用于检测啤酒花矮化类病毒的nasba扩增引物、试剂盒和检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测啤酒花矮化类病毒的NASBA扩增引物、试剂盒和检测方法，其上游引物、下游引物的序列分别为 SEQ ID NO:1～2，试剂盒包括NASBA扩增反应液A和NASBA扩增反应液B；检测方法包括：1）样品RNA的提取；2）进行啤酒花矮化类病毒的NASBA扩增和3）电泳检测。本发明适用于对啤酒花矮化类病毒进行快速检测确证，可广泛应用于农业生产及环境中的疫情监控及进出口贸易中该类病毒的监测及检测，操作极为简便，所需样品量小且对于模板RNA的质量要求较低。
【专利说明】用于检测啤酒花矮化类病毒的NASBA扩增引物、试剂盒和检测方法
[0001]【技术领域】:
本发明涉及一种用于检测啤酒花矮化类病毒的NASBA扩增引物，试剂盒和检测方法，属于植物病原的检测【技术领域】。
[0002]【背景技术】:
类病毒是迄今已知的引起植物病害的最小致病因子，为环状RNA分子，其全长基因组由246?399个核苷酸组成，能引起许多经济作物产生严重病害。根据其序列和结构的同源性、复制特性分为2个组，分别为马铃薯纺锤块茎类病毒组(PSTVd)和鳄梨日斑类病毒组(ASBVd)。啤酒花矮化类病毒(Hop stunt vroid)属于马铃薯纺锤块茎类病毒科啤酒花矮化类病毒属，通常含307个左右核苷酸。1970年，日本的Yamamoto等人首次在矮化的啤酒花上发现了啤酒花矮化类病毒。1985年，日本的Sano首次在葡萄上发现了 HSVd，经过15年的研究，认为HSVd的初侵染源为葡萄，在进化过程中逐渐适应了新的寄主。目前国内外已报道的HSVd寄主包括黄瓜、葡萄、桃、李、扁桃、杏等草本及木本植物。中国已经在啤酒花、桃、李、杏、葡萄、扁桃等植物上报道了 HSVd。因此，规范啤酒花矮化类病毒的检测鉴定方法一般操作规程，对于提高啤酒花矮化类病毒的检疫检验效率、防止啤酒花矮化类病毒的传入、传出，保护我国农业的安全生产，促进我国农产品的顺利出口，具有十分重要的意义。植物类病毒由于不显性侵染比较普遍，症状表现受环境温度的影响较大，而且几种鉴别植物对不同类病毒的反应症状相似，故难于应用生物测定的方法。由于类病毒不能产生任何蛋白质，所以也不能使用检测病毒的电镜、血清学方法。因此，选用分子生物学方法对啤酒花矮化类病毒进行检测。
[0003]NASBA (Nuleic and sequence based amplipicain, NASBA)即“核酸序列依赖性扩增”检测技术是一种经典的恒温扩增技术，适用于单链核糖核酸RNA —步扩增及检测，已广泛应用于人类及动植物病原的检测与诊断。NASBA是由一对引物引导的，在含有T7 RNA聚合酶、RNAseH,反转录酶AMV、NTP、dNTP及需要使用的各种反应缓冲液所组成的标准反应体系中，通过连续均一的体外特异性酶促反应实现核苷酸序列的等温扩增。
[0004]由于细胞壁中富含大量的多糖、酚类物质，植物病毒RNA的提取存在着稳定性差、重复性低、效率低等问题，加之在提取过程中RNA本身的自降解现象，病毒RNA的含量往往较低，对检测方法的灵敏度和稳定性提出了较高要求。同时由于多糖等物质对于Taq聚合酶的抑制作用，限制了 RT-PCR技术在葡萄、草莓、粮谷类等多酚含量较高的植物病毒RNA检测中的应用。由于NASBA技术的反转录过程被直接合并到扩增反应中，因此NASBA具备了适合于病原RNA的扩增、检测的特点，最适合各种RNA样品的分析，符合植物病毒检疫的要求，鉴于啤酒花矮化类病毒危害的严重性，加强环境中的的监控，提高检测效率和确证的准确度，对有效控制啤酒花矮化类病毒的传播，在现阶段具有重要的实际意义。
[0005]
【发明内容】
:
本发明要解决的技术问题是提供一种用于检测啤酒花矮化类病毒的NASBA扩增引物，同时提供一种检测的试剂盒和检测方法。其主要原理是利用一对引物引导，在含有T7 RNA聚合酶、RNAseH,反转录酶AMV、NTP、dNTP及需要使用的各种反应缓冲液所组成的标准反应体系中，通过连续均一的体外特异性酶促反应实现核苷酸序列的等温扩增NASBA，经过循环反复，使RNA不断扩增，对样品中的啤酒花矮化类病毒进行准确的检测。
[0006]本发明的实现，首先依据啤酒花矮化类病毒全基因组序列设计特异性引物，再提取待测样品的核糖核酸(RNA)，然后分别以特异性引物进行NASBA扩增，用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，最后根据NASBA扩增结果来判定样品中是否含有啤酒花矮化类病毒。
[0007]本发明解决上述技术问题采用的技术方案如下:
本发明用于检测啤酒花矮化类病毒的NASBA引物，其引物序列分别为SEQ ID NO:1?2。
[0008]SEQ ID NO:1:NA_P1:5，-aattctaatacgactcactatagggagGAATCCAGCGAGAGGCGTG-3，。
[0009]SEQ ID NO:2:NA_P2:5， -aattctaatacgactcactatagggagAGTACCTCCCTGCCTTGTTTT-3，。
[0010]检测啤酒花矮化类病毒的NASBA扩增试剂盒，包括如下组分:
(I)NASBA扩增反应液A的制备:
每25 μ L包括 10XAMV buffer 2.5 μ 1,6.25mmol /L NTPs 3 μ L, 10 mmol /L dNTPs
1.5 μ L, 10 μ mo I /L 引物 ΝΑ-Ρ1、ΝΑ-Ρ2 各 0.5 μ L,.双蒸水 9 μ L。
[0011]其中缓冲液为含40mmol /L PH8.5 Tris-HCL, 70 mmol /LKCL, 12 mmol /L MgCL2,5 mmol /L DTT 缓冲液。
[0012](2) NASBA扩增反应液B的制备:
0.5 U RNaseH, 32 U T7RNA 聚合酶，6.4 U AMV 反转录酶，2 μ L DMS0，0.1 μ LI mo I/L 二硫苏糖醇，0.25 μ L 10 mg /mL BSA，20 U RNA 酶抑制剂，
(3)NASBA扩增程序:
将待检样品RNA 3 μ L加入14 μ L反应液Α，在DNA扩增仪或水浴锅上65°C温浴5min,立即转入41°C温浴5 min,迅速加入4 μ L反应液B, 41 °C温育2 h,4 °C终止反应；
(4)NASBA扩增产物鉴定
反应产物用5%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果并进行判定。
[0013]本发明进一步提供了一种采用SEQ NO: 1、SEQ NQ:2特异性扩增引物检测啤酒花矮化类病毒的NASBA的方法，包括下列步骤:
I)样品RNA的提取
A、取0.1 g样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入1.5 mL离心管中，加入I mLTrizol Reagent,颠倒混勻，2°C ~8°C, 12000 g,离心 lOmin。
[0014]B、取上清，15°C~30°C，放置5min ;加入0.2 mL氯仿，用手剧烈震荡，勿涡旋振荡，15s。15°C ~3(TC，放置 2min~3min ;2°C ~8°C，12000 g，离心 15min。
[0015]C、小心吸取为600 μ?的上层水相，勿扰动中间相和下层相。加500 μ L异丙醇混合上清液，15°C ~30°C，放置 lOmin。2°C ~8°C, 12000 g，离心 lOmin。
[0016]D、去除上清液，沉淀中加入I mL 75%乙醇，洗涤；2°C ~8°C,7500 g，离心5min。
[0017]E、去除上清液,沉淀自然干燥后,将其溶于30 μ L -50 μ L无RNase的水中，即为待检模板RNA。
[0018]2)进行啤酒花矮化类病毒的NASBA扩增
A.在装有14μ L环介导等温扩增反应液A的反应管中加入3 μ L待检模板RNA，
B.在DNA扩增仪或水浴锅上65°C温浴5min，立即转入41°C温浴5 min,；
C.在反应管中迅速加入4μ L反应液B;
D.于41°C温育2h;
E.将金属浴调到4°C中止反应，3 min后取出；
3)电泳检测
取3 g琼脂糖，于100 mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5 mg/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3 mL?6 mLPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9 V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。如果扩增片段为262 bp，说明待检病毒是啤酒花矮化类病毒，如果没有出现262 bp扩增片段，则说明待检病毒不是啤酒花矮化类病毒。
[0019]本发明根据啤酒花矮化类病毒的序列高度保守区的设计了两个特异性内引物，该保守基因序列为具有啤酒花矮化类病毒的不同株系所共有，以保证从株系的水平上检测不同来源的啤酒花矮化类病毒的可靠性。本发明适用于对啤酒花矮化类病毒进行快速检测确证，可广泛应用于生产和环境中的病害监控、进出口贸易中该病毒的确证。
[0020]与现有技术相比，本发明的有益效果包括:
第一，便捷性。该发明在进行恒温扩增时，不需要昂贵的核酸扩增反应装置，整个过程始终在42 °C进行，无需热循环仪，仅I个普通的恒温水浴锅就可完成。
[0021]第二，精确度高。该发明酶循环反应的循环数少，不需高温变性步骤，相对于RT-PCR错配率较低，更适于检测和定量特异RNA。
[0022]第三，灵敏度高。该发明比起PCR技术，能用较少的循环便扩增出大量的目的基因，保证了检测的高敏感性。
[0023]第四，缩短周期。由于反转录过程被直接合并到扩增反应中，PCR大约需要20轮循环才能扩增16倍，而NASBA只需循环4~5轮即可达到10 6倍。
[0024]第五，降低了对植物RNA模板的质量要求。由于细胞壁中富含大量的多糖、酚类物质，植物病毒RNA的提取存在着稳定性差、重复性低、效率低等问题，加之在提取过程中RNA本身的自降解现象，病毒RNA的含量往往较低，对检测方法的灵敏度和稳定性提出了较高要求。由于该发明针对的模板是RNA，反应的产物也是RNA，反应的结果不受环境中DNA的影响。即使存在外来的双链DNA污染，但由于其不具备T7启动子序列，不可能被扩增，其次，该反应只在42 1:恒温条件下进行，不需高温变性步骤，所以NASBA反应流程不会受到外来双链DNA的污染，因此对于模板纯度和质量要求较低。
[0025]【专利附图】
【附图说明】:
图1为本发明对病株样品中NASBA扩增图谱:其中M:ssRNA Ladder marker ；1:健康葡萄；2:啤酒花矮化类病毒感病材料。
[0026]图2为本发明特异性结果图:其中M:ssRNA Ladder marker ；1:啤酒花矮化类病毒；2:苹果锈果类病毒；3:梨泡状溃疡类病毒；4:桃潜隐花叶病毒；5:苹果茎痘病毒；6:葡萄黄斑类病毒-2。
[0027]图3为本发明敏感性结果图:其中M: ssRNA Ladder marker ； 1-7: 1X10'
IX 10' I X 10' I X 10' I X 10' I X 1-6、I X I。-7 ng/ μ L，啤酒花矮化类病毒感病材料总 RNA。
[0028]图4为本发明的样品检测结果图。其中M: ssRNA Ladder marker ;1~24:其中1-6:进境法国葡萄苗(S1~S6) ；7~12:南水梨(S7~S12) ； 13-18:意大利葡萄苗(S13~S18)；19-24:丰水梨(S19~S24)。
[0029]【具体实施方式】:
为了更充分地解释本发明的实施方法，提供了用于检测啤酒花矮化类病毒NASBA试剂盒的实施实例。这些实施实例仅仅是解释，而不是限制本发明的范围。其中反转录聚合酶 AMV、RNaseH、RNase inhibitor、T7 RNA 聚合酶、dNTP、ssRNA marker、rNTP 均购于 NEWENGLAND B1LAB公司；PCR扩增试剂、DNA marker及等均购于北京天根公司。
[0030]实施例1:1材料
1.1病毒
啤酒花矮化类病毒为进境法国葡萄砧木苗分离物、意大利进境葡萄苗分离物、新疆葡萄苗和啤酒花分离物,苹果锈果类病毒(Apple scar skid viroid, ASSVd)、梨泡状溃瘍类病毒(/fear Blister Canker Viroid, PBCVd)、桃潜隐嵌纹类病毒{Peach latent mosaicriroit/, PLMVd)、苹果莖痘病毒stem pittingASPV)、葡萄黄斑类病毒-2
(Grapevine yellow speckle viroid, GYSVd-2)由 申请人:的实验室保存。
[0031]1.2 试剂
反转录聚合酶 AMV、RNaseH、RNase inhibitor、T7 RNA 聚合酶、dNTP、ssRNA marker>rNTP均购于NEW ENGLAND B1LAB公司；PCR扩增试剂、DNA marker及等均购于北京天根公司；
1.3引物
根据NCBI核酸序列数据库中啤酒花矮化类病毒的基因全长序列(登录号HM357802.1)，在保证扩增的兼并性和通用性的前提下通过比较分析啤酒花矮化类病毒高度保守区，设计5’端带有T7启动子序列NASBA反应引物(ΝΑ-P1、NA-P2)，设计完成后将引物在数据库的Primer-Blast模块下进行比对验证。
[0032]2 方法
2.1病毒RNA的提取
取0.1 g样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入1.5 mL离心管中，加入I mLTrizol Reagent,颠倒混勻，2°C ~8°C, 12000 g,离心 lOmin。取上清，15 °C ~30 °C,放置5min ;加入0.2 mL氯仿，用手剧烈震荡(勿涡旋振荡)，约15s。15°C ~30°C，放置2min~3min ；2V ~8°C, 12000 g，离心15min。小心吸取约为600 μ?的上层水相，勿扰动中间相和下层相。加 500 “1^异丙醇混合上清液，151:~301:，放置101^11。2°C ~8°C, 12000 g，离心 lOmin。去除上清液，沉淀中加入I mL 75%乙醇，洗涤；21:~81:，7500 g，离心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30 UL -50 μ L无RNase的水中，即为待检模板RNA。
[0033]2.2 NASBA 扩增体系 A.在装有14μ L环介导等温扩增反应液A的反应管中加入3 μ L待检模板RNA，
B.在DNA扩增仪或水浴锅上65°C温浴5min，立即转入41°C温浴5 min,；
C.在反应管中迅速加入4μ L反应液B;
D.于41°C温育2h;
E.将金属浴调到4°C中止反应，3 min后取出；
2.3电泳检测
取3 g琼脂糖，于100 mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5 mg/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3 mL?6 mLPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9 V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。预期产物大小为262 bp。见图1。
[0034]实施例2:特异性实验
1、提取啤酒花矮化类病毒、苹果锈果类病毒、梨泡状溃疡类病毒、桃潜隐花叶病毒、苹果茎痘病毒、葡萄黄斑类病毒-2的RNA，使用NASBA方法进行检测。
[0035]2、病毒RNA的提取
取0.1 g样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入1.5 mL离心管中，加入I mLTrizol Reagent,颠倒混勻，2°C ~8°C, 12000 g,离心 lOmin。取上清，15 °C ~30 °C,放置5min ;加入0.2 mL氯仿，用手剧烈震荡(勿涡旋振荡)，约15s。15°C ~30°C，放置2min~3min ；2V ~8°C, 12000 g，离心15min。小心吸取约为600 μ?的上层水相，勿扰动中间相和下层相。加 500 “1^异丙醇混合上清液，151:~301:，放置101^11。2°C ~8°C, 12000 g，离心 lOmin。去除上清液，沉淀中加入I mL 75%乙醇，洗涤；21:~81:，7500 g，离心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30 UL -50 μ L无RNase的水中，即为待检模板RNA。
[0036]3、扩增反应
Α、在装有14 μ L环介导等温扩增反应液A的反应管中加入3 μ L待检模板RNA，
B.在DNA扩增仪或水浴锅上65°C温浴5min，立即转入41°C温浴5 min,；
C.在反应管中迅速加入4μ L反应液B;
D.于41°C温育2h;
E.将金属浴调到4°C中止反应，3 min后取出；
4、NASBA产物电泳检测
取3 g琼脂糖，于100 mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5 mg/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3 mL?6 mLPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9 V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。电泳结果显示，使用NASBA方法进行检测啤酒花矮化类病毒、苹果锈果类病毒、梨泡状溃疡类病毒、桃潜隐花叶病毒、苹果茎痘病毒、葡萄黄斑类病毒-2的RNA，只有啤酒花矮化类病毒得到预期262 bp的扩增产物(见图2)。
[0037]实施例3敏感性实验
1、用DEPC水将啤酒花矮化类病毒病毒RNA模板液向下做10倍梯度稀释，依次为1X10°、ΙΧΙΟ'ΙΧΙΟ—^ΙΧΙΟ'ΙΧΙΟ'ΙΧΙΟ—'ΙΧΙΟ—6、1Χ10_7、1Χ10_8 μ g/μ L,各取2 μ L为模板分别进行NASBA扩增反应。
[0038]2、病毒RNA的提取取0.1 g样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入1.5 mL离心管中，加入I mLTrizol Reagent,颠倒混勻，2°C ~8°C, 12000 g,离心 lOmin。取上清，15 °C ~30 °C,放置5min ;加入0.2 mL氯仿，用手剧烈震荡(勿涡旋振荡)，约15s。15°C ~30°C，放置2min~3min ；2V ~8°C, 12000 g，离心15min。小心吸取约为600 μ?的上层水相，勿扰动中间相和下层相。加 500 “1^异丙醇混合上清液，151:~301:，放置101^11。2°C ~8°C, 12000 g，离心 lOmin。去除上清液，沉淀中加入I mL 75%乙醇，洗涤；21:~81:，7500 g，离心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30 UL -50 μ L无RNase的水中，即为待检模板RNA。
[0039]3、扩增反应
Α、在装有14 μ L环介导等温扩增反应液A的反应管中加入3 μ L待检模板RNA，
B.在DNA扩增仪或水浴锅上65°C温浴5min，立即转入41°C温浴5 min,；
C.在反应管中迅速加入4μ L反应液B;
D.于41°C温育2h;
E.将金属浴调到4°C中止反应，3 min后取出；
4、NASBA产物电泳检测
取3 g琼脂糖，于100 mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5 mg/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3 mL?6 mLPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9 V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。NASBA产物鉴定:电泳结果显示，啤酒花矮化类病毒使用NASBA方法能够得到10_7稀释倍数的模板(见图3)。
[0040]实施例4实际样品检测及对比实验
将从山东、新疆等地田间采集(2012至2014)的具有典型HSVd类症状的病样及实验室留样(进境法国(2013、2014)、意大利葡萄苗(2014)等)，分别采用NASBA、RT-PCR进行检测，比较两种方法的效果，以进一步评估LAMP方法的可靠性。
[0041 ] 1、实际样品NASBA检测I)病毒RNA的提取
取0.1 g样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入1.5 mL离心管中，加入I mLTrizol Reagent,颠倒混勻，2°C ~8°C, 12000 g,离心 lOmin。取上清，15 °C ~30 °C,放置5min ;加入0.2 mL氯仿，用手剧烈震荡(勿涡旋振荡)，约15s。15°C ~30°C，放置2min~3min ；
2V ~8°C, 12000 g，离心15min。小心吸取约为600 μ?的上层水相，勿扰动中间相和下层相。加 500 “1^异丙醇混合上清液，151:~301:，放置101^11。2°C ~8°C, 12000 g，离心 lOmin。去除上清液，沉淀中加入I mL 75%乙醇，洗涤；21:~81:，7500 g，离心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30 UL -50 μ L无RNase的水中，即为待检模板RNA。
[0042]2)扩增反应
Α、在装有14 μ L环介导等温扩增反应液A的反应管中加入3 μ L待检模板RNA，
B.在DNA扩增仪或水浴锅上65°C温浴5min，立即转入41°C温浴5 min ；
C.在反应管中迅速加入4μ L反应液B;
D.于41°C温育2h;
E.将金属浴调到4°C中止反应，3 min后取出；
3) NASBA产物鉴定紫外检测仪下观察电泳结果并记录，电泳结果显示，在10份样品中9份样品为阳性，其他样品为阴性(见图4)。
[0043]2、PCR 扩增
I)方法:普通RT-PCR反应条件为50 °C反转录30 min ；94 °C预变性2 min; 94 V 30s，53 °C 30 s，72 °C 30 s，循环反应 35 次；65 °C延伸 10 min。
[0044]2)琼脂糖凝胶电泳结果:在10份样品中，9份为阳性，其余为I份。
[0045]结论:利用上述NASBA和PCR方法同时检测实际样品，两种方法的符合率100%，但NASBA对设备要求更低，便捷性更高。
[0046]目前，啤酒花矮化类病毒是我国较为普遍、危害最为严重的类病毒病，引起的病害往往与其他病毒病易混淆。本发明的应用将有助于在诸多形态相近的病原症状中实现啤酒花矮化类病毒的快速鉴别。本发明可应用于幼苗的培育过程中，通过对病毒的快速高效检测，可以确保脱毒幼苗的质量和增产效果。本发明可对啤酒花矮化类病毒进行特异性鉴定，可应用于梨、桃、李种苗的进出口检疫、国内地区间调运以及病害调查等过程中。
【权利要求】
1.检测啤酒花矮化类病毒的NASBA扩增引物，其上游引物、下游引物的序列分别为SEQID NO:1 ?2。
2.一种检测啤酒花矮化类病毒的NASBA扩增试剂盒，包括如下组分: (1)NASBA扩增反应液A:
每25 μ L包括 1XAMV buffer 2.5 μ 1,6.25mmol /L NTPs 3 μ L, 10 mmol /L dNTPs1.5 μ L, 10 μ mo I /L 引物 ΝΑ-Ρ1、ΝΑ-Ρ2 各 0.5 μ L，双蒸水 9 Ml; 其中缓冲液为含 40 mmol /L PH8.5 Tris-HCL, 70 mmol /LKCL, 12 mmol /L MgCL2，5mmol /L DTT 缓冲液； (2)NASBA扩增反应液B: 0.5 U RNaseH, 32 U T7RNA 聚合酶，6.4 U AMV 反转录酶，2 μ L DMS0，0.1 μ LI mo I/L 二硫苏糖醇，0.25 μ L 10 mg /mL BSA，20 U RNA 酶抑制剂。
3.一种检测啤酒花矮化类病毒的NASBA方法，包括下列步骤: 1)样品RNA的提取 A、取0.1 g样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入1.5 mL离心管中，加入I mLTrizol Reagent,颠倒混勻，2°C ~8°C, 12000 g，离心 1min ； B、取上清，15°C ~ 3 (TC，放置5 m i η ;加入0.2 mL氯仿，用手剧烈震荡，不要涡旋振荡，15s ；15°C ~3(TC，放置 2min~3min ；2°C ~8°C, 12000 g，离心 15min ； C、吸取600PL的上层水相，勿扰动中间相和下层相；加500 μ L异丙醇混合上清液，15°C ~3(TC，放置 1min ；2°C ~8°C, 12000 g，离心 1min ； D、去除上清液，沉淀中加入ImL 75%乙醇，洗涤;2V ~8°C, 7500 g，离心5min ； E、去除上清液,沉淀自然干燥后,将其溶于30μ L -50 μ L无RNase的水中，即为待检模板RNA ； 2)进行HSVd的NASBA扩增 Α、在装有14 μ L环介导等温扩增反应液A的反应管中加入3 μ L待检模板RNA， B.在DNA扩增仪或水浴锅上65°C温浴5min，立即转入41°C温浴5 min ； C.在反应管中迅速加入4μ L反应液B; D.于41°C温育2h; E.将金属浴调到4°C中止反应，3 min后取出； 3)电泳检测 取3 g琼脂糖，于100 mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5 mg/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3 mL?6 mLPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9 V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。
【文档编号】C12Q1/68GK104450973SQ201410832857
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月29日 优先权日:2014年12月29日
【发明者】吴兴海, 张成标, 魏晓棠, 甘琴华, 张京宣, 邵秀玲, 历艳, 尼秀媚 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心