动物细胞(例如人类胚胎肾Q93T)细胞) 或Sf9细胞(未感染)至摇荡锥形瓶中，细胞增生放大(例如从125毫升锥形瓶至50公升Wave袋)。用于培养细胞的培养液是调配用于合适的细胞株(较佳为无血清培养液，例如昆虫培养液ExCell-420，JRH)。接着，用合适的载体(例如哺乳动物表现载体)或对于 SF (在最有效复制感染(例如每个细胞从约1至约3的蚀斑形成单元)的细胞重组杆状病毒)转染或感染细胞。在细胞中表现多核苷酸或其部分，它们自身组合成VLP，并且在感染后M至72小时，从细胞分泌出来。通常，当细胞在生长的mid-log相G-SxlO6细胞/毫升)且至少约90%存活时，转染或感染最有效率。感染后约48至120小时，当细胞培养液中VLP的量接近最大值但在大量细胞溶融之前，收取本发明的VLP。由染色排除分析显示，收取时的细胞密度与存活率可约为0. 5X106 细胞/毫升至约1.5X106细胞/毫升，至少20%存活率。接着，移除并净化培养液。培养液中可加入NaCl至浓度约0. 4至约1. 0M，较佳为约0. 5M，避免VLP集结。通过切向流过滤 (Tangential Flow Filtration, TFF)，用单次使用、预先消毒的中空纤维0. 5或1. 00微米过滤匣或类似装置，从含有本发明VLP的细胞培养液中移除细胞与细胞残骸。接着，通过超过滤，使用可抛式、预先消毒的500，000分子量切断中空纤维匣，浓缩净化的培养液中的VLP。可用10倍体积pH7. 0至8. 0含有0. 5M NaCl的磷酸缓冲盐(PBS) 透析浓缩的VLP，移除残留的培养液成分。可用pH7. 2PBS缓冲液与0. 5M NaCl中20%至60%不连续蔗糖梯度，进一步纯化浓缩、透析的VLP，在约4°C至约10°C，6，500x g离心18小时。通常在约30%至约40%蔗糖之间或接口处(在20%与60%阶梯梯度)，VLP会形成明显可见带，可从梯度收集并且储存。所述产物可被稀释至包括200mM的NaCl，用于纯化程序的下个步骤。所述产物包含 VLP,并且可包含完整的杆状病毒颗粒。可通过离子交换层析或44%等密度蔗糖缓冲离心，达到进一步纯化VLP。在离子交换层析中，来自蔗糖梯度(参阅如上)的样品置入含有具阴离子的培养液(例如Matrix Fractogel EMD TMAE)以及通过盐梯度(从约0. 2M至约1. OM NaCl)冲提，可分离VLP与其它污染物(例如杆状病毒与DNA/RNA)。在所述蔗糖缓冲方法中，包括VLP的样品加入44% 蔗糖缓冲，并且在30，OOOg离心约18小时。在44%蔗糖的顶部形成VLP，而杆状病毒沉淀在底部，以及其它污染物停留在顶部的0%蔗糖层。收集VLP峰或带。视需要可去活化完整的杆状病毒。可通过化学方法完成去活化作用，例如福尔马林或是贝塔丙内酯(BPL)。如上所述，使用此技艺中已知的选择性沉淀与色层方法，也可大量完成完整杆状病毒的移除与/或去活化。去活化的方法包括在约25°C至约27°C，将含有 0. 2% BPL的VLP的样品培养3小时。也可通过在4°C将含有在0. 05% BLP的VLP样品培养3天，而后在37°C培养1小时，将杆状病毒去活化。在所述去活化/移除步骤之后，包括VLP的产物可进入另一透析过滤步骤，移除来自去活化步骤与/或任何残留蔗糖的任何试剂，以及放置VLP在所要的缓冲液(例如PBS)中。可用此技艺中已知的方法(例如消毒过滤)，消毒所述包括VLP的溶液，并且储存在冰箱或冷冻器中。可通过许多级别(scales)实施上述技术。例如，T-烧瓶、摇荡-烧瓶、旋转瓶、上至工业尺寸的生物反应器。所述生物反应器可包括不锈钢槽或是预先消毒的塑料袋(例如 Wave Biotech, Bridgewater, NJ.卖的系统)。熟知此技艺的人士知道最适合他们目的要用的。在一些实施例中，DNA疫苗或是VLP包括试剂，例如核苷酸分子、siRNA、微RNA、化学治疗剂、显影剂与/或其它需要传送至病人的试剂。因此，本发明提供治疗病毒疾病与/或不适或其症状的方法，所述方法包括对个体(例如哺乳动物，例如人类)给予有治疗效果剂量的医药组合物，所述组合物包括本申请的VLP或DNA。因此，一实施例是治疗受到或是疑似受到病毒感染、病毒疾病、不是或其症状的个体的方法。所述方法包含对所述哺乳动物给予治疗或预防量的化合物，在条件下足以治疗疾病、不适或其症状，因而预防或治疗所述疾病或不适。本申请的方法包含对所述个体(包含辨识需要此治疗的个体)给予有效量的本申请化合物或本申请组合物，产生所述效应。辨识需要此治疗的个体可以是评估个体或是健康照顾专业，并且可以是主观(例如意见)或是客观(例如测试或是诊断方法)。如本申请所使用，“治疗”是指减少或减缓不适与/或相关症状。应理解虽然不排除，但治疗疾病或状况不需要所述不适、状况或相关症状完全消除。如本申请所使用，“预防”、“预防治疗”是指在个体中减少发展不适或状况的可能性，所述个体不具有但有风险或疑似发展不适或状况。本发明的治疗方法通包括对有需要的个体(例如动物、人类)给予治疗有效量的试剂，例如VLP或本申请DNA，所述个体包含哺乳动物，特别是人类。此治疗适合给予个体， 特别是受到、具有、疑似或是有风险疾病、不适或其症状。通过诊断测试或主观意见或健康照顾提供者(例如遗传测试、酵素或是蛋白质标示，标示(本申请定义的)、家庭历史等)， 可用任何客观或主观决定方式决定这些个体“有风险”。本申请的试剂也可用于治疗受到亚法病毒感染的任何其它不适。在一实施例中，本发明提供监视治疗过程的方法。所述方法包含对遭受或疑似有亚法病毒感染不适或其相关症状的个体，给予一程度的诊断标示(Marker)(例如本申请所述由本申请化合物、蛋白质或其指示物调节的任何目标)，或诊断测量(例如筛选、分析)， 其中所述个体已经被给予治疗量的本申请化合物，足以治疗所述疾病或其症状。方法中决定的标示程度可与已知的标示程度比较，作为健康正常控制或是在其它病患上建立个体疾病状态。在较佳实施例中，第一程度决定之后，在较晚的时间点，决定个体中第二程度的标示，以及比较两程度，监视疾病进程或是治疗效果。在一些较佳实施例中，在开始治疗之前， 决定个体中预先治疗程度的标示；此预先治疗程度的标示可与治疗后个体中的标示程度比较，决定治疗的有效性。医药组合物与给予本发明特征在医药组合物，包括本申请所述亚法病毒的VLP。本申请有用的医药组合物包含医药可接受的载体，包含任何适合的稀释剂或赋形剂，包含任何医药试剂，自身不包含产生免疫反应危害接受所述组合物的脊椎动物，并且可给予无过度毒性以及本发明的VLP。如本申请所述，“医药可接受的”是指联邦或州政府管理局所通过或美国药典、欧洲药典或用于哺乳动物，特别是用于人类的其它一般公认药典所通过的。这些组合物可用于疫苗与/或抗原性组合物，用于在脊椎动物中，诱导保护性免疫反应。在特定实施例中，本发明包括抗原性配方，包括VLP，包括至少一病毒蛋白质，例如一亚法病毒蛋白。所述亚法病毒可选自但不限于基孔肯尼亚病毒、辛德毕病毒(Sindbis virus)、东方马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis (EEE) virus)、西方马脑炎病毒(Western equine encephalitis (WEE) virus)以及委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis (VEE) virus)。在一些较佳实施例中，医药组合物包括基孔肯尼亚病毒的VLP，以及医药可接受的载体。在其它的一些较佳实施例中，医药组合物包括基孔肯尼亚病毒的VLP、佐剂以及医药可接受的载体。在一实施例中，所述VLP包括基孔肯尼亚病毒包膜蛋白，例如所述包膜蛋白可选自娱E3、E2、6K与E1。在另一实施例中，所述医药组合物更包括基孔肯尼亚病毒壳体蛋白。 在一些范例中，基孔肯尼亚病毒壳体蛋白是壳体蛋白。在一些范例中，所述VLP包括E3、E2、 6K与E1。在其它范例中，所述VLP包括壳体、E3、E2、6K与El。本发明也包括疫苗配方，包括VLP，所述VLP包括至少一病毒蛋白，例如一亚法病毒蛋白。所述亚法病毒可选自但不限于基孔肯尼亚病毒、辛德毕病毒(Sindbis virus), 东方马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis (EEE) virus)、西方马脑炎病毒(Western equine encephalitis (WEE) virus)以及委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis (VEE) virus)。在一些较佳实施例中，疫苗组合物包括基孔肯尼亚病毒的VLP，以及医药可接受的载体。在其它的一些较佳实施例中，疫苗组合物包括基孔肯尼亚病毒的VLP、佐剂以及医药可接受的载体。在一实施例中，所述疫苗组合物包括基孔肯尼亚病毒包膜蛋白的VLP，例如所述包膜病毒可选自于E3、E2、6K与E1。在另一实施例中，所述疫苗组合物更包括基孔肯尼亚病毒壳体蛋白以及医药可接受的载体或赋形剂。在一些范例中，基孔肯尼亚病毒壳体蛋白是壳体蛋白。在一些范例中，所述VLP包括E3、E2、6K与E1。在其它范例中，VLP包括壳体、E3、E2、6K 与 E1。医药可接受的载体包含但不系于盐、缓冲盐、葡萄糖、水、甘油、无菌等渗透压液体缓冲以及其组合。医药可接受的载体、稀释剂与其它赋形剂请参阅Remington’ s Pharmaceutically Sciences (Mack Pub. Co. N. J.目前版本)。所述配方应适合给予模式。 在一较佳实施例中，所述配方适合给予至人类，较佳是无菌、非微粒与/或非高热生成的。视需要，所述组合物也可包含较少量的湿润或乳化剂或pH缓冲剂。所述组合物可以是固体形式，例如适合重组的冷冻干燥粉末、液体溶液、悬浮液、乳状物、锭剂、粒状、胶囊、持续释放配方或粉末。口服配方可包含标准载体，例如医药等级的甘露醇、乳糖、淀粉、 知脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。在一些实施例中，所述VLP组合物供应微液体形式，例如在密封容器中，指示所述 VLP组合物的量与浓度。较佳地，所述VLP组合物的液体形式供应在密封容器中，至少约50 微克/毫升，更佳为至少约100微克/毫升，至少约200微克/毫升，至少500微克/毫升， 或至少1毫克/毫升。
通常，给予有效量(如本申请所述)的本发明VLP或DNA疫苗，足以刺激免疫反应对抗一或多病毒株，例如亚法病毒，例如CHIKV。较佳地，给予本发明的VLP诱导免疫对抗病毒，例如亚法病毒，特别是例如CHIKV。典型地，可在此范围内调整剂量，例如基于生理状况、体重、性别、饮食、给予时间以及其它临床因子。预防疫苗配方是系统给予，例如使用针与针筒或是无针注射装置，通过皮下或是肌肉注射。或者，疫苗配方是鼻内给予或滴剂、大颗粒气雾剂(大于约10微米)或是喷入上呼吸道或是小颗粒气雾剂(小于10微米)，或是喷入下呼吸道。当上述任何传递路径造成免疫反应，在病毒进入处，鼻内给予增加诱导黏膜免疫的效果，所述病毒包含亚法病毒，例如CHIKV。因此，本发明也包括调配疫苗或抗原性组合物的方法，对哺乳动物诱导免疫对抗感染或是至少一症状，所述方法包括增加所述配方有效剂量的VLP，例如CHIKV VLP。在一实施例中，所述感染是亚法病毒感染，例如但不限于基孔肯尼亚病毒、辛德毕病毒(Sindbis virus)、东方马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis (EEE) virus)、西方马脑炎病毒(Western equine encephalitis (WEE) virus)以及委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis (VEE) virus)。在一些范例中，较佳为单一剂量的免疫刺激，然而也可给予额外的剂量，通过相同或不同路径，达到所要的效果。例如，在婴儿与新生儿中，可能需要多次给予，刺激足够量的免疫性。可在整个幼儿期持续给予，视需要维持足够量的保护对抗感染。同样地，特别受到重复或严重感染的成人，例如健康照顾工作者、日间照顾工作者、小孩、老人的家人，心肺功能或免疫系统需要多次免疫作用建立与/或维持保护性免疫反应的个体。例如，通过量测中和分泌与血清抗体量可监视诱导免疫性的程度，以及调整的剂量或视需要重复的疫苗作用，刺激与保持所要的保护程度。初始刺激(Prime Boost)本发明方法也包含不同的初次刺激方式。在这些方法中，一或多次免疫作用之后， 接着一或多刺激免疫作用。实际免疫原组合物的每一次免疫作用可以相同或不同，以及免疫原组合物的形式(例如包含蛋白质或表现载体)、路径与免疫原的配方也可变化。例如，在一实施例中，最初包括给予如本申请所述的DNA或基因为基础的疫苗，以及刺激包括给予本申请所述的VLP。在另一实施例中，最初包括给予本申请所述的VLP，以及刺激包括给予本申请所述的DNA或其它基因为基础的疫苗。一有效的初次刺激方式提供两次初始免疫作用，间隔四周，接着是在最后的初始免疫作用后，在第四周与第八周进行两次刺激免疫作用。熟知此技艺的人士应理解有几种变更与组合，包括使用本发明的DNA、细菌与病毒表现载体，提供初始与刺激方式。给予包括VLP与/或DNA疫苗(疫苗与/或抗原配方)组合物的方法包含但不限于腹腔给予(例如皮肤内、肌肉、血管与皮下)、硬脑膜上以及黏膜(例如鼻内与口服或肺部路径或栓剂)。在特定实施例中，本发明的组合物给予方式是肌肉内、血管内、皮下、穿皮或皮肤内。所述组合物的给予可以是任何方便的路径，例如注入或大丸药注射，通过表皮或黏膜层吸收(例如口腔黏膜、直肠、结膜、鼻咽、口咽、阴道、尿道、膀胱与肠道黏膜等)，以及可与其它生物活性剂一起给予。在一些实施例中，鼻内或其它粘膜路径给予包括本发明VLP 的组合物可诱导高于其它给予路径的抗体或其它免疫反应。在另一实施例中，鼻内或其它粘膜路径给予包括本发明VLP的组合物可诱导抗体或其它免疫反应，诱导交叉保护对抗其它病毒株。给予可以是肌肉内、皮下、腹膜内。在一较佳实施例中，所述给予是肌肉内。在另一实施例中，针对黏膜组织，给予所述疫苗与/或抗原性配方，在免疫作用位置诱导免疫反应。例如，可针对黏膜组织例如胆相连的淋巴组织(GALT)，使用口服包含佐剂与特定黏膜目标性质的组合物，进行免疫作用。也可针对其它的粘膜组织，例如鼻咽淋巴组织(NALT)以及支气管相连的淋巴组织(BALT)。本发明的疫苗与/或抗原性配方也可依照剂量排程给予，例如所述疫苗组合物的初始给予以及后续的刺激给予。在特定的实施例中，在初始给予之后，第二剂量的组合物给予在任何处，从两周至一年，较佳从约一、约二、约三、约四、约五至约六个月。除此之外， 在第二季量之后，从初始给予后约三个月至约两年或甚至更久，较佳约四、约五或约六个月或约七个月至约一年可给予第三剂量。在第二剂量之后，当在个体的血清与/或尿液或粘膜分泌中侦测不到特定免疫球蛋白时，可以是需要给予所述第三剂量。在一较佳实施例中， 在所述第一给予之后约一个月，给予第二剂量，以及在第一给予之后约六个月，给予第三剂量。在另一实施例中，在第一投之后约六个月，给予所述第二剂量。在另一实施例中，所述本发明的VLP可给予成为组合治疗的一部分。例如，本发明的VLP可与其它免疫原性组合物、抗病毒与/或抗生素调配。可与预防或治疗亚法病毒(例如基孔肯尼亚病毒感染)的另一免疫原组合物、抗病毒、抗生素或任何其它试剂同时、后续或连续给予VLP。熟知此技艺的人士可决定医药配方的剂量，例如第一辨识剂量有效诱导预防或治疗的免疫反应，例如量测病毒特异性的免疫球蛋白的血清量或是量测血清样品或尿液样品或黏膜分泌中的抗体抑制率。可从动物研究中决定所述剂量。用于研究疫苗有效性的动物可包含豚鼠、仓鼠、貂鼠、金吉拉(chinchilla)、老鼠与棉鼠(cotton rat)，以及非人类的灵长类。大部分动物并不是感染试剂的自然宿主，但仍可以作为不同疾病的研究。例如，上述任何动物可给予疫苗候选者，例如本发明的VLP，部分定性所诱导的免疫反应，以及/或决定是否已经产生任何中和抗体。例如，已经进行许多老鼠模式的研究，因为老鼠体积小且成本低，因此研究人员用以进行大量研究。除此之外，熟知此技艺的人士可进行人类临床研究，决定对于人类较佳的有效剂量。在此技艺中，此临床研究常规且已知的。精确的剂量也取决于给予路径。可从体外或动物测试系统的剂量反应曲线，外插得到有效剂量。同样是此技艺中已知的，可使用免疫反应的非专一性刺激物，促进特定组合物的免疫原性。已经实验使用佐剂促进增加免疫性对抗未知的抗原(例如美国专利号 4，877，611)。在免疫作用中已经使用佐剂刺激反应长达多年，因此对于熟知此技艺的人士而言，佐剂是已知的。一些佐剂影响抗原呈现的方式。例如，当蛋白质抗原是由明矾沉淀时， 免疫反应会增加。抗原的乳化作用也会延长抗原呈现的时间。Vogel等人发表的“疫苗佐剂与赋形剂概略(第二版)”描述的任何佐剂全文并入本申请作为参考，且包含在本发明的范围内。范例佐剂包含完整的Freimd佐剂(包含已死的结核杆菌的非专一性免疫反应的刺激物)，不完整的Freund佐剂与氢氧化铝佐剂。其它佐剂包括GMCSP、BCG、氢氧化铝、MDP 化合物，例如thur-MDP与nor-MDP、CGP (MTP-PE)、脂肪A以及单磷酸脂肪A (MPL)。也可考虑 RIBI，它包含在2%角鲨烯(Squalene)/TWeen-80乳液物中有萃取自细菌的三种成分，MLP、 海藻糖二分枝酸酯(TDM)以及细胞壁骨架(CWS)。也可使用MF-59、Novasmes. RTM.、MHC抗原。本发明的VLP也可调配“免疫刺激物”。这些是身体自身的化学传讯者(细胞激素)，增加免疫系统的反应。免疫刺激物包含但不限于具免疫刺激作用的各种细胞激素， 淋巴激素以及化学激素，以及前发炎活性，例如细胞白介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、 IL-12、IL-13)；生长因子(例如颗粒球细胞-巨噬细胞(GM)群落刺激因子(CSF)；以及其它免疫刺激分子，例如巨噬细胞发炎因子、Flt3配体、B7. 1 ；B7. 2等。可在相同配方中给予免疫刺激分子作为VLP或是可分别给予。可给予蛋白质或是编码所述蛋白质的载体，产生免疫刺激效应。因而，在一实施例中，本发明包括抗原性与疫苗配方，包括佐剂与/或免疫刺激物。传递方式本发明的VLP可用于制备组合物，刺激免疫反应。所述组合物可用于治疗或预防病毒感染(例如CHIKV或是其它亚法病毒感染)。黏膜与细胞免疫皆可对于感染剂与疾病， 贡献免疫性。在一实施例中，本发明包括诱导对抗病毒感染的方法，例如个体中基孔肯尼亚病毒感染，对所述个体给予基孔肯尼亚病毒VLP或DNA疫苗。本发蒙也提供在个体中诱导免疫对抗病毒感染或至少其一症状的方法，包括给予至少一有效剂量本申请所述的VLP或DNA疫苗，例如包括一或多病毒蛋白的VLP，例如一或多CHIKV病毒包膜蛋白，或包括编码亚法病毒壳体蛋白或一或多亚法病毒包膜蛋白或其片段的DNA疫苗。在一些范例中，所述VLP更包括病毒壳体蛋白。在另一实施例中，所述方法包括诱导免疫对抗病毒感染，例如CHIKV感染或是至少一其症状，以多次剂量给予所述配方。当给予至脊椎动物时，本发明的VLP可在所述脊椎动物(例如人类)中诱导实质免疫。免疫反应造成的实质免疫对抗本发明的VLP，在所述脊椎动物中，保护或减缓感染或至少减少感染的症状。在一些例子中，如果所述脊椎动物被感染，所述感染是无症状的。反应可能不是完全保护反应。在此例子中，如果所述脊椎动物被感染剂感染，则相较于未被免疫的脊椎动物，所述脊椎动物会经历较轻的症状或是较短的症状期间。在一实施例中，本发明包括在个体中，诱导实质免疫对抗亚法病毒感染或至少其一症状的方法，包括给予至少一有效剂量的VLP与/或DNA疫苗，所述DNA疫苗包括编码亚法病毒壳体蛋白或一或多亚法病毒包膜蛋白或其片段的核苷酸片段。在特定实施例中，所述感染是CHIKV以及所述VLP包括本申请所述的一或多CHIKV包膜蛋白。在另一实施例中， 本发明包括对哺乳动物接种疫苗对抗亚法病毒的方法，包括对所述哺乳动物给予保护诱导量的VLP或DNA疫苗，所述DNA疫苗包括壳体、E3、E2、6K与El。在另一实施例中，所述方法包括给予包括E3、E2、6K与El的DNA疫苗。在另一实施例中，所述方法包括给予DNA疫苗， 所述DNA疫苗包括C-Env37997如SEQ ID NO 1。在另一实施例中，所述方法包括给予DNA疫苗，所述DNA疫苗包括Env37997如SEQ ID NO 19。在另一实施例中，所述方法包括给予DNA 疫苗，所述DNA疫苗包括^!^。!^如SEQ ID NO :3。在另一实施例中，所述方法包括给予 DNA疫苗，所述DNA疫苗包括Envra^1如SEQ ID NO :20。在一实施例中，所述方法包括给予 VLP，所述VLP包括壳体、E3、E2、6K与El。在另一实施例中，所述方法包括给予VLP，所述 VLP包括E3、E2、6K与El。在一实施例中，所述方法包括给予VLP，所述VLP包括基孔肯尼亚病毒包膜蛋白。
在另一实施例中，本发明包括在个体中，诱导保护性细胞反应对抗病毒感染或至少一其症状的方法，包括给予至少一有效剂量的DNA疫苗或VLP。如上所述，本发明的VLP在个体中预防或减少感染的至少一症状。可主观或客观决定症状减少，例如个体的自身评估、临床师的评估或是进行适当的分析或测量(例如体温)，包含例如生命评估的质量、减缓的病毒感染进程或是其它症状、病毒症状严重性降低或是合适的分析(例如抗体量与/或T细胞活化分析)。客观评估包括动物与人类评估。本发明也提供辨识病毒进入抑制剂的分析，包括在至少一实施例中，遗传修饰的目标细胞表现至少一基孔肯尼亚病毒受体与任何共同受体可能是感染或进入需要的。这些细胞经过遗传修饰，因而表现报导基因，例如亲和性标示、荧光蛋白或是可将基质转换成荧光、化学或冷光产物的酵素。在用目标病毒感染之后，将报导基因的表现配置明显减少(向下调节)，则是完成将此型式的报导信号耦合至病毒感染的抑制。原则上，可由任何合适的装置确认，但主要较佳为报导基因产物本身融合至细胞蛋白，在用目标病毒感染之后，本身被向下调节。例如，报导基因产物可被融合至对应的病毒受体，在许多范例中，感染后是被向下调节。因此，可对化合物库筛选具有抑制细胞受到基孔肯尼亚病毒(CHIKV)感染能力。 能稳定产生报导基因则为适当的指示细胞株。在一范例中，这些细胞培养在微升盘中，在每一槽中，在不同化合物，例如抗生素，存在下和CHIKV颗粒一起培养。在感染后，由于病毒基因的表现，融合蛋白被向下调节。因此，只有不被CHIKV感染的细胞会表现报导基因。因此， 具有正报导信号的槽则含有抑制感染的化合物。这些分析的变化与修饰从描述说明的相关部分看来是明显的，在分析的个别部分中有详细说明。特别地，在一实施例中，当发生感染时，可表现报导基因，而非感染后的报导基因被向下调节。在另一实施例中，病毒颗粒是假型病毒颗粒，包括一或多个包膜蛋白，以及视需要有来自CHIKV的壳体蛋白。在另一实施例中，本发明提供辨识病毒进入的方法，使用报导基因系统作为范例。 简而言之，本发明提供重组的慢病毒载体，表现报导基因。培养细胞，以及使用标准技术，共同转染表现载体，例如Env37997、Envop^1以及报导质体。在感染前一天，放置细胞。通过序列稀释，先滴定编码报导基因的CHIKV Env-假型慢病毒载体。而后在加入病毒之前，相同量的假型载体与候选抑制剂培养。而后使用细胞溶融缓冲液融融细胞，以及测量报导基因活性。基于报导基因的表现，辨识病毒进入的抑制剂。套组(KITS)本发明也提供医药包装或套组，包括填充本发明配方的一或多成分的一或多容器。在一较佳实施例中，所述套组包括两个容器，一个包含VLP，另一个包含佐剂。与此容器相关的可以是政府机构规范制造、使用或医药或生物产品销售的说明，所述说明反应出制造商、使用或销售给予人类的核准。本发明也提供VLP配方密封在在密封容器中的，例如安瓶或是sachette指示组合物的量。在一实施例中，所述VLP组合物供应为溶液，在另一实施例中，作为密封容器中干燥无菌的冷冻粉末或是无水浓缩物，以即可被重组，例如具有水或盐类至给予个体的适当浓度。本发明的特征也是包括本申请所述VLP的套组。本发明的特征也是包括本申请所述DNA疫苗的套组供于使用。本发明的特征也是一套组，包括第一容器中的VLP以及第二容器中的DNA疫苗，以及用于初始刺激免疫作用的说明。以下范例是说明本发明而非限制本发明。虽然提供特定范例，但以上描述仅作为说明而非具有限制性。前述实施例的任何一或多个特征可用任何方式结合本发明任何其它实施例的一或多个特征。再者，在看过本申请说明书之后，本发明的许多变化对熟知此技艺的人士而言是明显的。因此，本发明的范围决定并非参考上述说明，而是参考附随的权利要求书以及均等物的全部范围。除非特别说明，实施本发明使用习知的分子生物(包含重组技术)，微生物、细胞生物、化学与免疫学技术，这些是熟知此技艺的人士已知的。所述技术在文献中有完全的解释与说明，例如“分子选殖实验室手册”第二版(Sambrook，1989)；“寡核苷酸合成” (Gait, 1984)；“动物细胞培养” (Freshney, 1987)；“酵素学中的方法” “实验免疫学手册” (Weir, 1996)；“用哺乳动物细胞的基因转换载体” (Miller与Calos，1987)；“分子生物的现今流程”(Ausubel，1987) ；“PCR 聚合酶链反应”(Mullis，1994)；“免疫学的现今流程”(Coligan，1991)。这些技术可用于产生本发明的多核苷酸与多肽，以及可考虑用于制造与实施本发明。特定实施例使用的特别技术会在后续部分讨论。以下范例是提供熟知此技艺的人士完整的揭露内容与描述如何制造与使用本发明的分析、筛选以及治疗方法，而不是用于限制本发明的范围。范例范例1 慢病毒载体假型与CHIKV包膜媒介进入通过与野生型病毒相同机制为了检验CHIKV细胞进入的机制与专一性，慢病毒载体报导者用来自不同CHIKV 株的醣蛋白假型(pseudotyped)，媒介进入可穿透的细胞。在病毒颗粒表面刺穿的CHIKV 是由三个E1-E2异源二聚体形成，其中El醣蛋白媒介融合，以及E2醣蛋白与宿主受体交互作用。CHIKV基因表现自然多太，E3-E2-6K-E1多蛋白，使37997与LR20060PY-1株插入表现载体(E37997与E0PY-1)(图1A、图6、7A、7B与8A-8C)。通过病毒的浮力密度梯度沉降， 确认两个CHIKV E进入假型慢病毒在体。CHIKV E与HIV-IGag具有相同的浮力密度作为慢病毒颗粒(图幻。37997与LR20060PY-1CHIKV假型慢病毒载体感染几个许可的细胞株 (Sourisseau et al.，PLoS. Pathog. 3，e89 Q007))，由荧光酵素报导活性，而控制组 CHIKV 包膜蛋白不感染这些细胞株(图1B，左)，以及感染系有剂量相关性(图1B，右)。为了决定进入是否透过与自然病毒相同的机制，如上所述，分析进入的PH与核内体(endosome)相关性(Yang et al.，J. Virol. 78, 5642 (2004)) CHIKV 通过 pH 相关性的细胞融合过程感染细胞。因此，加入氯化铵或氯喹(chloroquine)，防止核内体的酸化作用， 造成CHIKV假型载体进入的剂量相关性减少(图1C)。观察到VSV-G也有类似的进入抑制作用，已知VSV-G以此方式进入，但没有双嗜性(amphotropic)鼠科白血病病毒(MuLV)醣蛋白70，它是以pH依存方式进入。这些发现说明慢病毒载体假型CHIKV包膜媒介通过与野生型病毒相同的机制进入。接着测试注射CHIKV株的老鼠血清。将免疫血清与所述CHIKV 假型慢病毒载体培养，但没有VSV-G假型载体抑制进入(图1D)。因此，可定量中和抗体的专一性与潜力而不暴露至感染病毒。范例2 =VLP具有野生型病毒的外型
CHIKV编码四个非结构蛋白质，赂1、赂2、赂3与赂4，涉及病毒复制，以及5个结构蛋白质，是由壳体(C)与包膜蛋白(E;E1、E2、E3与6K)组成，它们被合成为多蛋白并且被壳体自动蛋白酶与信号酶切除(Strauss, Microbiol, Res. 58，491 (1994))。分析真核表现载体编码来自 37997 与 LR2006 0PY-1 株的 C-E3-E2-6K-E1 (C-E37997 与 C-E0PY-1)产生 VLP的能力。质体C-E37997或C-E0PY-1或上述的表现载体E37997或是C0PY-1 (图2，上半部)转染至人类胚胎肾093T)细胞，以及用西方转印(图2A，下半部)确认表现。在转染 C-E37997或C-E0PY-1载体之后，在上清液中侦测到C与E/E2蛋白质，表示已经产生CHIKV VLP。使用浮力密度梯度沉降纯化VLP。来自37997株的VLP产量是10-20毫克/升，高于来自LR20060PY-1约100倍；因而选择37997做进一步VLP特性化与发展。相较于野生型 CHIKV的密度，净化的上清液的划分显示在密度1. 2克/毫升处E1/E2的高峰合并(图2B， 左)。电子显微镜检视37997的纯化部分显示VLP与野生型病毒具有相同的外型(图2B， 右)。冷冻电子显微镜与三维影重组假设二十面体对称，显示VLP具有外部直径65纳米，以及核心直径40纳米(图2C，左)。蛋白质免疫原性E1/E2醣蛋白组织成为240异源二聚体，组合成为80醣蛋白尖状物在VLP表面上配置T = 4类对称(图2C，左)接近类似辛德毕病毒(Sindbis virus)的结构。除此之外，核壳体核心的组织也类似于其它的亚法病毒。范例3 卩向应CHIKV，VLP比DNA疫苗诱导更有效力的中和抗体在Ribi佐剂存在或不存在下，用编码C-E或E(37997与LR20060PY-l)的DNA疫苗或来自37997的VLP(VLP37997)免疫的老鼠中，决定DNA与VLP疫苗的免疫原性。用VLP与佐剂注射老鼠产生最高量的中和反应对抗同源株37997(图3A，右半部；IC50，1 10, 703) 以及异源株LR20060PY-1 (图B，右半部；IC50，1 54, 600) 0当用编码来自两株C-E与E 的质体免疫作用诱导中和反应，这些反应比VLP免疫的老鼠低100倍(图3A、B ；左半部)。 这些结果指示VLP比DNA疫苗诱导更有效的中和抗体反应。为了在对人类具有强预测值的模式中定性VLP诱导的免疫反应，用VLP免疫恒河猴。用VLP37997或PBS单独注射猴子做为控制组。测试免疫与控制组猴子的血清对抗 CHIKV 37997与LR2006 0PY-1假型慢病毒载体。在初始免疫作用之后，用VLP免疫的所有非人类灵长类(NHP)针对同源与异源株发展许多中和抗体，在刺激之后更为增加(图3C ； 左半部37997，右半部LR2006 0PY-1)。为了确认这些抗体中和感染的病毒，进行蚀斑减少中和作用测试(PRNT)对抗CHIKV LR2006 0ΡΥ-1。来自免疫猴子的抗血清诱导中和抗体反应对抗LR2006 0ΡΥ-1滴定量(titer)超过1 40，000 (图3D)。这些数据说明使用假型慢病毒载体的中和抗体与PRNT分析相关联，以及所有的免疫猴子产生有效的中和抗体反应对抗CHIKV。范例4 初始VLP免疫作用保护对抗CHIKV感染的病毒血症与发炎结果在最终免疫作用后15周，通过静脉内挑战(intravenous challenge) VLP免疫的猴子或使用高量LR2006 0PY-1病毒，决定VLP疫苗保护对抗感染的能力。如同人类，单核球细胞数量增加测量NHP感染造成非致命的病毒血症与前发炎反应。控制组猴子在6小时开始有病毒血症，并且持续直到挑战后72小时，然而所有的免疫猴子完全控制挑战病毒(图 4A)。同样地，挑战后4天，相较于接种疫苗的猴子，控制组猴子的单核球数量明显增加(图4B，控制组vs. VLP ；ρ = 0. 0036)。这些数据显示免疫作用保护对抗感染的病毒血症与发炎结果。为了定义这些动物中的保护机制，使用采用转换模式(adoptive transper model), 检测免疫IgG是否可保护对抗致命挑战的问题。范例5 =CHIKV VLP诱导的体液免疫反应提供保护对抗CHIKV感染先前的研究已经显示免疫缺陷老鼠具有缺陷型式I IFN传信发展的严重感染，显示症状以及组织向性类似人类，以及提供模式评估保护的免疫机制。从免疫或控制组猴子纯化的总IgG被动转换至这些老鼠中。在IgG转换后M小时，用致命剂量的LR2006 0PY-1 皮肤内挑战接收者老鼠。纯化的CHIKV免疫IgG的接收者在感染后没有可侦测的病毒血症， 并且完全受到保护不受致命危害(图4C、D)。相对地，接收来自控制组猴子纯化IgG的所有老鼠显示严重的感染与病毒血症，并且全部死亡。这些结果显示CHIKV VLP诱导的体液免疫反应提供保护对抗CHIKV感染。如本申请所述，评估对抗CHIKV的VLP与质体DNA疫苗诱导交叉株系中和抗体的能力。用VLP的免疫作用显示交叉株系反应，并且比DNA疫苗高100倍，以及猴子显示保护对抗CHIKV感染的剂量高于所述领域可能遭遇的。再者，在相关的老鼠模式中，来自VLP免疫的猴子的抗体被动转换会保护对抗致命挑战，这说明体液反应对于保护对抗CHIKV是重要的。目前爆发的CHIKV热大部分发生在南亚，以及强调人类疫苗的需求。这些感染表示在 2005-2006年散播至印度洋几个岛之前，2004年首先在肯尼亚辨识的病毒已经散播。联合岛(Reunion Island)单独爆发感染M4，000人，整个血清阳性率35%。而后病毒散播至其它陆地，2008 年已知发生在 37 个国家(http://www. cdc. gov/ncidod/dvbid/chikungunya/ CH_GloblaMaphtml)，估计在印度、非洲、欧洲与南亚有1. 4-6. 5百万病例。在2009年，病例数持续增加，部分是因为目前CHIKV传染株已经适应新的载体，亚洲虎蚊、白纹伊蚊(Ae. Albopictus)，可存活在更温和的气候，包含欧洲与美国。CHIKV持续造成严重的发病率，以及造成严重的经济损失。虽然没有报导先前基孔肯尼亚传染病的发病率，但是在最新的爆发中超过260人的死亡直接与病毒有关。现今，发展安全与有效的 CHIKV疫苗的成功有限。活的CHIKV疫苗候选物造成志愿者的短暂关节痛。其它努力包含活的减毒疫苗，福尔马林处理过的疫苗、委内瑞拉马脑炎/CHIKV嵌合的活减毒疫苗以及一致性(consensus)为基础的 DNA 疫苗(Muthumani et al.，Vaccine 26,5128(2008))尚未被证明安全与有效。虽然CHIKV变化很广，个别株系之间有抗原性相关，因此可达到能对抗异源株系的疫苗(Harrison et al. ,Am. J. Trop. Med. Hyg. 16,786(1967))。VLP 疫苗的安全性与有效性通常使它们在后续研究中成为更有希望的候选物。已知相较于基于个别蛋白质的次单元疫苗，VLP是高免疫原性且诱导高量的中和抗体反应。所述VLP确实呈现病毒外貌以及在重复数组中的其它表面成分，有效诱导B细胞的辨识，刺激抗体分泌。此辨识造成B细胞信号与MHC第II类上升调节，促使产生高量专一性的抗体。来自其它病毒的VLP，包含B型肝炎病毒(HBV)以及人类乳突瘤病毒(HPV)， 诱导高量中和抗体反应，贡献至对人类的保护性免疫。本申请所述的疫苗代表第一次使用重组的VLP，预防亚法病毒感染。贸易、旅游或全球气候帮助全球蚊子物种的散播，并且可能潜在造成其它的亚法病毒爆发。这个疫苗发展的方法可证明对于其它增加的亚法病毒有用，包含西方、东方与委内瑞拉马脑炎病毒、阿尼昂尼昂病毒(ο，nyong-nyong virus)与罗其jf河病毒(Ross River virus)。
本申请是使用以下方法与材料而得到结果。载体建构(vector construction)如前所述，合成编码结构多蛋白C、El、E2、E3与6K(37997与LR2006 0ΡΥ-1, Genbank EU22470)(图 25)以及 EU224268 (图 24)) (Yang et al. ,Science 317,825(2007)) (GeneArt, Regensburg，德国)。用PCR放大编码多蛋白E3、E2、6K与El的质体，使用义股引子(sense primer) 5' GCTCTAGACACCATGAGCCTCGCCCTCCCGGTCTTG 3’ 以及反义股引子 5， TGGATCCTCATTAGTGCCTGCTAAACGACA 3，(37997)以及义股 5，GCTCTAGACACCATGAGTCTTGCCA TCCCAGTTATG 3，以及反义股 5，TGGATCCTCATTAGTGCCTGCTGAACGACA 3，(LR2006 0ΡΥ-Ι)。 插入^CbaI与BamHI位置用于选殖。每一个片段用^(bal/BamHI切过并且插入真核表现载体，受控于巨细胞病毒促进子/启动子，CMV/R(Yang et al.，Science 317,825(2007)) (C-E37997> C-Eqpy^ E37997 以及 Ε0Ρη)。为了确认表现 CHIKV C 与 E 蛋白质，使用 FuGENETM 6 Transfection Reagent Kit (Roche Diagnostics GmbH，德国)，用 3 微克的质体 DNA，依照制造商的建议使用。细胞培养在含有10%热去活化的胎牛血清(FBS) (GIBC0 BRL)的Dulbecco修饰Eagle培养液(DMEM ；GIBCO BRL)中，培养293T与293A (人类胚胎肾细胞)、Vero (非洲绿猴肾表皮细胞)、HeLa (人类子宫颈腺癌)、A549 (人类肺癌)以及BHK (婴儿仓鼠肾细胞)。产生假型慢病毒载体产生来自不同CHIKV株的醣蛋白的慢病毒载体。表现荧光酵素报告基因的重组慢病毒载体的产生如前所述(Naldini et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93,11382(1996), Yang et al.，Science 317,825 (2007)) 简单地说，293T细胞共同转染500纳米克来自 E37997或E0PY-1的CHIKV E质体、7微克的转导(transfucing)载体编码荧光酵素报导基因(pHR’ MV-荧光酵素质体)，以及7微克的封装载体，表现人类免疫缺陷病毒-1 (HIV-I) 结构蛋白(pCMVaR8. 2)。2微克的囊泡口腔炎病毒醣蛋白(VSV-G)、2微克的pNGVL_4070A 双嗜性MuLV gp70表现载体或500纳米克的空载体分别作为这些假型报导的正与负控制。 在磷酸钙转染anvitroger^CarlskicbVA)隔夜之后，补充新鲜培养液。48小时之后，收取上清液，用0.45微米针筒过滤膜过滤、储存分装，冰冻在-80°C。用HIV-I Gag pM的量将这些病毒标准化。如前述的方法，在感染前根据HIV Gag pM辆，将转染72小时候收取的 CHIKV 假型慢病毒载体长规化(normalized) (Yang et al.，Science 317,825 (2007)) 用老鼠与猴子抗血清中和CHIKV E假型慢病毒载体中和作用分析如前述方式进行(Yang et al. ,Science 317,825 (2007)) 在感染前一天，在96槽盘中的每一槽中，放置IO4 细胞。编码荧光酵素的CHIKV E-假型病毒在体先用序列稀释滴定。在加入病毒血清溶液至细胞(96槽盘，每槽IO4细胞，50微克/槽，三重复)之前，在室温下，同样量的假型慢病毒载体(pM量约50ng/ml)与所指示的老鼠抗血清培养60分钟。来自非免疫老鼠或猴子的血清是作为负控制。培养M小时之后，使用细胞溶溶缓冲液(Cell Signal)溶融细胞，以及根据制造商的流程，在用“荧光酵素分析试剂”(Promega，Madison, WI)培养之后，使用 Microbeta. JET(PerkinElmer，Turku,
Finland)测量荧光酵素活性。抑制质计算如下抑制(％ ) = [1_ (假型慢病毒载体中荧光酵素活性(cps)用所指示稀释倍数的老鼠抗血清培养感染细胞)/(假型慢病毒载体中荧光酵素活性(cps)用相同稀释倍数的非免疫老鼠抗血清培养感染细胞)]xl00。用软件 (第5版)计算IC50。电子显微镜在国家癌正研究所的影像分析实验室检测VLP的型态。用Optipr印密度离心分离VLP，所述VLP而后在PBS中与4%甲醛混合。负染色电子显微镜用于病毒诊断如前所述 (CRC Press,Boca Raton，FL，1988)。简而言之，在碳覆盖的R)rmvar-filmed铜栅(Tousimis Research Corp.，Rockville, MD)上，放置1. O微升的样品，使得附接VLP。加入2微升的 1 % PTA 溶液(磷钨酸，ρΗ7· 0) (Fisher Scientific Co.，Fairlawn, NJ)，负染色所述 VLP。 而后用电子显微镜(Hitachi H7000,日本东京)，在75kV操作检视所述栅。使用CXD相机 (AMT, Danvers, MA)拍摄数字影像。冷冻电子显微镜与影像分析基孔肯尼亚VLP在液体乙烷中的孔栅上被快速冷冻。用CM300 FEG显微镜以电子剂量程度约20e/A2，在47K放大倍数下记录影像。使用Nikon扫描仪，以6. 35微米像素数字化所有的显微照片。使用EMAN2包装中的程序e2boXer，把个别颗粒影像框起来(Tang et al.，J Struct. Biol. 157, 38 (2007)) 决定 CTF 参数，以及从 EMAN 包装(Ludtke et al.， J Struct. Biol. 128,82(1999))使用CTFIT程序翻转相。使用分配的2_、3_与5-倍图，在 EMAN中建构初始模式，以及假设二十面体对称性，在EMAN中精炼初始模式。并入最终重组的颗粒数是1489，基于0.5 Fourier shell关联门坎，最终分辨率是18A。浮力密度梯度沉降分析与VLP的纯化如前述方法，进行浮力密度梯度分析与VLP的纯化(Akahata et al.，J. Virol. 9， 626(2005))。简单地说，得自293的悬浮细胞株O. 5xl08细胞)(Invitrogen)依照制造商的建议流程，转染^3feCtin转染试剂(Invitrogen)以及125微克的C-E37997 质体。在转染后72小时收取上清液，通过0. 45微米孔径的过滤膜过滤，而后在60 % Optiprep (Iodixanol)培养液(Invitrogen)分层，在 50, OOOx g 用 Surespin 630 转子(Sorvall)离心1. 5小时。移除上清液，留下病毒戴上方4毫升，以及混合至最终浓度20%的OptiPr印。用NVTlOO转子(Beckman)在360，OOOx g离心3.5小时，形成密度梯度。每一部分收集500微升、秤重，以及制作所述部分的密度图。每部分取20微升， 用 4% -15% SDS-PAGE 胶体分离，转印至 Lnmobilon-P 膜，以及用 CHIKV S-27 株(ATCC， VR-1241AF)注射的老鼠血清以及山羊抗老鼠免疫球蛋白连结至辣根过氧化酶(Santa Cruz Biotechnology)进行点印。老鼠与猴子的免疫作用与挑战依照制造商的流程建议，每只老鼠使用60微升正常盐水中19微克的VLP (相当于约 10 微克的 E1/E2)与 60 微升的 Ribi 溶液(Sigma Adjuvant system, Sigma-Aldrich)。 用正常盐水中的VLP或是Ribi，总体积120微升，注射雌性6至8周大BALB/c老鼠的右与左四头肌，在第2周与第6周注射两次。对于DNA疫苗组，老鼠右与左四头肌注射100微升正常盐水中总量15微克纯化的质体C-E37997、E37997、C-E0PY-1或是E0PY-1，在第0、3与 6周共三次。每组有5只老鼠皆被注射。在最后注射后10天，收集血清与脾脏。在猴子实验中，在第0、4与M周，重量3-4公斤的恒河猴(Macaca mulatta)的前四头肌肌肉注射1毫升PBS中20微克的VLP (VLP组)或是1毫升PBS (控制组)。每组有六只猴子皆被注射。在第_14、0、10、观、8、56、70、161与178天，收集血液，测量抗体量。 通过静脉注射，用1010PFU的CHIKV (LR2006 0PY-1)挑战猴子(每组η = 3，从各组随机选择)。在0、6、24、48、72、96、120与168小时，收集血液测量病毒血症。挑战之后168小时， 牺牲猴子。使用血液分析器(IDEXX Laboratories Inc. ,ffestbrook,Maine)测量全部的血液细胞。血液是EDTA抗凝结，使用20-22 口径(gauge)针以及针筒或是真空管。每个月移除的最大血液量不超过20% (iaiil/kg)，任何单一次移除量不超过15% (9ml/kg)。由动物照顾与使用委员会、疫苗研究中心(VRC)、过敏与感染疾病的国家研究中心 (http://www. niaid. nih. gov/vrc)，检视与核准所有的动物实验，以及根据所有相关的联邦与国家卫生研究院的规则进行。病毒制备如前所述，制备CHIKV(LR2006 0PY-1)，以及决定病毒量(Tsetsarkin et al.， PLoS. Pathog. 3，e20K2007)与 Pastorino et al. ,J Virol. Methods 124，65 Q005))。简而言之，从质体CHIK-LR ic转录病毒RNA，用电穿孔转染至BHK-21细胞。分装来自转染细胞的上清液，以及滴定储存病毒，以及使用Vero细胞决定组织培养感染剂量50% (TCID50)终点滴定量。为了产生用于脊椎动物挑战的病毒，生长在T150的C6/36(AedeS albopictus) 细胞被储存病毒感染，感染重复数为0. 03。感染后48小时，收取上清液，分装以及滴定，决定Vero细胞的TCID5tl终端量。蚀斑分析用标准蚀斑减少中和测试(PRNT)测试血清样品的CHIKV中和抗体。简而言之，猴子血清在56°C加热去活化30分钟，以及在病毒稀释液((PBS/5% BSA)中稀释。稀释的血清样品与等体积的40PFUCHIKV(LR2006 0PY-1)混合，并且在37°C培养1小时。六槽盘中长满Vero细胞，用200微升的血清-病毒混合物预防接种，进行三重复，并且在37°C培养1 小时。培养盘用3毫升含有0.9%洋菜胶(Lonza Rockland,Rockland,ME)的培养液覆盖， 并且在37°C含有5% CO2的培养箱中培养2天。而后加入第二层含有中和红与洋菜胶的培养液，并且在可见且能计算蚀斑之前将培养盘培养过夜。挑战后，用蚀斑分析测量猴子的病毒血症。六槽盘中长满Vero细胞，用200微升的血清-病毒混合物预防接种，进行二重复。在细胞中发现较低的血清稀释毒性(侦测限制稀释倍数是1 200 = 1000PFU/ml)， 所以血清稀释倍数为 1 200、1 400,1 800,1 1000,1 10，000 以及 1 100,000被动转换(passive transfer)免疫球蛋白以及挑战IFN α / β R+老鼠IFNa/β Κ+老鼠是由 Robert kder 与 Daniel D. Pinschewer 提供。从 CHIKV VLP免疫的猴子或是注射PBS (控制组)的猴子血清纯化IgG，使用HiTrapTM Protein G HP 管柱(GE Healthcare)，依照制造商的建议流程进行。进一步使用Melon Gel IgG纯化套组纯化IgG，依照制造商的建议流程进行。纯化的IgG对PBS透析三次。在挑战的M小时之前，在每一只接收者IFNa / β R+老鼠尾巴静脉注射2毫克纯化的IgG(大约是来自200微克的血清)。用皮肤内注射方式，以30PFU的CHIKV (LR2006 OPY-1)挑战老鼠。用定量的RT-PCR 侦测 CHIKV RNA为了 RNA分离，血清样品在10，000旋转1小时，倒掉液体，加入1毫升的RNA-STAT 60 (Isotex Diagnostics, Friendswood, TX)。而后在室温培养样品5分钟，以及重新悬浮在 250微升的三氯甲烷震荡混合。样品在10，000旋转1小时，移除上层溶液，加入0. 5毫升异丙醇与10微升tRNA (10微克/毫升)，在_20°C沉淀过夜。样品旋转1小时，用冷的75%乙醇清洗，以及再旋转1小时。RNA重新悬浮在30微升无RNAse水中。为了进行RT-PCR，10% RNA加入TaqMan试剂(Applied Biosyste m, Foster City, CA)以及引子与探针(如下所列示)，在7700序列侦测系统(Applied Biosystem)中放大。简而言之，在48°C反转录样品 30分钟，在95°C放置10分钟，而后进行40个周期的95°C反应30秒以及60°C反应1分钟。 信号与已知浓度的含有LR2006 0PY-1序列的质体标准曲线比较，开始在IO7下至Icoly/mL 以及乘以10，得到侦测范围从40-108COpieS/mL。所有样品进行三重复。引子与探针是设计结合在El结构蛋白基因的高保留区域。引子序列CHIK-F 5' AAGCTCCGCGTCCTTTACCAAG 3，以及 CHIK-R 5，CCAAATTGTCCTGGTCTTCCT 3，。探针序列=CHICK-P FAM-CCAATGTCTTCAGC CTGGACACCTTT-TAMRA，如前所述(Huang et al.，J. Virol. 78,12557(2004) ；Pastorino et al.，J Virol. Methods 124,65 (2005)) 其它实施例从上述描述说明，可知本发明可具有变化与修饰，用来符合不同的使用与条件。这些变化的实施例也在本发明的范围内。本申请变量的任何定义中组件表列包含定义变量为任何单一组件或所列组件的组合(或次组合)。本申请的实施例包含任何单一实施例或是任何其它实施例或其部分的组合。本申请说明书中提到的所有专利与公开案内容并入本申请作为参考，犹如特定且个别所指的每一独立的专利与公开案并入本申请作为参考。
权利要求
1.一种类病毒颗粒(VLP)，包括一或多基孔肯尼亚病毒结构多肽。
2.如权利要求1所述的VLP，其中所述结构多肽是选自于壳体与包膜蛋白E3、E2、6K与 El组成的群体。
3.如权利要求1所述的VLP，其中所述VLP包括包膜蛋白E3、E2、6K与El。
4.如权利要求1所述的VLP，其中所述VLP包括多蛋白，所述多蛋白包括 C-E3-E2-6K-E1。
5.一种分离的多核苷酸，编码权利要求1-5中任一类病毒颗粒。
6.如权利要求5所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包括C-E3-E2-6K-E1 的基孔肯尼亚病毒多蛋白。
7
8.一种表现载体，包括编码一或多基孔肯尼亚病毒结构多肽的多核苷酸。
9.如权利要求8所述的表现载体，其中所述多核苷酸编码一或多结构多肽，所述结构多肽是选自壳体(C)与包膜蛋白E3、E2、6K与El组成的群组。
10.如权利要求8所述的表现载体，其中所述多核苷酸编码包膜蛋白E3、E2、6K与E1。
11.如权利要求8所述的表现载体，其中所述多核苷酸编码包括C-E3-E2-6K-E1的基孔肯尼亚病毒多蛋白。
12.如权利要求8所述的表现载体，其中所述表现载体可在原核或真核细胞中表现。
13.如权利要求8所述的表现载体，其中所述结构多蛋白是得自基孔肯尼亚37997或 LR2006 株系。
14.如权利要求8所述的表现载体，其中所述载体包括CMV/R启动子。
15.如权利要求8所述的表现载体，其中所述表现载体是C-E37997或C-E0PY-1。
16.一种原核或真核细胞，包括权利要求8-15中任一项的所述表现载体。
17.一种免疫原组合物，包括有效量的权利要求1-5的类病毒颗粒。
18.一种免疫原组合物，包括有效量的VLP，所述VLP包括基孔肯尼亚结构多蛋白，所述基孔肯尼亚结构多蛋白包括C-E3-E2-6K-E1与佐剂。
19.一种免疫原组合物，包括有效量的权利要求8-15任一项的表现载体。
20.如权利要求17-19中任一项的免疫原组合物，其中所述VLP在个体中诱导免疫反应。
21.如权利要求17-19中任一项的免疫原组合物，其中所述免疫反应在个体中治疗或预防基孔肯尼亚感染。
22.如权利要求17-19中任一项的免疫原组合物，其中所述VLP诱导抗体对抗同源或异源株系的基孔肯尼亚。
23.如权利要求17-19中任一项的免疫原组合物，其中所述佐剂是免疫刺激剂。
24.如权利要求17-19中任一项的免疫原组合物，其中所述佐剂是选自Ribi、铝盐、胞壁酰肽、细菌细胞壁成分、皂素佐剂组成的群组。
25.一种疫苗，包括有效量的一或多基孔肯尼亚病毒结构多肽，选自壳体(C)与包膜蛋白E3、E2、6K与El所组成的群组。
26.一种疫苗，包括有效量的权利要求1-5任一项的类病毒颗粒或包括多蛋白，所述多蛋白包括 C-E3-E2-6K-E1。
27.一种疫苗，包括编码基孔肯尼亚结构多肽或其片段的多核苷酸。
28.如权利要求27的疫苗，其中所述基孔肯尼亚结构多蛋白是由权利要求8-15任一项的表现载体编码。
29.如权利要求27的疫苗，其中所述表现载体包括CMV/R启动子。
30.如权利要求M的疫苗，其中所述疫苗是DNA疫苗。
31.一种在个体中诱导免疫反应对抗基孔肯尼亚的方法，所述方法包括对所述个体给予有效量的权利要求14-24中任一项的免疫原组合物。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述免疫原组合物包括一或多基孔肯尼亚病毒结构多肽，选自壳体(C)与包膜蛋白E3、E2、6K与El组成的群组。
33.如权利要求31所述的方法，其中所述免疫原组合物包括多蛋白，所述多蛋白包括 C-E3-E2-6K-E1。
34.如权利要求31所述的方法，其中所述方法在个体中诱导中和抗体。
35.一种用于个体中治疗或预防基孔肯尼亚感染的方法，所述方法包括对所述个体给予有效量的权利要求21-23中任一项的疫苗或权利要求14-24中任一项的免疫原组合物。
36.如权利要求31或35所述的方法，其中一或多次剂量给予所述疫苗或免疫原组合物。
37.如权利要求36所述的方法，其中给予所述疫苗或免疫原组合物一或多次初始免疫作用以及一或多次刺激免疫作用。
38.如权利要求37所述的方法，其中在一、二、三、四、五、六、七或八周间隔，给予所述初始免疫作用。
39.如权利要求37所述的方法，其中在所述初始免疫作用之后，两周、一个月、两个月或三个月给与所述刺激免疫作用。
40.如权利要求37所述的方法，其中所述免疫作用保护所述个体对抗病毒血症或感染的发炎结果。
41.如权利要求35所述的方法，其中所述方法保护免于致命。
42.一种用于产生类病毒颗粒的方法，所述方法包括在细胞中表现一或多基孔肯尼亚结构蛋白，可自身组合形成类病毒颗粒。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述方法更包括分离所述类病毒颗粒。
44.如权利要求42所述的方法，其中所述基孔肯尼亚结构蛋白是选自壳体(C)与包膜蛋白E3、E2、6K与El组成的群组。
45.如权利要求42所述的方法，其中所述基孔肯尼亚结构蛋白是存在基孔肯尼亚结构多蛋白中。
46.一种类病毒颗粒(VLP)，包括一或多亚法病毒结构多肽。
47.如权利要求42所述的VLP，其中所述结构多肽是壳体或是包膜多肽。
48.如权利要求43所述的VLP，其中所述亚法病毒是选自基孔肯尼亚病毒、辛德毕病毒、东方马脑炎病毒(EEE)、西方马脑炎病毒(WEE)以及委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)组成的群组。
49.一种分离的多核苷酸，编码权利要求44-46中任一项的类病毒颗粒。
50.一种表现载体，包括编码一或多亚法病毒结构多肽的多核苷酸，其中所述亚法病毒是选自基孔肯尼亚病毒、辛德毕病毒、东方马脑炎病毒(EEE)、西方马脑炎病毒(WEE)以及委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)组成的群组。
51.一种免疫原组合物，包括有效量的权利要求44-46中任一项的类病毒颗粒。
52.一种疫苗，包括有效量的一或多亚法病毒结构多肽或编码一或多亚法病毒结构蛋白的多核苷酸，其中所述亚法病毒是选自基孔肯尼亚病毒、辛德毕病毒、东方马脑炎病毒 (EEE)、西方马脑炎病毒(WEE)以及委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)组成的群组。
53.一种在个体中诱导免疫反应对抗亚法病毒的方法，所述方法包括对所述个体给予有效量的权利要求51的免疫原组合物。
54.如权利要求53的方法，其中所述免疫原组合物包括一或多亚法病毒结构多肽。
55.如权利要求53的方法，其中所述方法在所述个体中诱导中和抗体。
56.一种用于在个体中治疗或预防亚法病毒感染的方法，所述方法包括对所述个体给予有效量的权利要求44的疫苗或权利要求47的免疫原组合物。
57.一种套组，包括权利要求1-5中任一项的VLP，以及使用说明。
58.一种套组，包括权利要求13-19或41-43中任一项的免疫原组合物，以及在个体中的使用说明。
59.如权利要求58的套组，其中所述免疫原组合物提供在第一容器中，以及第二免疫原组合物提供在第二容器中，以及初始刺激免疫作用的使用说明。
60.如权利要求58的套组，其中在所述第二容器中的所述免疫原组合物包括VLP、病毒多肽或病毒多核苷酸。
61.一种用于辨识基孔肯尼亚病毒进入真核细胞的方法，所述方法包括表现基孔肯尼亚病毒报导物以及选自C、E3、E2、6K与El的基孔肯尼亚多肽的细胞接触候选化合物，以及分析病毒进入，其中相较于控制细胞，减少病毒进入所述细胞的候选化合物被辨识为基孔肯尼亚病毒进入的抑制剂。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述候选抑制剂是抗体或其片段或小分子。
63.一种用于辨识基孔肯尼亚病毒进入的抑制剂的方法，包括表现基孔肯尼亚病毒报导物的细胞接触候选抑制剂以及包括报导基因的假型病毒；以及测量所述细胞中所述报导基因的表现，其中相较于控制细胞，减少所述报导基因表现的化合物被辨识为抑制病毒进入。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述假型病毒包括一或多基孔肯尼亚病毒包膜蛋白。
65.如权利要求63所述的方法，其中一或多包膜蛋白选自E3、E2、6K与El组成的群组。
66.如权利要求63所述的方法，其中所述假型病毒是慢病毒。
67.如权利要求63所述的方法，其中所述候选抑制剂是抗体或其片段，或小分子。
68.一种类病毒颗粒(VLP)，包括一或多基孔肯尼亚病毒结构多肽，用于治疗或预防基孔肯尼亚感染。
69.一种用于治疗或预防基孔肯尼亚感染的方法，所述方法包括给予类病毒颗粒 (VLP)，所述类病毒颗粒包括一或多基孔肯尼亚病毒结构多肽，以及所述给予类病毒颗粒是在给予一或多另一免疫原组合物、抗病毒或抗生素剂之前、之后或同时或任何其它顺序。
全文摘要
本发明提供用于预防或治疗一或多基孔肯尼亚病毒株系与其它亚法病毒媒介疾病的组合物与方法。
文档编号C12N15/63GK102317308SQ200980155476
公开日2012年1月11日 申请日期2009年11月24日 优先权日2008年11月26日
发明者G·J·纳贝尔, S·S·拉奥, 赤旗航 申请人:美国国有健康与人类服务部