一种水稻源抗虫相关基因及其编码产物与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种水稻源抗虫相关基因及其编码产物与应用，该抗虫基因具有SEQIDNo.1的DNA序列。该序列由3385个核苷酸碱基组成，包含一个由3201个核苷酸构成的完整的编码框，编码1066个氨基酸残基的小分子量蛋白。研究发现该基因与水稻的抗虫性密切相关，降低该基因的表达水平能提高水稻对褐飞虱的抗性。本发明将在作物育种，特别是在水稻抗虫育种中得到广泛应用。
【专利说明】一种水稻源抗虫相关基因及其编码产物与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种水稻源抗虫相关基因及其编码产物与应 用。
【背景技术】
[0002] 世界有将近一半的人口以水稻L.)为食，作为最重要的粮食作物 之一，每年却因虫害而造成水稻大量减产。日益严峻的粮食问题、因农药的泛滥使用而造成 日益严重的环境问题等使得研究寻找抗虫新基因、培育抗虫新品种迫在眉睫。
[0003] 褐飞風(Λ?/學arraia 属于半翅目Hemiptera，飞風科Delphacidae，是我 国水稻作物上的重要害虫。近几年来，褐飞虱接年大暴发，对我国的水稻粮食产量造成了严 重损失。据统计，20世纪80年代以来，褐飞虱在我国的年发生面积大约为1330-2000万公 顷，约占水稻种植面积的一半，年损失稻谷达10-15亿千克。2005年，褐飞虱再次在我国南 方稻区爆发，引起水稻大面积"虱烧"，产量损失十分严重。浙江省农业厅调查发现，2005年 浙江省第5代褐飞虱发生量每667平方米达30万头以上的有66. 7万公顷，占水稻总种植面 积的86% ;每667平方米在100万头以上的有33. 3万公顷，占 42% ;最高田块的发生量达 到每667平方米1000万头以上；绝收的面积达5333公顷，造成水稻产量损失约120万吨。
[0004] 在褐飞虱综合防治体系中，培育和种植水稻抗虫品种是防治褐飞虱最经济最有效 的方法之一。然而，目前对水稻抗褐飞虱的基因还克隆鉴定得很少。至今，还只有BPH14 - 个基因得到鉴定与克隆。因此寻找和鉴定水稻中抗褐飞虱相关基因，对水稻抗虫品种的筛 选和培育，实现褐飞虱无公害和可持续控制具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种水稻源抗虫相关基因及其编码 产物与应用。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种水稻源抗虫相关基因 他7,它具有SEQ ID No. 1的DNA序列。
[0007] -种水稻源抗虫相关基因的编码蛋白，它包含SEQ ID No. 2的氨基酸 序列的蛋白质，或者是将SEQ ID No. 2的氨基酸残基序列经过一个或多个氨基酸残基的取 代、缺失或者添加且具有与SEQ ID No. 2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID No. 2衍 生的蛋白质。
[0008] -种水稻源抗虫相关基因在转基因植物中的应用。
[0009] -种水稻源抗虫相关基因在作物育种中的应用。
[0010] 本发明的有益效果是，利用SSH、RT-PCR和RACE技术分离并克隆了 他7基 因；利用荧光定量PCR (qRT-PCR)方法分析了 基因在褐飞虱为害后的表达情况； 利用转基因技术获得了 基因的RNAi沉默转基因植株，并发现了 基因 在水稻对褐飞虱抗性中发挥着十分重要的作用。该基因的分离克隆，对作物的抗虫育种，尤 其是抗褐飞虱的水稻品种的培育，具有十分重要的指导和促进作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1是基因 PCR扩增产物凝胶电泳图； 图2是褐飞虱为害后基因的表达情况。Con:水稻茎杆套入空玻璃罩。柱 形图为平均数土标准误（n=5); 图3是基因的RNAi沉默载体结构示意图； 图4是基因沉默效果图。本底情况下野生型植株（WT)、沉默品系LRR1-1和 LRR1-2中基因的表达量。图中数字为沉默品系与WT中基因表达量 的比例。柱形图为平均数土标准误（n=5); 图5是基因沉默后降低了褐飞虱雌成虫的取食和产卵嗜好性。（a)，（b)褐 飞虱怀卵雌成虫在野生型植株（WT)、沉默植株LRR1-1和LRR1-2上的取食头数和产卵率。 表示处理组与对照组存在显著差异（t-test，p〈0. 05)，"**"表示处理组与对照组存在 极显著差异（卜仏5^，？〈0.01)，柱形图和线形图均为平均数±标准误（11=10); 图6是基因沉默后降低了褐飞虱若虫的存活率。野生型植株(WT)、沉默 品系LRR1-1和LRR1-2上褐飞虱若虫的存活率。表示处理组与对照组存在显著差异 (t-test，p〈0. 05)，"#"表示处理组与对照组存在极显著差异（t-test，p〈0. 01)，线形图为 平均数土标准误（n=10); 图7 基因沉默后增加了水稻对褐飞虱的耐受性。15头雌成虫为害18 d后 野生型植株（WT)、LRR1-1和LRR1-2沉默品系的耐害表型（n=20)。
【具体实施方式】
[0012] 本发明利用SSH、RT-PCR和RACE技术，获得的全长序列。首先从SSH 克隆库中分析获得基因片段，以此片段设计正向和反向引物，分别进行3'-RACE 和5' -RACE获得该基因的5'端和3'端基因 PCR片段，并测序拼接获得DNA序列。在拼接 DNA序列的5'端和3'端非编码区设计引物和flsKW7-Rl。提取的水稻 茎杆的mRNA并反转录成cDNA。以cDNA为模板、和为引物进 行PCR反应，即得到全长序列并测序验证。其次，利用qRT-PCR研究 的表达情况，结果表明褐飞虱危害不诱导的表达。再次，利用农杆菌转化法得到 的沉默植株，通过生物学测定证明基因沉默后能够显著增加水稻对 褐飞虱的抗性。该基因的分离和克隆以及生物学功能的分析，对于作物的抗虫育种，尤其对 水稻抗褐飞虱育种将起到重要的促进作用。
[0013] 实现本发明的具体技术步骤如下： 1、水稻基因的分离和序列分析 首先从SSH克隆库中分析获得基因片段，以此片段设计正向引物和反向引 物，分别进行3' -RACE和5' -RACE获得该基因的5'端和3'端基因 PCR片段，并测序拼接获 得DNA序列。根据拼接的DNA序列，我们在其5'端和3'端非编码区设计引物OsHI-LRRl-Fl 和OsHI-LRRl-Rl，以水稻茎杆mRNA反转录的cDNA为模板，进行PCR反应，获得他7 基因全长序列。序列见SEQ ID No. 1。根据该序列的开放阅读框（0RF)，推算出 该基因编码蛋白的氨基酸序列，见SEQ ID No. 2。
[0014] 2、褐飞虱为害后的表达特征分析 水稻经褐飞虱为害〇、〇. 5、1、2、4、8、24、48 h后，取其茎杆。利用SV Total RNA Isolation System(Promega)试剂盒提取8个水稻莖杆的total RNA，并利用RNA电泳和分 光光度计（eppendorf)检测其浓度和纯度。用反转录试剂盒（PrimeScript? RT-PCR Kit, TaKaRa)将0. 5 μ g total RNA反转录成cDNA，具体操作参照产品说明书。
[0015] 突光定量 PCR (qRT-PCR)检测使用 SsoFast? probes supermix (Bio-RAD)酶预混 液配制反应体系，使用 CFX96? Real-Time system(Bi〇-RAD, California, USA)定量PCR仪 检测荧光信号。以水稻基因 （TIGR ID: L0C_0s03g50885)作为内参，对他7 的诱导表达特征进行分析（图2)。
[0016] 3、麟，-爾7基因沉默水稻品系的获得及其对褐飞虱抗性的检测 构建RNAi沉默载体以电击法转化农杆菌，获得含有RNAi载体的工程农杆菌。以本实验 室成熟的农杆菌转化法获得含有目的基因的愈伤组织，再分别经过预分化、分化、生根等， 获得基因沉默水稻植株。对转基因水稻品系整个生长周期进行观察，未发现生 理缺陷，能获得正常世代。生物测定试验表明：与野生型植株相比，基因沉默植 株降低了褐飞虱雌成虫的取食和产卵嗜好（图5)和褐飞虱若虫的存活率（图6)，提高了对 褐飞虱的耐受性（图7)。
[0017] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明范围。
[0018] 实施例1、基因的获得和序列分析 1) 水稻茎杆RNA的提取、质量检测及总CDNA第一链合成 2) 以总cDNA第一链为模板，进行PCR反应，获得基因片段 OsHI-LRRl-Fl :5'- tgcagcaggcgagttt-3' ； 0sHI-LRRl-Rl :5'-ACAGAAGCTCATAACTG -3' PCR扩增条件：95°CX3 min -(98?Χ10 sec -68?Χ1 min)X30循环一72?Χ3.5 min，得到特异PCR扩增产物见图1。
[0019] 3 ) 基因碱基分析 将获得的PCR产物送南京金斯瑞公司进行测序，测序结果为序列表中的序列SEQ ID No. 1。我们将此基因命名为
[0020] 实施例2、褐飞虱为害后的表达特征分析 1)褐飞虱的处理 在水稻的茎杆基部固定一个圆筒形玻璃罩(直径4 cm，高8 cm，筒壁均匀分布48个直 径为0.8 mm的透气小孔)，在玻璃罩内接入15头褐飞虱雌成虫后，顶部以海绵密封。接入 褐飞虱后在不同时间点剪取为害部位的外层叶鞘，立即浸入液氮，-80°C保存备用。以套入 空玻璃罩的健康水稻叶鞘作为对照。
[0021] 2 ) RNA的提取及表达特征分析 利用 SV Total RNA Isolation System (Promega)试剂盒提取水稻莖杆的 total RNA，并利用RNA电泳和分光光度计（eppendorf)检测其浓度和纯度。用反转录试剂盒 (PrimeScript? RT-PCR Kit, TaKaRa)将 0.5 yg total RNA 反转录成cDNA，具体操作参 照产品说明书。
[0022] 荧光定量 PCR (qRT-PCR)检测使用 SsoFast? probes supermix (Bio-RAD)酶预 混液配制反应体系，使用 CFX96? Real-Time system(Bi〇-RAD, California，USA)定量 PCR 仪检测荧光信号。以水稻基因 （TIGR ID :L0C_0s03g50885)作为内参，对 的诱导表达特征进行分析，具体反应体系及程序见产品说明书，定量PCR引物及探针如下： OsACTIN-? CGTTTCCGCTGCCCTGAGGTCC -3, OsACTIN-V GGACAGGTTATCACCATTGGT -3, OsACTIN -R ：5, - CCGCAGCTTCCATTCCTATG -3, LRR1-? CCAAGGGCGCATCTCGCCA -3, LRR1-V TCACAGATGTCTCGTTGGCTTC -3, LRR1-R·.^ - ACAGCCCAGTAAGATTGCCG -3, 实施例3、转基因品系的获得 1) 设计引物将你沿-以況i基因的298 bp的特异性区域扩出后，利用DNA亚克隆方法将 其连入pCAMBIA-1301载体，获得RNAi沉默表达载体。并通过电击法，将RNAi载体转入农 杆菌EHA105中，用于后续植物转化。RNAi区引物如下： OsHI-LRRl -F2 :5' -TGAAGGTGCTTGATGTGGCTTGCAA-3' OsHI-LRRl -R2 :5' - CACAAAAAAGAGGGAAACTAAATAC -3' 2) 用含有RNAi载体的农杆菌侵染水稻愈伤组织。将共侵染后的愈伤放在含有潮霉素 的NBDS培养基上筛选培养20天左右，待新的抗性愈伤长出后，将抗性愈伤从母体上剥离， 转入新的筛选培养基NBDS2继代扩繁。将扩繁后的抗性愈伤转入分化培养基MS-RG培养 2-3周。待其长出嫩芽后，切除多余愈伤组织并将嫩芽转入MS-RT培养基生根，分化出完整 的I代植株。
[0023] 3) ?；代转基因植株获得的?\代种子，经含潮霉素的培养基筛选，去除未转入 基因的植株，并单株种植，收获Τ2代种子。对每个单株的种子进行鉴定。获得转 基因的纯合品系，用于后面的生物学功能分析。
[0024] 实施例4、转基因品系的抗虫功能研究 1)雌成虫取食选择性及产卵选择性测定：在小塑料杯中分别放入1株野生型和1株突 变体水稻，苗间距1 cm，2株水稻茎杆基部固定一个圆筒形玻璃罩，在玻璃罩内接入15头褐 飞虱怀卵雌成虫后，顶部以海绵密封。接虫后观察并记录两株苗的着虫数。48 h后，去除所 有褐飞虱，统计每株苗上的产卵量。本试验重复10次。
[0025] 2)初孵若虫存活率测定：在水稻茎杆基部固定圆筒形玻璃罩并密封顶部，玻璃罩 内接入15头褐飞虱初孵若虫，每天观察并记录存活虫数。本试验重复10次。
[0026] 3)选取生长状况一致的水稻，每株接入15头褐飞虱雌成虫，每个品系重复20 次。每天观察水稻的生长情况并进行拍照。上述实验均在温室（26±2°C;光照14 h;湿度 70%-75%)中进行。
[0027] 实施例5、OsHI-LRRl基因在水稻抗虫育种中的应用 (1)以实施例3获得的转OsHI-LRRl基因的纯合品系水稻为材料，分析OsHI-LRRl基 因在水稻抗虫育种中的应用。
[0028] (2)褐飞虱雌成虫分别危害转基因苗与对照苗，如图7所示，18天后对照水稻基 本枯死，而含OsHI-LRRl基因水稻水稻仅外面的叶片枯黄。可见OsHI-LRRl基因可以很好 的应用于抗稻飞虱的水稻抗虫育种。
【权利要求】
1. 一种水稻源抗虫相关基因，其特征在于，它具有SEQ ID No. 1的DNA序列。
2. -种权利要求1所述的抗虫相关基因编码的蛋白，其特征在于，它可以包含SEQ ID No. 2的氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQ ID No. 2的氨基酸残基序列经过一个或多个氨 基酸残基的取代、缺失或者添加且具有与SEQ ID No. 2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID No. 2衍生的蛋白质。
3. -种权利要求1所述水稻源抗虫相关基因在转基因植物中的应用。
4. 一种权利要求1所述水稻源抗虫相关基因在作物育种中的应用。
【文档编号】C12N15/84GK104152462SQ201410347654
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月22日 优先权日:2014年7月22日
【发明者】娄永根, 胡凌飞, 叶萌 申请人:浙江大学