基于VP7基因的牛轮状病毒qPCR检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供基于VP7基因的牛轮状病毒qPCR检测试剂盒，包含VP7基因保守序列特异性引物、逆转录酶、耐热DNA聚合酶（Taq酶）等成分，检测的最高稀释度可达10-5～10-4，定量检测线性范围可达10-1拷贝/μL，对其它病毒核酸、细菌和阴性对照无任何扩增，本检测试剂盒快速、敏感、特异，可用于粪便和血液等多种样本中轮状病毒的定量检测。
【专利说明】基于VP7基因的牛轮状病毒qPCR检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基于VP7基因的牛轮状病毒qPCR检测试剂盒，属于生物【技术领域】。
[0002]
【背景技术】
[0003] 轮状病毒（rotavirus，RV)是世界范围内引发婴幼儿和幼龄动物严重脱水性腹泻 的重要原因。轮状病毒性胃肠炎是流行广泛的人兽共患病，尤其是幼龄动物及婴幼儿的一 种急性肠道传染病，以腹泻和脱水为特征，病死率可达50%。轮状病毒的基因组由11个不 连续的dsRNA片段组成，分别编码6个结构蛋白（VP1?VP4、VP6、VP7)和5个非结构蛋白 (NSP1?NSP5);其中VP7和VP4构成外层衣壳，VP7具有血清型特异性，与致病性有关，可 刺激机体产生保护性抗体。VP7是一种N-联低聚甘露糖糖蛋白，为病毒外膜的重要糖蛋白 和主要中和抗原，并决定病毒的G血清型。
[0004] 随着分子生物学技术、核酸分子杂交技术的不断发展，基因检测技术已越来越多 的应用于人畜传染病的诊断等诸多领域。这些技术针对待测病毒核酸序列设计特异性引 物，具有特异性强、敏感性高、准确性高等优点。PCR技术灵敏度更高，可检测储存较长时间 的样本及多样环境样本，其扩增产物可用于基因研究工作。但是目前尚无牛轮状病毒诊断 的专用试剂盒。本技术发明根据牛轮状病毒（bovine rotavirus, BRV)VP7的基因保守序 列，设计特异性引物，建立了实时荧光定量PCR (qPCR)检测方法，并在此基础上研发出快 速准确的诊断与检测试剂盒。
【发明内容】
[0005] 试剂盒组成与保存期检测试剂盒含VP7基因保守序列特异性引物、特异性荧光探 针、逆转录酶、耐热DNA聚合酶（Taq酶)等成分组成，运用实时荧光定量PCR (qPCR)方法检 测。
[0006] 试剂盒保存期达6个月。
[0007] 其主要特点 特异性强，根据VP7基因保守序列设计特异性引物，通过实验验证，本试剂盒可以检测 A组病毒，而对BVDV、BCV、PEDV等其它病毒核酸和细菌无任何扩增，阴性对照亦无扩增。 (附图1) 灵敏度高，检测的最高稀释度可达1〇_5?1〇_4。定量检测线性范围可达ΚΓ1拷贝/ μ L。 (附图2) 总之，本检测试剂盒快速、敏感、特异，可用于粪便和血液等多种样本中轮状病毒的定 量检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0008] 图1是本技术发明基于VP7基因的牛轮状病毒qPCR检测试剂盒的特异性。
[0009] 图2是本技术发明基于VP7基因的牛轮状病毒qPCR检测试剂盒的敏感性。
[0010] 注：Μ为100bp DNA Marker; 1-2泳道分别为空白和阴性对照；3-7泳道分别 为质粒10倍梯度系列稀释（103，102，10 1，10°和ΚΓ1)。
【具体实施方式】
[0011] 样品采集与处理 (1)组织样品处理。每份组织分别从三个不同的位置称取样品约lg，用手术剪剪碎混 匀后取0. 05g于研磨器中研磨，加入1. 5 mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1. 5 mL灭菌 离心管中，8000rpm离心2min，取上清液ΙΟΟμ?于1. 5mL灭菌离心管中。
[0012] (2)全血样品处理。待血凝后取血清ΙΟΟμ?，置1. 5mL灭菌离心管中。
[0013] (3)阳性对照处理。取阳性对照10〇μ?，置1. 5mL灭菌离心管中。
[0014] (4)阴性对照处理。取阴性对照100 μι,置1. 5mL灭菌离心管中。
[0015] RNA 提取 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液60〇μ?，充分颠倒混匀，室温 静置3?5min。将液体吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液体时尽量不要吸到悬 浮杂质，以免离心时堵塞吸附柱），13000rpm离心30s，弃去收集管中液体，套上收集管。向 吸附柱中加入60〇μ?洗液，13000rpm离心30s，弃去收集管中液体，套上收集管。重复此步 骤。再空柱13000rpm离心2min。将吸附柱移入新的1.5 mL离心管中，在膜中央加入洗脱 液25μ?，室温静置lmin，13000rpm离心30s，获得总RNA。 RT-PCR 每份总体积2〇μ?，含16. 8PLRT_PCR反应液（用前混匀），1. 2 μ?酶混合液，2PL模板 RNA。扩增条件为 42°C 45 min，95°C 3min ;扩增条件为 95°C 30s，60°C 30s，72°C 25s，35 个 循环；72°C延伸10 min。
[0016] 电泳 将PCR扩增产物10 μ?混合2PL上样缓冲液，点样于琼脂糖凝胶孔中，以110?120V 电压于50倍稀释的TAE电泳缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果。
[0017] 结果描述及判定 阈值线设定于刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况 进行调整。阳性对照ct值<30并出现特定的扩增曲线，阴性对照无 Ct值并且无特定扩 增曲线，实验结果成立；被检样品Ct值<30并出现特定的扩增曲线为RV阳性；被检样品 30 < Ct < 37并出现特定的扩增曲线，需重新再做一次后进行结果判定，如两次结果相同， 可判定为阳性；被检样品Ct值> 37时，超过本方法检测灵敏度范围，判定为阴性。
[0018] 使用注意事项 所有接触病料的物品均应分隔和处理，以免污染实验室。整个PCR操作过程应在配液 区、模板提取区、扩增区、电泳区分别完成，尽量缩短操作时间。反复冻融试剂会减低检测灵 敏度，请严格依照试剂盒说明书操作。
【权利要求】
1.本技术发明公开了 "基于VP7基因的牛轮状病毒qPCR检测试剂盒"，检测试剂盒由 VP7基因保守序列特异性引物、特异性荧光探针、逆转录酶、耐热DNA聚合酶（Taq酶）等成 分组成，运用实时荧光定量PCR (qPCR)方法检测，样本稀释度达ΚΓ5?10Λ定量检测线性 范围达ΚΓ1拷贝/ μ L，特异性强；以及包括样品的采集与处理、病毒RNA的提取、特异性引 物的设计、RT-PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳等操作方法及结果判定，本试剂盒具有快速、敏感、 特异的特点，降低了检测成本和时间，省时省力，可用于粪便和血液等多种样本中轮状病 毒的定量检测。
【文档编号】C12Q1/70GK104152579SQ201410345476
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月18日 优先权日:2014年7月18日
【发明者】魏锁成, 郭慧琳, 车团结 申请人:魏锁成, 郭慧琳, 车团结