专利名称：检测葡萄黄斑类病毒的RT-qPCR检测试剂盒及寡核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测葡萄黄斑类病毒的实时荧光定量RT-PCR (RT-qPCR)检测试剂盒及寡核苷酸，属于检验检疫领域。
背景技术：
葡萄黄斑类病毒(Grapevineyellow speckle viroidl, GYSVd-1)属于马铃薯纺锤块莖类病毒科(Pospiviroidae),苹果锈皮类病毒属(Apscaviroid)。GYSVd-1为单链环状的RNA分子，长367个核苷酸残基，能形成类病毒典型的杆状二级结构。GYSVd-1与苹果锈皮类病毒(ASSVd)有37%的序列同源性，与马铃薯纺锤块茎类病毒科的其它类病毒也有一定的同源性。GYSVd-1缺乏该科大多数类病毒具有的中央保守区，但与ASSVd中央区序列保守，且都含有稳定的回文结构 。该类病毒可能通过嫁接传播和机械传播，Wah等发现其可以通过种子传播。自然条件下侵染葡萄(Vitis vinifera)。该病于1972年在澳大利亚首次发现，病原很长时间未能分离出来，病葡萄组织中也未观察到病毒粒子。直到1988年，澳大利亚研究表明其病原为葡萄黄斑类病毒(GYSVd-1和GYSVd-2)。之后，美国、法国、意大利、西班牙、日本相继报道有此病。我国辽宁、山东等地也见有此病发生。目前，国内外已报道检测类病毒的方法有指示植物法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、分子杂交、RT-PCR和基因芯片技术等，这些技术有的操作步骤繁琐，检测周期长，灵敏度低，有的易于造成交叉污染，出现假阳性结果。RT-qPCR技术是在常规PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术，是指在PCR反应体系中加入引物对的同时加入特异性荧光探针(TaqMan探针)，探针与模板特异性结合，其结合位点位于引物对之间，利用荧光信号累积实时监测整个PCR过程。该技术可以采用绝对定量和相对定量两种方式实现定量检测，其中绝对定量是目前采用最多的一种，但是需要采用外标准品的定量制备来实现。在RT-qPCR定量检测中，这些外标准品的制备成为其能否准确定量的关键。RT-qPCR整个过程在全封闭的状态下进行片段扩增及产物分析，有效地减少了污染及对人体的危害。该技术具有特异性强、灵敏度高、自动化程度高、检测简单快速、技术易于掌握等特点，是快速分子诊断的发展趋势。目前RT-qPCR技术已广泛用于病毒检测、细菌检测、植原体检测、转基因产品检测、线虫检测等诸多领域，但对葡萄黄斑类病毒的RT-qPCR检测尚未见公开报道。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的检测葡萄黄斑类病毒的寡核苷酸，包括引物和探针。本发明要解决的第二个技术问题是提供一种特异、灵敏、高效的检测葡萄黄斑类病毒的RT-qPCR检测试剂盒。本发明要解决的第三个技术问题是提供一种检测葡萄黄斑类病毒的RT-qPCR检测方法。
为解决第一个技术问题，本发明采用以下技术方案:一组检测葡萄黄斑类病毒的寡核苷酸，为序列表SEQ ID No:1至SEQ ID No:3所示的寡核苷酸，其中序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2分别为检测葡萄黄斑类病毒的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO:3为检测葡萄黄斑类病毒的荧光探针，具体为:引物GYSVd-1-FP:5，-CTTGTGGTTCCTGTGGTTTCAC-3，，(SEQ ID NO:1)；引物GYSVd-1-RP:5，-CCTCTGCCCCTATCTTCTTCTTT-3，，(SEQ ID NO:2)；探针GYSVd-1-P:5’ -AAGGCCGCCGCGGACCTG-3’，(SEQ ID NO:3);该探针的 5’ 端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团BHQ1。上述引物和探针扩增的目标片段长度为 69bp。为解决第二个技术问题，本发明采用以下技术方案:本发明提供了一种检测葡萄黄斑类病毒的RT-qPCR检测试剂盒，包括以下组分:(I) RT-qPCR反应液，其包括序列表SEQ ID N0.1所示的正义引物，序列表SEQIDN0.2所示的反义引物，序列表SEQ ID N0.3所示的荧光探针，该探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团BHQl ；(2)阴性对照:采用无葡萄黄斑类病毒感染葡萄叶片，液氮研磨后，加入DEPC水充分研磨，然后5000rpm离心3min,取上清液提取RNA,溶解于DEPC水；(3)RNA标准品:为体外转录的非感染性RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQID N0.4所示的核苷酸序列。进一步地，上述RT-qPCR反应液还包括常规RT-qPCR反应所需的试剂和酶，优选地，本发明所述的RT-qPCR反应液还包括:10XPCR缓冲液(含Mg2+)，dNTP混合物，反转录酶，RNA酶抑制剂，Taq DNA聚合酶和DEPC水，均购自TaKaRa公司。为解决第三个技术问题，本发明还提供了检测葡萄黄斑类病毒的RT-qPCR检测方法，包括如下步骤:I)提取样品RNA;取携带葡萄黄斑类病毒的葡萄叶片，经RNA提取试剂盒(购自Qiagen公司)提取植物总RNA，也可以使用现有技术中已知的提取RNA的方法进行提取；2 )对提取的样品RNA进行RT-qPCR扩增:表I RT-qPCR反应体系
权利要求
1.一组检测葡萄黄斑类病毒的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸如序列表SEQ IDN0.1至序列表SEQ ID N0.3所示；其中序列SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2分别为检测葡萄黄斑类病毒的正义引物和反义引物，序列SEQ ID N0.3为检测葡萄黄斑类病毒的荧光探针。
2.根据权利要求1所述的检测葡萄黄斑类病毒的寡核苷酸，其特征在于，所述荧光探针序列SEQ ID NO:3的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团BHQ1。
3.权利要求1或2所述的检测葡萄黄斑类病毒的寡核苷酸在制备检测葡萄黄斑类病毒试剂盒中的应用。
4.一种葡萄黄斑类病毒的RT-qPCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下组分: (1)RT-qPCR反应液，其包括:序列表SEQID N0.1所示的正义引物，序列表SEQ ID N0.2所示的反义引物，序列表SEQ ID N0.3所示的荧光探针，所述荧光探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团BHQl ； (2)阴性对照； (3)RNA标准品:为体外转录的非感染性RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQIDN0.4所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-qPCR反应液还包括:含Mg2+的PCR缓冲液，dNTP混合物，反转录酶，RNA酶抑制剂，Taq DNA聚合酶和DEPC水。
6.一种葡萄黄斑类病毒的RT-qPCR检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: 1)提取样品RNA； 2)对提取的样品RNA进行RT-qPCR扩增；其中，使用序列表SEQID N0.1所示的正义引物，序列表SEQ ID N0.2所示的反义引物，序列表SEQ ID N0.3所示的荧光探针，所述荧光探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团BHQl ； 3)根据RT-qPCR反应体系的荧光强度进行结果判定。
全文摘要
本发明公开了一种检测葡萄黄斑类病毒的RT-qPCR检测试剂盒及寡核苷酸。具体地，本发明提供了一组检测葡萄黄斑类病毒的寡核苷酸，为序列表SEQ ID No1和序列表SEQ ID No3所示，其中序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为检测葡萄黄斑类病毒的正义引物和反义引物，序列SEQ ID No.3为检测葡萄黄斑类病毒的荧光探针。本发明还提供了含有上述引物和探针的检测试剂盒及其检测方法，可达到准确定量待测样品中GYSVd-1的目的。
文档编号C12Q1/70GK103225002SQ201310177809
公开日2013年7月31日 申请日期2013年5月14日 优先权日2013年5月14日
发明者邓丛良, 赵晓丽, 刘若思, 吕玉峰, 梁新苗, 边勇 申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局