用于幽门螺杆菌23S rDNA基因突变分型的ARMS-qPCR的检测方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了用于幽门螺杆菌23S?rDNA基因突变分型的ARMS-qPCR的检测方法及试剂盒。本发明提供了用于鉴定幽门螺杆菌23S?rDNA基因型的DNA分子组合物，包括单独使用的DNA分子组合物A和DNA分子组合物B；本发明的实验证明，本发明设计的引物及其构成的试剂盒能快速、准确、高敏感度的检测胃粘膜组织中幽门螺杆菌23SrDNA基因特定位点突变。灵敏度高，不仅可以检测来源于胃粘膜活检组织，还可以检测石蜡包埋组织切片中游离DNA。
【专利说明】用于幽门螺杆菌23S rDNA基因突变分型的ARMS-qPCR的检测方法及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，尤其涉及用于幽门螺杆菌23S rDNA基因突变分型的ARMS-qPCR的检测方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002]幽门螺杆菌(Helicobaeter pylori, Hp)是一种常见的可长期定植于人类胃黏膜的革兰阴性微需氧杆菌，与许多上消化道疾病有着紧密的联系。全世界有超过半数的人感染Hp，而在我国的感染率为55%。Hp的感染给患者造成极大的痛苦，加重医疗负担。WHO把Hp列为同乙型、丙型肝炎一样，都是生物致癌物。以质子泵抑制剂(proton pumpinhibitor, PPI)结合阿莫西林和克拉霉素(或者甲硝唑)的三联疗法，是国内外公认的一线抗Hp感染治疗组合。克拉霉素属于大环内酯类抗生素，在体外有强大的杀菌作用，口服生物利用度高，对酸稳定。克拉霉素的抗菌机制是药物穿入菌体细胞内，与核糖体紧密结合，作用于23S rDNA V功能区的多肽转移环，抑制多肽转移酶，影响核糖体的位移过程，阻止肽链延长，从而抑制细菌的蛋白质合成。然而，由于克拉素的耐药的不断上升，一线疗法的成功率正在逐渐的下降。
[0003]细菌的耐药可分为原发性耐药和继发性耐药。原发性耐药是由于细菌缺少对药物敏感的靶位，或细菌具有天然屏障使药物无法进入菌体，继发性耐药是指由于抗生素的广泛使用，细菌获得耐药基因，从敏感菌株变成耐药菌株。一般认为幽门螺杆菌的耐药多为继发性耐药。幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药机制有以下几种:l、rDNA甲基化酶引起克拉霉素失活；2、细胞膜渗透性下降使进入细菌的药物减少；3、克拉霉素排出增加；4、基因突变:主要为幽门螺杆菌23S rDNA的V区发生点突变，导致核糖体变构，克拉霉素的结合位点发生改变，使幽门螺杆菌与克拉霉素的亲合力减弱，不能阻止细菌的蛋白合成产生耐药。综合以上几点，国内外学者普遍认为幽门螺杆菌对克拉霉素耐药的主要机制是23S rDNA基因突变所致，其余的机制相对作用较弱。1997年Taylor等人研究证实位于在23S rDNA基因的结构域V中编码的肽基转移酶区的第2142位(其中腺嘌呤核苷酸被胞嘧啶或被鸟嘌呤取代)，或第2143位(其中腺嘌呤被鸟嘌呤取代)的3个点突变，这些突变在此微生物中与克拉霉素抗性机理密切相关。各国学者也一致发现克拉霉素耐药的幽门螺杆菌菌株的23SrDNA基因的突变最常出现为A2143G、A2142G、A2142C的突变，也有报道发现G2115A、T2182C突变。Raymond等对法国138株克拉霉素耐药株研究发现:A2143G、A2142G和A2142C的突变率分别占81.9%、14.5%和3.6%。另外，Liu等对北京65株克拉霉素耐药株研究显示:A2143G、A2142G 和 A2142C 的突变率分别占 84.6%,6.2%和 1.5%0 因此，检测 Hp23SrDNA中A2143G、A2142G和A2142C突变，可以检测到中国90%以上的克拉霉素耐药Hp株。所以，Hp菌株23rDNA中的A2143G、A2142G和A2142C型突变可以作为国内检测Hp克拉霉素耐药的靶点。
[0004]用于克拉霉素耐药检测的方法很多，包括如药物敏感性试验、DNA直接测序、限制性片段长度多态性分析(RFLP-PCR)、荧光定量PCR法等。其中药敏实验为耐药检测的金标准，但此类方法是建立在细菌培养基础上，其缺点为细菌培养时间长，培养要求较高，临床上比较难做到。近年来，荧光定量PCR以其快速简便、特异性好、灵敏度高、可定量、有效解决PCR污染问题及自动化程度高等优点，在医学领域、微生物、动植物疾病检疫方面得到了广泛的应用。
[0005]扩增阻碍突变系统(amplificat1nrefractory mutat1n system ARMS)于 1989年建立，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计突变ARMS引物，其3’末端碱基与待检测突变型的突变碱基匹配，用于特异性扩增突变模板。ARMS的检测灵敏度依赖于ARMS引物的特异性和反应条件如酶，镁离子浓度等的优化。为了增加引物的特异性，减少引物与靶DNA有错配时的错配延伸，可通过在引物3’端的第2-3个碱基引入另外一个或者两个错配碱基，使之与模板之间形成多重错配以阻止错误延伸。
[0006]ARMS-qPCR技术基于Real-time PCR平台，结合ARMS突变富集和Taqman特异性荧光检测两种技术。利用ARMS引物对突变靶序列进行PCR扩增，Taqman探针对扩增产物进行特异性位点检测，在Real-time PCR基础上鉴定特定突变。
[0007]锁核酸(locked nucleic acid，LNA)是一种新型的寡核酸衍生物，结构中B-D-呋喃核糖的2-0，4C位通过缩水作用形成环形的氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，呋喃糖的结构锁定在C3内型的N构型，形成了刚性的缩合结构。LNA作为一种新的反义核酸，具有与DNA/RNA强大的杂交亲和力、反义活性、抗核酸酶能力、水溶性好及体内无毒性等优点。其能够与DNA和RNA特异性地结合从而可以制备LNA探针，与DNA探针相比，其杂交的稳定性和特异性增加，可大大提高基因诊断的效率和灵敏度。
【发明内容】
[0008]本发明的一个目的是提供用于鉴定幽门螺杆菌23S rDNA是否含有突变位点ARMS-qPCR的引物组。
[0009]本发明提供的引物组，为如下I)或2):
[0010]I)由单独使用的23S rDNA的A2143G突变型的ARMS引物、23S rDNA的A2142G突变型的ARMS引物和23S rDNA的A2142C突变型的ARMS引物组成；
[0011]2)由 23S rDNA 的 A2143G 突变型的 ARMS 引物、23S rDNA 的 A2142G 突变型的 ARMS引物和23S rDNA的A2142C突变型的ARMS引物组成；
[0012]所述23S rDNA的A2143G突变型的ARMS引物的核苷酸序列为序列表中序列3 ；
[0013]所述23S rDNA的A2142G突变型的ARMS引物的核苷酸序列为序列表中序列4 ；
[0014]所述23S rDNA的A2142C突变型的ARMS引物的核苷酸序列为序列表中序列5。
[0015]本发明的一个目的是提供用于鉴定幽门螺杆菌23S rDNA是否含有突变位点ARMS-qPCR的DNA分子组合物。
[0016]本发明提供的DNA分子组合物，为如下I)或2):
[0017]I)所示的DNA分子组合物包括单独使用的DNA分子组合物A、DNA分子组合物B和DNA分子组合物C ；
[0018]所述DNA分子组合物A由锁核酸阻滞探针、通用TaqMan探针、PCR通用下游引物和23S rDNA的A2143G突变型的ARMS引物组成；
[0019]所述DNA分子组合物B由锁核酸阻滞探针、通用TaqMan探针、PCR通用下游引物和23S rDNA的A2142G突变型的ARMS引物组成；
[0020]所述DNA分子组合物C由锁核酸阻滞探针、通用TaqMan探针、PCR通用下游引物和23S rDNA的A2142C突变型的ARMS引物组成；
[0021]2)所示的DNA分子组合物E由锁核酸阻滞探针、通用TaqMan探针、PCR通用下游引物、23S rDNA的A2143G突变型的ARMS引物、23S rDNA的A2142G突变型的ARMS引物和23S rDNA的A2142C突变型的ARMS引物组成；
[0022]所述锁核酸阻滞探针的核苷酸序列为序列表中序列I ;
[0023]所述通用TaqMan探针的核苷酸序列为序列表中序列2 ；
[0024]所述23S rDNA的A2143G突变型的ARMS引物的核苷酸序列为序列表中序列3 ；
[0025]所述23S rDNA的A2142G突变型的ARMS引物的核苷酸序列为序列表中序列4 ；
[0026]所述23S rDNA的A2142C突变型的ARMS引物的核苷酸序列为序列表中序列5 ；
[0027]所述PCR通用下游引物的核苷酸序列为序列表中序列7。
[0028]上述的DNA分子组合物还包括所述DNA分子组合物D ；
[0029]所述DNA分子组合物D由所述锁核酸阻滞探针、所述通用TaqMan探针、所述PCR通用下游引物和内控引物组成；
[0030]所述内控引物的核苷酸序列为序列表中序列6。
[0031]所述突变位点为A2143G、A2142G 或 A2142C。
[0032]幽门螺杆菌23S rDNA野生型基因的核苷酸序列为序列表中的序列8 ；
[0033]幽门螺杆菌23S rDNA的A2143G突变位点为序列表中的序列8自5’末端第97位的A突变为G ；
[0034]幽门螺杆菌23S rDNA的A2142G突变位点为序列表中的序列8自5’末端第96位的A突变为G ；
[0035]幽门螺杆菌23S rDNA的A2142C突变位点为序列表中的序列8自5’末端第96位的A突变为C ；
[0036]上述的DNA分子组合物中，所述DNA分子组合物A中，所述锁核酸阻滞探针、所述通用TaqMan探针、所述PCR通用下游引物、所述23S rDNA的A2143G突变型的ARMS引物的摩尔比为4:2:5:5 ；
[0037]所述DNA分子组合物B中，所述锁核酸阻滞探针、所述通用TaqMan探针、所述PCR通用下游引物、所述23S rDNA的A2142G突变型的ARMS引物的摩尔比为4:2:5:5 ；
[0038]所述DNA分子组合物C中，所述锁核酸阻滞探针、所述通用TaqMan探针、所述PCR通用下游引物、所述23S rDNA的A2142C突变型的ARMS引物的摩尔比为4:2:5:5 ；
[0039]所述DNA分子组合物D中，所述锁核酸阻滞探针、所述通用TaqMan探针、所述PCR通用下游引物、所述内控引物的摩尔比为4:2:5:5。
[0040]本发明的第二个目的是提供用于鉴定幽门螺杆菌23S rDNA基因型的ARMS-qPCR的PCR试剂。
[0041]本发明提供的PCR试剂，为I)或2):
[0042]I)所示的PCR试剂包括PCR试剂A、PCR试剂B和PCR试剂C组成；
[0043]所述PCR试剂A由PCR扩增反应液、所述DNA分子组合物A和水组成；
[0044]所述PCR试剂B由PCR扩增反应液、所述DNA分子组合物B和水组成；
[0045]所述PCR试剂C由PCR扩增反应液、所述DNA分子组合物C和水组成；
[0046]所述锁核酸阻滞探针、所述通用TaqMan探针、所述PCR通用下游引物、所述23SrDNA的A2143G突变型的ARMS引物在所述PCR试剂A中的终浓度分别依次为:0.4 μ M、0.2 μ Μ、0.5 μ Μ、0.5 μ M ；
[0047]所述锁核酸阻滞探针、所述通用TaqMan探针、所述PCR通用下游引物、所述23SrDNA的A2142G突变型的ARMS引物在所述PCR试剂B中的终浓度分别依次为:0.4 μ M、0.2 μ Μ、0.5 μ Μ、0.5 μ M ；
[0048]所述锁核酸阻滞探针、所述通用TaqMan探针、所述PCR通用下游引物、所述23SrDNA的A2142C突变型的ARMS引物在所述PCR试剂C中的终浓度分别依次为:0.4 μ M、0.2 μ Μ、0.5 μ Μ、0.5 μ Μ。
[0049]2)所示的PCR试剂为PCR试剂Ε，其由PCR扩增缓冲液、2)所示的DNA分子组合物和水组成。
[0050]上述所述I)所示的PCR试剂或所述2)所示的PCR试剂均还包括PCR试剂D ；[0051 ] 所述PCR试剂D由PCR扩增缓冲液、所述DNA分子组合物D和水组成；
[0052]所述锁核酸阻滞探针、所述通用TaqMan探针、所述PCR通用下游引物、所述内控引物在所述PCR试剂D 中的终浓度分别依次为:0.4 μ Μ、0.2 μ Μ、0.5 μ Μ、0.5 μ M0
[0053]所述突变位点为A2143G、A2142G 或 A2142C。
[0054]在反应体系中，上述23S rDNA的A2143G突变型的ARMS引物、23S rDNA的A2142G突变型的ARMS引物23S rDNA的A2142C突变型的ARMS引物为等摩尔比；在本发明的实施例中其终浓度均为0.25 μ M0
[0055]本发明的第三个目的是提供用于鉴定幽门螺杆菌23S rDNA基因型的ARMS-qPCR的PCR试剂盒。
[0056]本发明提供的PCR试剂盒，包括是上述的DNA分子组合物或上述的PCR试剂。
[0057]上述的DNA分子组合物或上述的PCR试剂或上述的PCR试剂盒中，所述突变位点为 A2143G、A2142G 或 A2142C。
[0058]上述的DNA分子组合物或上述的PCR试剂或上述的PCR试剂盒在鉴定或辅助鉴定幽门螺杆菌23S rDNA是否含有突变为位点中的应用或在制备鉴定或辅助鉴定幽门螺杆菌23S rDNA是否含有突变位点产品中的应用也是本发明保护的范围；
[0059]或上述的DNA分子组合物或上述的PCR试剂或上述的PCR试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测样本中含有的幽门螺杆菌23S rDNA是否含有突变位点中的应用或在制备鉴定或辅助鉴定待测样本中含有的幽门螺杆菌23S rDNA是否含有突变位点的产品中的应用；
[0060]或上述的DNA分子组合物或上述的PCR试剂或上述的PCR试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定含有幽门螺杆菌的待测样本是否耐克拉霉素中的产品中的应用；
[0061]或上述的DNA分子组合物或上述的PCR试剂或上述的PCR试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定待测幽门螺杆菌是否耐克拉霉素中的产品中的应用。
[0062]上述应用中，所述突变位点为A2143G、A2142G或A2142C。
[0063]本发明第四个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测样本含有的幽门螺杆菌23SrDNA是否含有突变位点ARMS-qPCR的方法。
[0064]本发明提供的方法，包括如下步骤:
[0065]I)所示的方法包括如下步骤:
[0066]用所述PCR试剂A、所述PCR试剂B、所述PCR试剂C和所述PCR试剂D分别对待测样本进行ARMS-qPCR，检测扩增产物；
[0067]若DNA分子组合物D扩增S型曲线且Ct≤32，且DNA分子组合物A扩增S型曲线且其与DNA分子组合物D扩增曲线Λ Ct < 7，则待测样本中幽门螺杆菌23S rDNA含有或候选含有A2143G突变位点；
[0068]若DNA分子组合物D扩增S型曲线且Ct≤32，且DNA分子组合物B扩增S型曲线且其与DNA分子组合物D扩增曲线Λ Ct < 7，则待测样本中幽门螺杆菌23S rDNA含有或候选含有A2142G突变位点；
[0069]若DNA分子组合物D扩增S型曲线且Ct≤32，且DNA分子组合物C扩增S型曲线且其与DNA分子组合物D的扩增曲线Λ Ct < 7，则待测样本中幽门螺杆菌23S rDNA含有或候选含有A2142C突变位点；
[0070]若DNA分子组合物D扩增S型曲线且Ct≤32，且DNA分子组合物A、B和C均无扩增曲线；或DNA分子组合物D扩增S型曲线且Ct≤32，且DNA分子组合物A、B和C的扩增曲线与DNA分子组合物D扩增曲线Λ Ct > 7 ;则待测样本中幽门螺杆菌23S rDNA不含有或候选不含有突变位点；
[0071]2)所示的方法包括如下步骤:
[0072]用所述PCR试剂E和所述PCR试剂D分别对待测样本进行ARMS-qPCR，检测扩增产物；
[0073]若DNA分子组合物D扩增S型曲线且Ct≤32，且DNA分子组合物E有S型扩增曲线且其与DNA分子组合物D的扩增曲线Λ Ct < 7，则待测样本中幽门螺杆菌23S rDNA含有或候选含有23S rDNA突变位点；
[0074]若DNA分子组合物D扩增S型曲线且Ct≤32，且DNA分子组合物E无S型扩增曲线与DNA分子组合物D的扩增曲线Λ Ct > 7，则待测样本中幽门螺杆菌23S rDNA不含有或候选不含有23S rDNA突变位点；
[0075]所述突变位点为A2143G、A2142G或A2142C。本发明所使用的探针两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核苷酸，为5’端FAM标记的TaqMan探针。在探针完整时，即随机状态和无PCR产物杂交状态时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收。在ARMS-qPCR扩增过程中，当特异的PCR产物与TaqMan探针发生杂交反应时Taq酶的5’端外切酶活性同时也把探针裂解，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板DNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做样本具体含量的定量检测。
[0076]锁核酸阻滞探针标记3’段P04。
[0077]所述待测样本为离体幽门螺杆菌患者胃粘膜组织标本。
[0078]本发明的实验证明，本发明设计的引物及其构成的试剂盒能快速、准确、高敏感度的检测胃粘膜组织中幽门螺杆菌23S rDNA基因特定位点突变，灵敏度高，可以进一步预测其对克拉霉素耐药性。
[0079]本发明采用的锁核酸阻滞探针，其序列与幽门螺杆菌23S rDNA基因野生模板完全匹配，部分碱基锁核酸化，用于特异性结合模板DNA中的Hp23S rDNA野生型DNA，因其末端磷酸化，无法延伸从而抑制突变区野生型DNA的扩增，大大增加突变检测的灵敏度与特异性。
[0080]因此，本发明用于检测23S rDNA基因突变具有以下优势:
[0081]1、特异性强:设计的ARMS引物分别针对包括23S rDNA基因的A2143G、A2142G和A2142C的三种突变位点序列，能特异性扩增相应突变模板DNA ;在ARMS引物的3’末端倒数2-3位增加一个或者两个碱基错配，可以增加ARMS引物的特异性；本发明技术在PCR反应体系中加入野生型23S rDNA基因特异性的锁核酸阻滞探针，通过抑制野生型基因组DNA扩增从而富集突变型DNA的扩增，进一步提高了检测的特异性。
[0082]2、敏感性高:本发明技术在PCR反应液中加入野生型23S rDNA基因LNA阻滞探针，通过特异性地抑制野生型模板的扩增，从而达到对微量突变模板的富集作用，提高检测敏感性。本技术检测23S rDNA基因突变敏感度达0.1-1% (即突变基因组DNA达到基因总DNA的0.1-1%即可检出)；而直接测序法检测23S rDNA突变的敏感度约为10% (即突变基因组DNA达到基因总DNA的10%才能检出)。
[0083]3、检测过程为闭管反应，大大降低了污染及结果偏差的可能性。
[0084]4、操作简单快速，从标本送检到得出结果可在3个小时以内完成。而直接测序法检测步骤繁琐:送检标本一提取DNA — PCR扩增一验证PCR产物(电泳)一纯化PCR产物—直接测序，且其经历两个PCR产物的电泳过程，污染机会大，不适合在医院大规模开展。
[0085]5、结果判读明确、客观；可以快速对不同突变类型进行准确分型，若需要亦可对结果进行定量分析。
[0086]6、高通量，一次最多可检测48例。
[0087]7、安全:整个体系中不包含有毒有害物质，无需PCR产物的后处理，对操作员和环境都无危害。
【专利附图】
【附图说明】
[0088]图1为用ARMS-qPCR检测试剂盒分型检测幽门螺杆菌阳性样本I的23SrDNAA2143G基因突变型的扩增曲线图
[0089]图2为用ARMS-qPCR检测试剂盒分型检测幽门螺杆菌阳性样本2的23SrDNAA2142G基因突变型的扩增曲线图
[0090]图3为用ARMS-qPCR检测试剂盒分型检测幽门螺杆菌阳性样本3的23SrDNAA2142C基因突变型的扩增曲线图
[0091 ] 图4为用ARMS-qPCR检测试剂盒分型检测幽门螺杆菌阳性样本4的23S rDNA基因野生型的扩增曲线图
[0092]图5为用ARMS-qPCR检测试剂盒混合检测幽门螺杆菌阳性样本1_3的23S rDNA基因突变型的扩增曲线图
[0093]图6为用ARMS-qPCR检测试剂盒混合检测幽门螺杆菌阳性样本4的23S rDNA基因野生型的扩增曲线图
【具体实施方式】
[0094]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0095]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0096]实施例1、ARMS-qPCR检测试剂盒及其专用引物和探针的设计
[0097]幽门螺杆菌23S rDNA野生型基因的核苷酸序列为序列表中的序列8 ；
[0098]幽门螺杆菌23S rDNA的A2143G突变位点为序列表中的序列8自5’末端第97位的A突变为G ；
[0099]幽门螺杆菌23S rDNA的A2142G突变位点为序列表中的序列8自5’末端第96位的A突变为G ；
[0100]幽门螺杆菌23S rDNA的A2142C突变位点为序列表中的序列8自5’末端第96位的A突变为C ；
[0101]一、引物及探针
[0102]使用Primer Express Vers1n3软件在两个突变的序列区域设计探针及引物。设计并筛选能特异性检测第2143和第2142两个位点的三种(A2143G、A2142G、A2142C)碱基置换突变的ARMS引物各一条及内控引物一条，设计通用下游引物一条，设计并筛选通用TaqMan探针一条，设计并筛选锁核酸阻滞探针一条，各探针、引物序列分别具体如下:
[0103]锁核酸阻滞探针的核苷酸序列如序列表中序列I所示，其3’端标记P04 ；
[0104]通用TaqMan探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示，其5’端标记FAM，3’端标记 BHQl ；
[0105]用于检测23S rDNA的突变型ARMS引物由用于检测23S rDNA的A2143G突变型的ARMS引物、用于检测23S rDNA的A2142G突变型的ARMS引物和用于检测23S rDNA的A2142C突变型的ARMS引物组成，其中，
[0106]用于检测23S rDNA的A2143G突变型的ARMS引物的核苷酸如序列3所示；
[0107]用于检测23S rDNA的A2142G突变型的ARMS引物的核苷酸如序列4所示；
[0108]用于检测23S rDNA的A2142C突变型的ARMS引物的核苷酸如序列5所示；
[0109]内控引物为一条能够同时扩增23S rDNA野生型及突变型基因组DNA的上游引物，其核苷酸如序列6所示；
[0110]PCR通用下游引物的核苷酸如序列7所示。
[0111]将设计好的引物及探针序列交由合成公司合成，一般采用仪器自动化学合成，需提供合成检验合格报告。
[0112]二、幽门螺杆菌荧光定量PCR的试剂或试剂盒配制
[0113]1、反应体系的优化
[0114](I)引物浓度的优化:在反应体系其它条件相同的情况下，将引物浓度分别从0.1 μ M至1.0 μ M作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较，确定最佳引物浓度是0.5 μ Μ。
[0115](2)探针浓度的优化:在反应体系其他条件相同的情况下，将探针浓度分别从0.05 μ M至0.5 μ M作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较，确定最佳探针浓度是0.2 μ Μ。
[0116](3)酶的优化:在反应体系中加入各种酶，通过对试验结果的分析比较，确定最佳酶是EXTaq酶。
[0117](4)镁离子浓度的优化:在反应体系其它条件相同的情况下，将qPCR反应液组分镁离子浓度分别从0.5mM至4.0mM作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较，确定最佳镁离子浓度是2mM。
[0118](5)退火温度的优化:在反应体系其它条件相同的情况下，进行梯度PCR(56_62°C退火温度)，通过对试验结果的分析比较，确定最佳退火温度是58°C。
[0119]经优化，用于检测待测样本中的23S rDNA是否突变的PCR试剂为I)或2):
[0120]I)由PCR试剂A-D组成:
[0121]PCR试剂A为A2143G检测管反应体系:20yL，由qPCR混合反应液10 μ L、通用下游引物I μ L(终浓度0.5 μ M)、A2143G的ARMS引物I μ L(终浓度0.5 μ Μ)、通用TaqMan探针0.4 μ L (终浓度0.2 μ Μ)、锁核酸阻滞探针0.8 μ L (终浓度0.4 μ Μ)、模板DNA5 μ L (终浓度l-300ng/y L)和水组成。
[0122]PCR试剂B为A2142G检测管反应体系:20yL，由qPCR混合反应液10 μ L、通用下游引物I μ L(终浓度0.5 μ M)、A2142G的ARMS引物I μ L(终浓度0.5 μ Μ)、通用TaqMan探针0.4 μ L (终浓度0.2 μ Μ)、锁核酸阻滞探针0.8 μ L (终浓度0.4 μ Μ)、模板DNA5 μ L (终浓度l-300ng/y L)和水组成。
[0123]PCR试剂C为A2142C检测管反应体系:20μ L，由qPCR混合反应液10 μ L、通用下游引物I μ L(终浓度0.5 μ M)、A2142C的ARMS引物I μ L(终浓度0.5 μ Μ)、通用TaqMan探针0.4 μ L (终浓度0.2 μ Μ)、锁核酸阻滞探针0.8 μ L (终浓度0.4 μ Μ)、模板DNA5 μ L (终浓度l-300ng/y L)和水组成。
[0124]PCR试剂D为内控管的反应体系，与检测管相同，不同的是将ARMS引物替换为内控引物。
[0125]2)由PCR试剂E和D组成:
[0126]用于检测待测样本23S rDNA是否突变的PCR试剂包括PCR试剂E和PCR试剂D ；
[0127]PCR试剂E为检测管的反应体系为20 μ L，由qPCR混合反应液10 μ L、通用下游引物 I μ L(终浓度 0.5 μ Μ)、A2143G 的 ARMS 引物、A2142G 的 ARMS 引物和 A2142C 的 ARMS 引物各0.5 μ L(终浓度均为)、通用TaqMan探针0.4 μ L(终浓度0.2 μ Μ)、锁核酸阻滞探针0.8 μ L (终浓度0.4 μ Μ)、模板DNA5 μ L (终浓度l_300ng/ μ L)和水组成。
[0128]上述qPCR混合反应液组分及其终浓度见表1。
[0129]表1为qPCR反应液组分
[0130]
组分j终浓度
MgCla2mM
Taq DNA 聚合酶 5U/yL
dNTPs2.5mM
反应缓冲液 I1x
[0131]2、试剂盒组成
[0132]可以将上述的锁核酸阻滞探针、通用TaqMan探针、针对23S rDNA的A2143G的ARMS引物或针对23S rDNA的A2142G的ARMS引物或针对23S rDNA的A2142C的ARMS引物、内控引物、PCR通用下游引物以及水作为试剂盒的主要组成，构建获得试剂盒；
[0133]试剂盒中具体含有下列试剂和材料:
[0134](I)引物溶液:a、锁核酸阻滞探针(序列I) ;b、通用TaqMan探针(序列2)，；c、ARMS引物(序列3或序列4或序列5或序列3+序列4+序列5) ;d、内控引物(序列6) ;e、PCR通用下游引物(序列7)。
[0135](2) qPCR 反应液:包括 10XPCR 缓冲液；dNTPs ；MgCl2 溶液；EXTaq 酶。
[0136](3)阳性质控:为人工合成的23S rDNA基因A2143G、A2142G和A2142C三种突变型的混合质粒基因组DNA。
[0137](4)阴性质控:无菌双蒸水
[0138](5)无菌双蒸水
[0139]实施例2、幽门螺杆菌23S rDNA基因型的ARMS-qPCR突变检测方法
[0140]一、检测
[0141]1、样本制备
[0142]从离体人胃粘膜组织标本中获取DNA，推荐使用商业化的试剂盒提取基因组DNA作为样本1-4 ；
[0143]测定DNA浓度和纯度，要求浓度大于1ng/ μ L ；0D260nm/0D280nm = 1.8~2.0。
[0144]2、荧光PCR检测
[0145]1)ARMS引物分型检测
[0146]对于样本1-4中每个样本均在四个管A-D分别进行反应，四个管分别对应A2143G检测管(ep管A)、A2142G检测管(ep管B)、A2142C检测管(ep管C)、内控管(印管D)。检测管(A-C)内反应加入qPCR反应液、LNA阻滞探针、通用TaqMan探针、通用下游引物、模板DNA及相应的ARMS引物；内控管⑶基本相同，所不同的是加入内控引物替代ARMS引物，具体如下:
[0147]印管A(PCR试剂A):20 μ L反应体系，由qPCR混合反应液10 μ L、通用下游引物1μ L(终浓度(λ 5μΜ)、A2143G的ARMS弓丨物1μ L(终浓度(λ 5 μ Μ)、通用TaqMan探针0.4 μ L (终浓度0.2 μ Μ)、锁核酸阻滞探针0.8 μ L (终浓度0.4 μ Μ)、模板DNA5 μ L (终浓度l-300ng/ μ L)和水组成；
[0148]印管B(PCR试剂B):20 μ L反应体系，由qPCR混合反应液10 μ L、通用下游引物1μ L(终浓度(λ 5μΜ)、A2142G的ARMS弓丨物1μ L(终浓度(λ 5 μ Μ)、通用TaqMan探针0.4 μ L (终浓度0.2 μ Μ)、锁核酸阻滞探针0.8 μ L (终浓度0.4 μ Μ)、模板DNA5 μ L (终浓度l-300ng/ μ L)和水组成；
[0149]印管C(PCR试剂C):20yL反应体系，由qPCR混合反应液10yL、通用下游引物1μ L(终浓度(λ 5μΜ)、A2142C的ARMS弓丨物1μ L(终浓度(λ 5 μ Μ)、通用TaqMan探针0.4 μ L (终浓度0.2 μ Μ)、锁核酸阻滞探针0.8 μ L (终浓度0.4 μ Μ)、模板DNA5 μ L (终浓度l-300ng/ μ L)和水组成；
[0150]印管D(PCR试剂D):20yL反应体系，由qPCR混合反应液10yL、通用下游引物I μ L(终浓度0.5 μ Μ)、内控引物I μ L(终浓度0.5 μ Μ)、通用TaqMan探针0.4 μ L(终浓度0.2 μ M)、锁核酸阻滞探针0.8 μ L (终浓度0.4 μ Μ)、模板DNA5 μ L (终浓度l_300ng/ μ L)和水组成。
[0151 ] 2) ARMS弓丨物混合检测
[0152]样本1-4的每个样本均分别在两个管E、D进行反应，每管分别对应检测管(ep管E)、内控管(ep管D)。检测管内反应加入qPCR反应液、LNA阻滞探针、通用TaqMan探针、通用下游引物、模板DNA及三种ARMS引物；内控管(D)基本相同，所不同的是加入内控引物替代ARMS引物，具体如下:
[0153]印管E(PCR试剂E):20 μ L反应体系，由qPCR混合反应液10 μ L、通用下游引物I μ L(终浓度 0.5 μ Μ)、A2143G 的 ARMS 引物 0.5 μ L(终浓度 0.25 μ Μ)、A2142G 的 ARMS 引物 0.5 μ L(终浓度 0.25 μ Μ)、A2142C 的 ARMS 引物 0.5 μ L(终浓度 0.25 μ Μ)、通用 TaqMan探针0.4 μ L (终浓度0.2 μ Μ)、锁核酸阻滞探针0.8 μ L (终浓度0.4 μ Μ)、模板DNA5 μ L (终浓度l-300ng/ μ L)和水组成；
[0154]印管D(PCR试剂D):2(^1^反应体系，由9?0?混合反应液1(^1^、通用下游引物I μ L(终浓度0.5 μ Μ)、内控引物I μ L(终浓度0.5 μ Μ)、通用TaqMan探针0.4 μ L(终浓度
0.2 μ M)、锁核酸阻滞探针0.8 μ L (终浓度0.4 μ Μ)、模板DNA5 μ L (终浓度l_300ng/ μ L)和水组成。
[0155]PCR反应条件为:95°C预变性10分钟，95°C 15秒，58°C 40秒，扩增反应40循环，在58°C 40秒阶段收集荧光。
[0156]ARMS-qPCR 在 ABI7500 检测仪上进行。
[0157]3、结果判读:
[0158]若内控引物管扩增曲线阴性或Ct > 32，提示该样本提取失败，需要重新提取。
[0159]ARMS引物分型检测结果如图1-4所示，可以看出，
[0160]对于样本1，内控引物管D扩增S型曲线且Ct ( 32,ARMS引物管A有扩增S型曲线且ARMS引物管A与内控引物管D的扩增曲线ACt≤7，待测样本含有或候选含有A2143G突变位点(图1为样本I的3个ARMS引物检测管及内控管的扩增图)；
[0161]对于样本2，内控引物管D扩增S型曲线且Ct ( 32,ARMS引物管B有扩增S型曲线且ARMS引物管B与内控引物管D的扩增曲线ACt < 7，待测样本结果含有或候选含有A2142G突变位点(图2为样本2的3个ARMS引物检测管及内控管的扩增图)；
[0162]对于样本3，内控引物管D扩增S型曲线且Ct ( 32,ARMS引物管C有扩增S型曲线且ARMS引物管C与内控引物管D的扩增曲线Λ Ct≤7，待测样本含有或候选含有A2142C突变位点(图3为样本3的3个ARMS引物检测管及内控管的扩增图)；
[0163]对于样本4，内控引物管D扩增S型曲线且Ct ( 32，三种ARMS引物管A、B、C均无扩增曲线，待测样本不含有或候选不含有A2143G、A2142G、A2142C中任——个突变位点，其为23S rDNA野生型基因(图4为样本4的3个ARMS引物检测管及内控管的扩增图)；
[0164]分别以样本1-4的基因组DNA为模板，用5’ATGAATGGCGTAACGA3’引物正向测序样本1-4的23S rDNA基因目的片段，结果与本发明的方法一致，证明本发明的方法正确。
[0165]ARMS引物混合检测结果如图5-6所示，可以看出，
[0166]对于样本1-3，内控引物管D扩增S型曲线且Ct ( 32, ARMS引物混合管E中有扩增S型曲线且与内控引物管D的扩增曲线Λ Ct <7，待测样本结果为或候选为23S rDNA突变型基因(图5为样本1-3的ARMS检测管及内控管的扩增图)；
[0167]对于样本4，内控引物扩增S型曲线且Ct ( 32,ARMS引物混合管E无扩增曲线或与内控引物的扩增曲线ACt >7，待测样本结果为或候选为23S rDNA野生型基因(图6为样本4的ARMS检测管及内控管的扩增图)。
[0168]二、特异性检测
[0169]用实施例1ARMS引物分型检测方法检测实验室保存的38株经测序已知突变类型的幽门螺杆菌临床分离株的23S rDNA序列进行扩增，结果除阴性对照外，其余对相应的DNA突变或者不突变形成呈阳性扩增，与测序结果符合率达到100%。
[0170]三、灵敏度检测
[0171]以人工合成的对应序列幽门螺杆菌23S rDNA野生型基因、幽门螺杆菌23S rDNA的A2143G型突变型基因、幽门螺杆菌23S rDNA的A2142G型突变型基因和幽门螺杆菌23SrDNA的A2142C型突变型基因分别连接到pMD18_T载体为模板，浓度梯度均稀释为10~16CFU为模板。
[0172]按照上述一的ARMS引物分型检测方法进行real-time PCR,每个模板浓度梯度做3个平行样，每个模板用其突变类型对应的检测管进行检测，当体系标准模板量为10~16CFU时，每个浓度梯度的3个平行样均扩增阳性，三种ARMS引物管A、B、C的检测下限均为10CFU，其灵敏度均为10CFU。
[0173]因此，可以用实施例1中的用于检测待测样本中23S rDNA是否突变的PCR试剂A-D检测待测样本中幽门螺杆菌23S rDNA基因是否突变或检测待测样本是否耐克拉霉素；并且可以对突变阳性样本进行特异性分型。
[0174]若内控引物扩增S型曲线且Ct≤32，且用于检测23S rDNA的A2143G突变型ARMS引物扩增S型曲线且其与内控引物的扩增曲线ACt < 7，则待测样本中幽门螺杆菌23SrDNA含有或候选含有A2143G突变位点，待测样本为或候选为对克拉霉素耐药；
[0175]若内控引物扩增S型曲线且Ct≤32，且用于检测23S rDNA的A2142G突变型ARMS引物扩增S型曲线且其与内控引物扩增曲线ACt < 7，则待测样本中幽门螺杆菌23SrDNA含有或候选含有A2142G突变位点，待测样本为或候选为对克拉霉素耐药；
[0176]若内控引物扩增S型曲线且Ct≤32，且用于检测23S rDNA的A2142C突变型ARMS引物扩增S型曲线且其与内控引物的扩增曲线ACt < 7，则待测样本中幽门螺杆菌23SrDNA含有或候选含有A2142C突变位点，待测样本为或候选为对克拉霉素耐药；
[0177]若内控引物扩增S型曲线且Ct≤32，且用于检测23S rDNA的A2143G突变型ARMS弓丨物、A2142G突变型ARMS引物和A2142C突变型ARMS引物均无扩增曲线或与内控引物的扩增曲线均ACt > 7，待测样本23S rDNA不含有或候选不含有A2143G、A2142G、A2142C中任--个突变位点，表现为对克拉霉素敏感。
[0178]也可以用实施例1中的用于检测待测样本中23S rDNA是否突变的PCR试剂E和PCR试剂D混合检测待测样本中幽门螺杆菌23S rDNA基因是否突变或检测待测样本是否耐克拉霉素。
[0179]若内控引物扩增S型曲线且Ct≤32，且用于检测23S rDNA的ARMS混合引物有S型扩增曲线且与内控引物的扩增曲线ACt < 7，待测样本23S rDNA含有或候选含有突变位点，所述突变位点为A2143G、A2142G或A2142C，待测样本表现为对克拉霉素耐药；
[0180]若内控引物扩增S型曲线且Ct≤32，且用于检测23S rDNA的ARMS混合引物无扩增曲线或与内控引物的扩增曲线八以>7，待测样本233 rDNA不含有或候选不含有突变位点，待测样本表现为对克拉霉素敏感。
[0181]实施例3、ARMS-qPCR试剂盒的临床应用
[0182]1、样本制备
[0183]收集临床病理诊断为幽门螺杆菌阳性的50例患者(患者之情，编号为1-50)的石蜡包埋胃粘膜组织切片或冰冻胃粘膜组织块，从组织中提取基因组DNA。
[0184]测定DNA浓度和纯度，要求浓度大于1ng/ μ L ；0D260nm/0D280nm = 1.8~2.0。
[0185]2、荧光PCR检测
[0186]按照实施例2的一的2的方法中的ARMS引物分型检测进行荧光PCR检测。
[0187]结果如下:
[0188]在临床病理诊断为幽门螺杆菌阳性的50例患者中共检测出13例23S rDNA的A2143G突变型阳性样本(编号为1-13)、I例23S rDNA的A2142G突变型突变阳性样本(编号为14)，其余为野生型样本(编号为15-50)，由于23S rDNA的A2142C的突变率较低，因此，本实验中没有检测出23S rDNA的A2142C突变型阳性样本，其他各突变或野生型经测序验证，结果一致。
[0189]将上述野生型样本、A2143G突变阳性样本、A2142G突变阳性样本进行克拉霉素培养法耐药检测，结果A214 3G突变阳性、A2142G突变阳性均耐克拉霉素，野生型样本克拉霉素敏感。
[0190]上述结果表明应用本发明的引物、探针检测胃粘膜组织23S rDNA基因突变灵敏度高，可检测临床样本中的微量突变模板(0.1-1% );结果可靠，与突变检测“金标准”直接测序法的结果符合率>95% (为100%)。此外该方法检测速度快，操作简单，结果判读客观，闭管反应污染少，非常适合于在临床中大规模开展。
【权利要求】
1.用于鉴定幽门螺杆菌23SrDNA是否含有突变位点ARMS-qPCR的引物组，为如下I)或2): 1)由单独使用的23SrDNA的A2143G突变型的ARMS引物、23S rDNA的A2142G突变型的ARMS引物和23S rDNA的A2142C突变型的ARMS引物组成； 2)由23SrDNA的A2143G突变型的ARMS引物、23S rDNA的A2142G突变型的ARMS引物和23S rDNA的A2142C突变型的ARMS引物组成； 所述23S rDNA的A2143G突变型的ARMS引物的核苷酸序列为序列表中序列3 ； 所述23S rDNA的A2142G突变 型的ARMS引物的核苷酸序列为序列表中序列4 ； 所述23S rDNA的A2142C突变型的ARMS引物的核苷酸序列为序列表中序列5。
2.用于鉴定幽门螺杆菌23SrDNA是否含有突变位点ARMS-qPCR的DNA分子组合物，为如下I)或2): 1)所示的DNA分子组合物包括单独使用的DNA分子组合物A、DNA分子组合物B和DNA分子组合物C ； 所述DNA分子组合物A由锁核酸阻滞探针、通用TaqMan探针、PCR通用下游引物和23SrDNA的A2143G突变型的ARMS引物组成； 所述DNA分子组合物B由锁核酸阻滞探针、通用TaqMan探针、PCR通用下游引物和23SrDNA的A2142G突变型的ARMS引物组成； 所述DNA分子组合物C由锁核酸阻滞探针、通用TaqMan探针、PCR通用下游引物和23SrDNA的A2142C突变型的ARMS引物组成； 2)所示的DNA分子组合物由锁核酸阻滞探针、通用TaqMan探针、PCR通用下游引物、23SrDNA的A2143G突变型的ARMS引物、23S rDNA的A2142G突变型的ARMS引物和23S rDNA的A2142C突变型的ARMS引物组成； 所述锁核酸阻滞探针的核苷酸序列为序列表中序列I ; 所述通用TaqMan探针的核苷酸序列为序列表中序列2 ； 所述23S rDNA的A2143G突变型的ARMS引物的核苷酸序列为序列表中序列3 ； 所述23S rDNA的A2142G突变型的ARMS引物的核苷酸序列为序列表中序列4 ； 所述23S rDNA的A2142C突变型的ARMS引物的核苷酸序列为序列表中序列5 ； 所述PCR通用下游引物的核苷酸序列为序列表中序列7。
3.根据权利要求2所述的DNA分子组合物，其特征在于:所述DNA分子组合物均还包括所述DNA分子组合物D ； 所述DNA分子组合物D由所述锁核酸阻滞探针、所述通用TaqMan探针、所述PCR通用下游引物和内控引物组成； 所述内控引物的核苷酸序列为序列表中序列6。
4.根据权利要求2或3所述的DNA分子组合物，其特征在于: 所述突变位点为A2143G、A2142G或A2142C。
5.用于鉴定幽门螺杆菌23SrDNA是否含有突变位点ARMS-qPCR的PCR试剂，为I)或
2): I)所示的PCR试剂包括PCR试剂A、PCR试剂B和PCR试剂C组成； 所述PCR试剂A由PCR扩增缓冲液、所述DNA分子组合物A和水组成；所述PCR试剂B由PCR扩增缓冲液、所述DNA分子组合物B和水组成； 所述PCR试剂C由PCR扩增缓冲液、所述DNA分子组合物C和水组成； 2)所示的PCR试剂为PCR试剂E，其由PCR扩增缓冲液、2)所示的DNA分子组合物和水组成。
6.根据权利要求5所述的PCR试剂，其特征在于:所述I)所示的PCR试剂或所述2)所示的PCR试剂均还包括PCR试剂D ； 所述PCR试剂D由PCR扩增缓冲液、所述DNA分子组合物D和水组成； 所述突变位点为A2143G、A2142G或A2142C。
7.用于鉴定幽门螺杆菌23SrDNA是否含有突变位点ARMS-qPCR的PCR试剂盒，包括权利要求I所述的引物组、权利要求2-4中任一所述的DNA分子组合物或权利要求5或6所述的PCR试剂。
8.根据权利要求2-4中任一所述的DNA分子组合物或权利要求5或6所述的PCR试剂或权利要求7所述的PCR试剂盒，其特征在于:所述突变位点为A2143G、A2142G或A2142C。
9.权利要求1所述的引物组、权利要求2-4中任一所述的DNA分子组合物或权利要求5或6所述的PCR试剂或权利要求7所述的PCR试剂盒在鉴定或辅助鉴定幽门螺杆菌23SrDNA是否含有突变为位点中的应用或在制备鉴定或辅助鉴定幽门螺杆菌23S rDNA是否含有突变位点产品中的 应用； 或权利要求1所述的引物组、权利要求2-4中任一所述的DNA分子组合物或权利要求5或6所述的PCR试剂或权利要求7所述的PCR试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测样本中含有的幽门螺杆菌23S rDNA是否含有突变位点中的应用或在制备鉴定或辅助鉴定待测样本中含有的幽门螺杆菌23S rDNA是否含有突变位点的产品中的应用； 或权利要求1所述的引物组、权利要求2-4中任一所述的DNA分子组合物或权利要求5或6所述的PCR试剂或权利要求7所述的PCR试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定含有幽门螺杆菌的待测样本是否耐克拉霉素中的产品中的应用； 或权利要求1所述的引物组、权利要求2-4中任一所述的DNA分子组合物或权利要求5或6所述的PCR试剂或权利要求7所述的PCR试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定待测幽门螺杆菌是否耐克拉霉素中的产品中的应用； 所述突变位点具体为A2143G、A2142G或A2142C。
10.一种鉴定或辅助鉴定待测样本含有的幽门螺杆菌23S rDNA是否含有突变位点ARMS-qPCR的方法，为如下I)或2):1)所示的方法包括如下步骤: 用所述PCR试剂A、所述PCR试剂B、所述PCR试剂C和所述PCR试剂D分别对待测样本进行ARMS-qPCR，检测扩增产物； 若DNA分子组合物D扩增S型曲线且Ct < 32，且DNA分子组合物A扩增S型曲线且其与DNA分子组合物D扩增曲线Λ Ct < 7，则待测样本中幽门螺杆菌23S rDNA含有或候选含有A2143G突变位点； 若DNA分子组合物D扩增S型曲线且Ct≤32，且DNA分子组合物B扩增S型曲线且其与DNA分子组合物D扩增曲线Λ Ct < 7，则待测样本中幽门螺杆菌23S rDNA含有或候选含有A2142G突变位点；若DNA分子组合物D扩增S型曲线且Ct < 32，且DNA分子组合物C扩增S型曲线且其与DNA分子组合物D的扩增曲线Λ Ct < 7，则待测样本中幽门螺杆菌23S rDNA含有或候选含有A2142C突变位点； 若DNA分子组合物D扩增S型曲线且Ct≤32，且DNA分子组合物A、B和C均无扩增曲线；或DNA分子组合物D扩增S型曲线且Ct≤32，且DNA分子组合物A、B和C的扩增曲线与DNA分子组合物D扩增曲线Λ Ct > 7 ;则待测样本中幽门螺杆菌23S rDNA不含有或候选不含有突变位点； 2)所示的方法包括如下步骤: 用所述PCR试剂E和所述PCR试剂D分别对待测样本进行ARMS-qPCR，检测扩增产物；若DNA分子组合物D扩增S型曲线且Ct < 32，且DNA分子组合物E有S型扩增曲线且其与DNA分子组合物D的扩增曲线Λ Ct < 7，则待测样本中幽门螺杆菌23S rDNA含有或候选含有23S rDNA突变位点； 若DNA分子组合物D扩增S型曲线且Ct < 32，且DNA分子组合物E无S型扩增曲线与DNA分子组合物D的扩增曲线Λ Ct > 7，则待测样本中幽门螺杆菌23S rDNA不含有或候选不含有23S rDNA突变位点； 所述突变位点为A21 43G、A2142G或A2142C。
【文档编号】C12N15/11GK104164491SQ201410347808
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月21日 优先权日:2014年7月21日
【发明者】余倩, 亓岽东, 胡波 申请人:北京新基永康生物科技有限公司