干细胞的产生和保持的制作方法

干细胞的产生和保持的制作方法
【专利摘要】本发明提供通过在存在ALK5抑制剂时培养细胞而产生并且保持多能细胞。
【专利说明】干细胞的产生和保持
[0001]本申请是国际申请号PCT/US2009/068274，国际申请日为2009年12月16日，中国国家申请号为200980156917.8，发明名称为“干细胞的产生和保持”的分案申请。
[0002]发明背景
[0003]尽管从1981年就已经由小鼠建立了胚胎干细胞(ESCs)，但是由各种其它哺乳动物(包括大鼠)衍生它们的对应体的尝试尚未成功。近来，从小鼠和大鼠的植入后卵圆柱期上胚层衍生了多能干细胞(Brons等，Nature (自然)448,191-195 (2007) ;Tesar等，Nature (自然)448，196-199 (2007))。这些新型的干细胞被命名为上胚层干细胞(EpiSCs)。在群落形态和对保持多能性的培养/信号传导需要方面，EpiSCs似乎非常接近地对应于人胚胎干细胞(hESCs)，但是表现出一定范围的与小鼠ES细胞(mESCs)不同的显著的表型和信号传导反应差异。
[0004]白血病抑制因子(LIF)是在存在血清的条件下通过JAK-STAT3途径保持mESCs多能性所必需的(Niwa等，Genes Dev (基因发育)12，2048-2060 (1998))。然而，在不含血清的培养基中，还需要BMP4，以及LIF，以通过诱导分化(Id)蛋白表达的抑制剂(Ying等，Cell (细胞)115,281-292(2003))和抑制 ERK 激活(Qi 等，Proc Natl Acad Sci U SA(美国国家科学院学报)101,6027-6032(2005))来保持mESC的自我更新。与mESCs相反，LIF不能支持EpiSCs/hESCs，其典型地需要碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)/激活蛋白A(Activin A)进行长期的自我更新。未分化的hESCs通过bFGF信号传导表现出高水平的基本 ERK 活性(Dvorak 等，Stem Cells (干细胞)23，1200-1211 (2005))。BMP4 也不支持EpiSC/hESC自我更新，但是相反诱导EpiSC/hESC分化成滋养层或原始内胚层(Bixms等，Nature (自然)448，191-195 (2007) ；Tesar 等，Nature (自然)448，196-199 (2007)；Xu 等，Nat B1technol(自然生物技术)20，1261-1264(2002))。除了 bFGF 之外，已经表明激活蛋白A/Nodal信号传导支持hESCs/EpiSCs的未分化状态(Brons等，Nature (自然)448，191-195(2007) ;Sato 等，Dev B1l (发育生物学)260，404-413 (2003) ;Tesar 等，Nature (自然)448，196-199 (2007))，而对于mESCs不是必要的。这些结果强烈支持下述观点=EpiSCs和hESCs本质上是相似的，并且提出一种吸引人的假说，即，mESCs和EpiSCs/hESCs代表两种不同的多能状态:表示植入前内细胞群(ICM)的mESC-样状态，和表示后期上胚层细胞的EpiSC-样状态。
[0005]mESCs通常可以使用基于滋养层的细胞培养条件而来源于某些小鼠品系(Martin, G.R.,Proc Natl Acad Sci U S A (美国国家科学院学报)78，7634-7638 (1981))。然而，已经证明在相似条件下很难由大鼠衍生真正的ES细胞。已经报道了大鼠ESC-样细胞的建立(Demers 等,Clonin g Stem Cells (克隆干细胞)9, 512-522 (2007) ;Ruhnke 等，StemCells(干细胞)21,428-436(2003) ;Schulze 等，Methods Mol B1l (分子生物学方法)329，45-58(2006) ;Ueda等，PLoS 0NE3, e2800 (2008))，但是这些细胞不能稳定地保持或者缺少真正的体内多能性(例如，不能形成畸胎瘤或对嵌合体没有/有很少的贡献)。类似地，尽管已经衍生了(体外)多能性大鼠EpiSCs，但是大鼠和小鼠EpiSCs都表现出很少的能力或没有能力再结合到植入前的胚胎中并且形成嵌合体(Brons等，Nature (自然)448,191-195(2007) ;Tesar 等，Nature (自然)448，196-199 (2007))。
[0006]最近，通过确定的遗传转导由小鼠和人体细胞产生的诱导的多能干细胞(iPSCs)吸引了众多兴趣(Dimos 等，Science (科学)321,1218-1221 (2008) ；Han, J.，和 Sidhu，K.S.Curr Stem Cell Res Ther (现代干细胞研究和治疗)3，66-74 (2008) ；Takahashi等，Cell (细胞)131,861-872(2007) ；Takahashi, K.，和 Yamanaka，S.，Cell (细胞)126，663-676 (2006) ；Yu 等，Science (科学)318，1917-1920 (2007))。
[0007]发明简述
[0008]本发明提供经过至少一次细胞分裂培养多能细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在充足量的:
[0009]a.ALK5抑制剂(或其它TGF β /激活蛋白途径抑制剂)，和
[0010]b.第二化合物，其选自MEK抑制剂、Erk抑制剂、p38抑制剂、和FGF受体抑制剂中的一种或多种；和
[0011]c.充分的营养足够的时间；
[0012]存在时培养多能动物细胞，以允许至少一次细胞分裂同时保持细胞的多能性。
[0013]在一些实施方案中，所述培养步骤还包括在存在一定量的GSK3 0抑制剂时培养细胞。在一些实施方案中，所述GSK3 0抑制剂是CHIR99021。
[0014]在一些实施方案中，所述第二化合物是MEK抑制剂。在一些实施方案中，所述MEK抑制剂是Η)0325901。
[0015]在一些实施方案中，所述第二化合物是Erk抑制剂。
[0016]在一些实施方案中，所述培养步骤在还存在白血病抑制因子(LIF)时进行。
[0017]在一些实施方案中，所述ALK5抑制剂是A-83-01。在一些实施方案中，所述ALK5抑制剂是SB431542。
[0018]在一些实施方案中，所述多能细胞通过至少5次细胞分裂培养同时保持细胞多能性。
[0019]在一些实施方案中，所述方法还包括向所述多能细胞中引入异源核酸，并且培养所得到的细胞，以允许至少一次另外的细胞分离，同时保持多能性。在一些实施方案中，将异源核酸引入到动物细胞中，然后诱导多能性，再然后进行培养步骤。
[0020]在一些实施方案中，所述细胞是大鼠细胞或人细胞。在一些实施方案中，所述细胞是灵长类、羊、牛、猫、狗、或猪的细胞。
[0021]在一些实施方案中，所述多能细胞是胚胎干细胞。在一些实施方案中，所述多能细胞是诱导的多能干细胞。
[0022]在一些实施方案中，所述细胞是非人动物细胞，并且所述方法还包括将所述多能细胞引入到胚泡中，其中所述胚泡与所述细胞来自相同的动物物种，并且将所述胚泡引入到相同物种的动物的子宫内。在一些实施方案中，所述方法还包括基于来自所述多能细胞的核酸的存在而选择所述动物的嵌合后代。
[0023]本发明还提供多能哺乳动物细胞的培养物。在一些实施方案中，所述培养物包括充足量的下述:
[0024]a.ALK5抑制剂(或其它TGF β /激活蛋白途径抑制剂)，和
[0025]b.第二化合物，其选自MEK抑制剂、Erk抑制剂、p38抑制剂、和FGF受体抑制剂中的一种或多种；
[0026]以允许至少一次细胞分裂，同时保持细胞多能性。
[0027]在一些实施方案中，所述培养物还包括LIF。
[0028]在一些实施方案中，所述培养物还包括一定量的GSK3 0抑制剂。在一些实施方案中，所述GSK3 0抑制剂是CHIR99021。
[0029]在一些实施方案中，所述第二化合物是MEK抑制剂。在一些实施方案中，所述MEK抑制剂是Η)0325901。
[0030]在一些实施方案中，所述第二化合物是Erk抑制剂。在一些实施方案中，所述ALK5抑制剂是A-83-01。在一些实施方案中，所述ALK5抑制剂是SB431542。
[0031]在一些实施方案中，所述细胞是大鼠细胞或人细胞。在一些实施方案中，所述细胞是灵长类动物、绵羊、牛、猫、狗、或猪的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是诱导的多能干细胞或胚胎干细胞。
[0032]本发明还提供一种细胞培养基。在一些实施方案中，所述培养基包括充足量的下述:
[0033]a.ALK5抑制剂(或其它TGF β /激活蛋白途径抑制剂)，和
[0034]b.第二化合物，其选自MEK抑制剂、Erk抑制剂、p38抑制剂、和FGF受体抑制剂中的一种或多种；
[0035]从而在所述培养基中培养多能细胞时，允许至少一次细胞分裂，同时保持细胞多能性。
[0036]在一些实施方案中，所述培养基还包括LIF。
[0037]在一些实施方案中，所述培养基还包括一定量的GSK3 β抑制剂。在一些实施方案中，所述GSK3 0抑制剂是CHIR99021。
[0038]在一些实施方案中，所述第二化合物是MEK抑制剂。在一些实施方案中，所述MEK抑制剂是Η)0325901。
[0039]在一些实施方案中，所述第二化合物是Erk抑制剂。在一些实施方案中，所述ALK5抑制剂是A-83-01。在一些实施方案中，所述ALK5抑制剂是SB431542。
[0040]在一些实施方案中，所述培养基在预先包装的、密封容器中。在一些实施方案中，所述培养基包括DMEM或其它对生长人、大鼠、小鼠或其它动物的细胞相容的培养基。
[0041]本发明还提供分离的多能动物细胞，所述细胞在存在白血病抑制因子(LIF)和骨形态发生蛋白(BMP)时，或在抑制TGFii和激活蛋白信号传导途径，抑制MAPK信号传导途径，和任选地抑制FGF途径时，进行复制并且保持多能性。在一些实施方案中，所述分离的多能动物细胞不是鼠胚胎干细胞(mESC)。在一些实施方案中，所述细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞是人iPS细胞。在一些实施方案中，所述细胞是大鼠细胞。在一些实施方案中，所述细胞是大鼠胚胎干细胞。在一些实施方案中，所述细胞是大鼠iPS细胞。在一些实施方案中，所述细胞在抑制ALK5和MEK时保持多能性。在一些实施方案中，所述细胞包括异源表达盒，其包括但不限于，编码可选择或可检测的标记(例如，碱性磷酸酶)的表达盒。
[0042]与常规培养的hESCs、上胚层干细胞和人诱导的多能细胞相比，本发明的分离的多能细胞表达更高水平的E-1丐粘着蛋白(E-cadherin)。例如，与常规培养的hESCs、上胚层干细胞和人诱导的多能细胞相比，所述分离的多能动物细胞表达2倍更高水平的E-钙粘着蛋白。在一些实施方案中，与常规培养的hESCs、上胚层干细胞和人诱导的多能细胞相比，所述分离的多能动物细胞表达更高水平的标记，其中所述标记包括Gbx2，Dppa3，Klf4，和Rexl。
[0043]在一些实施方案中，在存在ALK5抑制剂，存在选自MEK抑制剂、Erk抑制剂、p38抑制剂、和FGF受体抑制剂的第二化合物时，培养本发明所述分离的多能细胞。在一些实施方案中，本发明的分离的多能细胞通过在存在ALK5抑制剂，和选自MEK抑制剂、Erk抑制剂、P38抑制剂、和FGF受体抑制剂中的一种或多种的第二化合物时培养所述细胞获得或可通过在存在ALK5抑制剂，和选自MEK抑制剂、Erk抑制剂、p38抑制剂、和FGF受体抑制剂中的一种或多种的第二化合物时培养所述细胞获得。例如，本发明的分离的多能细胞通过培养常规培养的EpiSCs、大鼠ESCs、或灵长类动物ESCs而获得或可通过培养常规培养的EpiSCs、大鼠ESCs、或灵长类动物ESCs而获得。
[0044]本发明还提供了增加部分多能哺乳动物细胞的多能性至更加完全多能的细胞的方法。在一些实施例中，所述方法包括:
[0045](a)使所述部分多能细胞与外遗传修饰剂接触，所述外遗传修饰剂选自组蛋白脱乙酰酶抑制剂、组蛋白H3K4去甲基化抑制剂或H3K4甲基化激活剂；
[0046](b)在步骤(a)后，在不存在所述外遗传修饰剂时和用下述中的两种或多种培养所述细胞:(i)ALK5抑制剂，(ii) MEK抑制剂，Erk抑制剂，或p38抑制剂，和(iii)FGF受体抑制剂，由此产生比所述部分多能哺乳动物细胞更加完全多能的细胞。
[0047]在一些实施方案中，所述方法还包括:
[0048](c)在步骤(b)后用下述培养所述部分多能哺乳动物细胞:(i)ALK5抑制剂，(ii)MEK抑制剂，Erk抑制剂，或p38抑制剂，和(iii) FGF受体抑制剂和(iv)GSK3抑制剂。
[0049]在一些实施方案中，培养步骤(a)和/或(b)和/或(C)还包括在存在白血病抑制因子(LIF)时培养所述部分多能哺乳动物细胞。
[0050]在一些实施方案中，所述部分多能细胞是上胚层干细胞。
[0051]在一些实施方案中，所述部分多能细胞不表达至少一种下述标记，所述标记选自由0ct4，Nanog，SSEA-UP REX-1组成的组，并且所述更加完全多能的细胞表达一种或多种或所有所述标记。
[0052]在一些实施方案中，所述部分多能细胞不表达ALP-1，并且所述更加完全多能的细胞表达ALP-1。
[0053]在一些实施方案中,所述外遗传修饰剂是丙戍酸或硫酸反苯环丙胺(parnate)。
[0054]附图简述
[0055]图1.mESC-样riPSCs可以由通过反转录病毒转导0ct4, Sox2和Klf4后的大鼠WB-F344 细胞产生，并且在 LIF，0.5μΜ PD0325901,0.5 μ M Α-83-01 和 3μΜ CHIR99021 的组合下捕获/保持。在转导后10天观察到ESC-样的群落(A)，但是不能在常规mESC培养条件下保持(B)。在存在0.5 μ M PD0325901和3 μ M CHIR99021时，riPSCs可以短期保持在培养物中但是表现出广泛的自发性分化(C)。使用0.5μΜ PD0325901,3yM CHIR99021,和0.5μΜ Α-83-01的组合，riPSCs可以长期且同质自我更新(D)，并且在培养物中形成mESC-样圆顶群落(E)。免疫细胞化学揭示riPSCs表达典型的mESC标记，诸如0ct4(F)，Sox2 (G)，SSEA-1 (H，绿色)和Nanog (H，红色)。4个克隆的riPSC株系的RT-PCR分析证实内源性典型多能标记的表达(I)，但是病毒转导的基因在很大程度上被沉默。riPSC克隆的0ct4启动子表现出去甲基化模式并且与亲本WB-F344细胞的模式明显不同(J)。
[0056]图2.riPSCs在体外和体内具有多能发育潜能。免疫染色显示riPSCs在体外可以分化成内胚层(白蛋白和Pdxl) (A和B)，神经外胚层(β II1-微管蛋白，Tujl) (C)和中胚层(Brachyury) (D)衍生物。并且，在SCID小鼠中，riPSCs可以形成畸胎瘤，所述畸胎瘤由所有三个胚层组成(E~H)。另外，在注射到Brown-Norway大鼠胚泡中后，具有WB F344背景的riPSCs能够产生嵌合体大鼠(I)。相对放大倍率:A~E(100X)，F~H和J~Q(200X)。
[0057]图3.产生新型“mESC-样’liPSCs。将MR90人成纤维细胞通过慢病毒转导0ct4，Sox2, Nanog，和Lin28。转导后3周观察到hiPSC群落(A)，在转导后第4周挑取群落并且稳定保持在hLIF，0.5μΜ PD0325901,0.5μΜ Α-83-01，和 3μΜ CHIR99021 的混合物中。这样的hiPSCs与mESCs类似形成圆顶群落(B)。在这样的条件下，hiPSCs对ALP(C)和其它典型的多能标记(D~I)是阳性的。4个克隆的riPSC株系的RT-PCR分析证实内源性多能基因的表达(J)，但是病毒转导的基因在很大程度上被沉默。hiPSCs克隆的0ct4启动子表现出与常规培养的人ES细胞相似的去甲基化模式，但是与亲本IMR90成纤维细胞的模式明显不同⑷。提供了 hiPSCs的核型分析(L)。
[0058]图4.免疫染色显示hiPSCs在体外可以有效地分化成内胚层(白蛋白)(A)，神经外胚层(β II1-微管蛋白，TujI) (B)和中胚层(Brachyury) (C)衍生物。在植入到SCID小鼠中后，hiPSCs可以形成畸胎瘤，所述畸胎瘤由所有三个胚层组成，包括神经上皮样结构(外胚层)(D)，微管样结构(内胚层)(D)，软骨样结构(中胚层)(E)。相对放大倍率:A (100 X)，B ~E(200X)。
[0059]图5.不同的小分子组合对保持riPSCs在培养中的多能性的作用。将riPSCs胰蛋白酶化为单细胞，并且以103个细胞/孔的密度接种到6-孔板中，并且用不同的抑制剂组合处理。5天后，进行ALP染色以显现riPSC群落(A)。从10个随机的40 X视野计数每种条件的ALP阳性群落，并且相对群落数目总结在B中。
[0060]图6.EpiSCs在mESC生长条件下分化，并且不容易转化为ICM/mESC-样状态。(A)在补充了 LIF的常规mESC生长培养基中，鼠ESCs Rl生长为致密的圆顶群落，并且所述群落表现出阳性ALP活性(上左图)。在补充了 bFGF的常规hESC培养基中，EpiSCs生长为大而扁平的群落，并且所述群落表现出阴性ALP活性(上右图)。EpiSCs在补充了 LIF的常规mESC生长培养基中分化(下左图)；EpiSCs在补充了 LIF和(λ 5μΜ MEK抑制剂Η)0325901，0.1 μ M EGFR 抑制剂 PD173074 与 3 μ M GSK3 抑制剂 CHIR99021 (m/MFGi)的常规 mESC 生长培养基中分化(下右图)。(B)产生转化的细胞的示意图。将EpiSCs胰蛋白酶化成单细胞，并且在mESC自我更新条件下接种到饲养细胞上，补充所示的化学化合物约4天，以诱导转化，然后再选择4天。随后再次平板接种培养物并且进一步选择和再扩增2周，在该时间过程中挑取稳定的克隆。(C)通过选择性ALK4/5/7抑制剂A-83-01 (0.5 μ Μ)抑制TGF β信号传导诱导EpiSCs形成表达ALP的更致密的圆顶群落。(D)这些群落可以在补充了 LIF和0.5μΜ Α-83-01,0.5μ M PD0325901，0.1 μ M PD173074%3yM CHIR99021 (mMFGi)的mESC生长培养基中进一步稳定扩增。(E)LSD抑制剂硫酸反苯环丙胺诱导EpiSCs形成表达ALP的更致密的圆顶群落。这些群落可以在mMFGi或(F)mAMFGi条件下进一步稳定扩增。注意mESC-样圆顶群落和阳性ALP活性。刻度条，50 μ m。
[0061]图7.通过用硫酸反苯环丙胺与ALK4/5/7，MEK, FGFR和GSK3的抑制剂处理，EpiSCs转化为ICM/mESC-样状态。(A)由三种类型的化合物-处理的细胞产生嵌合体的效率。(B)在将聚集的胚胎植入到假孕小鼠中后，在成体小鼠中通过硫酸反苯环丙胺/mAMFGi的条件由EpiSCs转化的稳定的mESC-样细胞形成嵌合体。野鼠色涂膜色源自硫酸反苯环丙胺/mAMFGi细胞。(C)在多个成体组织中存在GFP整合的PCR基因型。⑶通过由用GFP标记的硫酸反苯环丙胺/mAMFGi细胞产生的荧光检查E13.5胚胎，并且在多个胚胎组织中观察到GFP-阳性细胞(较高分辨率的图片显示在图1OA中)。(E)通过FACS分离性腺中的GFP/SSEA-1双重阳性细胞，并且通过实时PCR检验种系标记。结果证明在硫酸反苯环丙胺/mAMFGi细胞-形成的种系谱系中种系标记Blimpl和Stella的特异性表达。条:土STDV。
[0062]图8.转化的硫酸反苯环丙胺/mAMFGi细胞的分子表征。㈧免疫细胞化学表明多能标记0ct4(绿色)，Nanog (红色)，和SSEA-1 (红色)在硫酸反苯环丙胺/mAMFGi细胞中的均匀表达。(B)通过半定量RT-PCR分析特异性ICM标记基因(Rex-l，Pecaml，Daxl，Dppa5，Esrrb, Fgf4,和 Fbxol5)、种系能力相关的标记基因(germline competence associatedmarker genes) (Stella 和 Stra8)、和 Epiblast 基因(fgf5)在 mESCs, EpiSCs,和硫酸反苯环丙胺/mAMFGi细胞中的表达。(C)mESCs，EpiSCs，和硫酸反苯环丙胺/mAMFGi细胞的转录组(transcriptome)分析表明，与EpiSCs相比,硫酸反苯环丙胺/mAMFGi细胞要与mESCs相似得多。两种生物学复本用于所有三种细胞类型。(D)通过亚硫酸氢盐基因组测序甲基化分析Stella和Fgf4启动子。空心圆和实心圆分别表示未甲基化的和甲基化的CpGs。(E)多种细胞中在Stella基因座中所示的组蛋白修饰的ChIP-QPCR分析。用所示的抗体由不含饲养细胞培养的EpiSCs，Rl-mESCs，和硫酸反苯环丙胺/mAMFGi细胞免疫沉淀基因组DNAs，然后使用对编码Stella的内源性基因组基因座特异性的引物组进行Q-PCR分析。将组蛋白修饰的水平表示为插入(input)的百分数。IgG作为无抗体对照。
[0063]图9.转化的硫酸反苯环丙胺/mAMFGi细胞的功能表征。(A)硫酸反苯环丙胺/mAMFGi具有与mESCs相似的生长速率。将Rl-mESCs和硫酸反苯环丙胺/mAMFGi细胞每3天传代，并且每24小时计数细胞数目。(B)硫酸反苯环丙胺/mAMFGi细胞在体外可以有效地分化成三个胚层中的细胞，包括特征性的神经细胞(β II1-微管蛋白和MAP2ab阳性的)，心肌细胞(心脏肌钙蛋白和MHC阳性的)，和内胚层细胞(Soxl7或白蛋白阳性的)。细胞核用DAPI染色。(D)BMP4对在EpiSCs，mESCs，和硫酸反苯环丙胺/mAMFGi细胞中引入中胚层标记(Brachyury),滋养层标记(Cdx2),和原始内胚层标记(Gata6)表达有不同的影响。(E)在单层和化学限定的条件下的定向逐步心肌细胞分化表明，硫酸反苯环丙胺/mAMFGi细胞与Rl-mESCs共有相似的分化反应，并且与EpiSCs不同。将细胞用CT3染色和搏动表型(beating phenotype)进行表征。
[0064]图10.硫酸反苯环丙胺/mAMFGi细胞有效地形成嵌合体小鼠。(A)来自嵌合体胚胎的组织。在性腺、脑、心脏、肠、肺和肾中观察到由硫酸反苯环丙胺/mAMFGi细胞形成的GFP阳性细胞。⑶嵌合体成体小鼠的GFP基因型。随机挑选5只小鼠，并且通过基因组PCR分析在5种不同的组织，即，心脏、肺、肝、脑、和脾中的GFP整合。在2只成体小鼠的所有5种组织，在3只小鼠的4种组织中的GFP整合的阳性检测，证实硫酸反苯环丙胺/mAMFGi细胞在体内可能形成三个胚层(中胚层、内胚层和外胚层)。
[0065] 图11.在有饲养细胞或无饲养细胞的条件下，多能标记在转化的硫酸反苯环丙胺/mAMFGi细胞中的均匀表达。(A)将硫酸反苯环丙胺/mAMFGi细胞用GFP标记，并且在饲养细胞上增殖。免疫染色结果表明GFP和多能标记0ct4 (红色)，Nanog (红色)，和SSEA-1 (红色)的均匀表达。(B)由单一的硫酸反苯环丙胺/mAMFGi细胞发育未分化的0ct4-阳性群落与由单一的0G2-ES细胞发育一样有效。在不含饲养细胞和N2B27-化学限定的条件下进行单细胞接种后，将群落扩增几代。刻度条，50ym。(C)在不存在LIF时，硫酸反苯环丙胺/mAMFGi细胞分化并且失去0ct4表达。在不含饲养细胞和N2B27-化学限定的条件下进行单细胞接种后，硫酸反苯环丙胺/mAMFGi细胞扩增；显示补充生长因子。
[0066]图12.在转化的硫酸反苯环丙胺/mAMFGi细胞和Rl_mESC细胞中检测到STELLA表达，但是在EpiSCs中没有检测到。免疫染色结果显示STELLA和DAPI的表达。
[0067]定义
[0068]术语“多能”或“多能性”指具有产生这样的后代的能力的细胞，所述后代能够在适当条件下经历分化成为共同展示与来自全部三胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞谱系相关的特征的细胞类型。多能干细胞可以形成出生前、出生后或成年动物的许多或全部组织。标准的本领域公认测试，诸如在8-12周龄SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力，可以用于确定细胞群的多能性，然而，不同多能干细胞特征的鉴定也可以用于检测多能细胞。细胞多能性是一种连续体，范围从可以正确形成每种胚胎细胞的完全多能细胞(例如，胚胎干细胞和iPSCs)到不完全或部分多能细胞，所述不完全或部分多能细胞可以形成所有三种胚层，但是可能不表现出完全多能细胞的所有特征，诸如例如，种系传递(genmlinetransmiss1n)或产生完整的生物体的能力。在具体的实施方案中，细胞的多能性由不完全或部分多能细胞增加至更加多能的细胞，或者，在某些实施方案中，增加至完全多能细胞。例如，多能性可以通过畸胎瘤形成、种系传递、和四倍体配体互补测定。在一些实施方案中，多能性基因或多能性标记的表达，如本文其它地方所讨论的，可以用来测定细胞的多能性。
[0069]“多能干细胞特征”意指将多能干细胞与其他细胞相区别的细胞特征。产生能够在适当条件下经历分化成为共同展示与来自全部三胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞谱系相关的特征的细胞类型的后代的能力是多能干细胞特征。表达或不表达某些分子标记物组合也是多能干细胞特征。例如，人多能干细胞表达来自以下非限制性列表的标记物中的至少一些，且任选地表达其全部:SSEA_3，SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E,ALP, Sox2, E-钙粘着蛋白，UTF-1，0ct4，Rexl，和Nanog。与多能干细胞相关的细胞形态学也是多能干细胞特征。
[0070]术语“文库”，根据其在本领域中的一般用法，用于表示分子集合，其任选地以可以鉴别各成员的方式来组织和/或分类。文库可以包括，但不仅限于，组合化学药品文库，天然产物文库，和肽文库。
[0071]“重组”多核苷酸是不以其天然状态存在的多核苷酸，例如，所述多核苷酸包括自然界中不存在的核苷酸序列，或所述多核苷酸处于除其天然存在的背景以外的背景中，例如，与其在自然界中典型接近的核苷酸序列分开，或与其典型不接近的核苷酸序列相邻(或相连)。例如，可以将研究的序列克隆至载体中，或否则与一种或多种另外的核酸重组。
[0072]“表达盒” 指包括启动子或与编码蛋白的序列可操作相连的其他调控序列的多核苷酸。
[0073]术语“启动子”和“表达控制序列”在本文中用于指指导核酸转录的核酸控制序列阵列。用于本文中时，启动子包括接近转录起始点的必需核酸序列，诸如在聚合酶II型启动子的情形中，包括TATA元件。启动子还任选地包括远端增强子或阻抑子元件，其可以位于距转录起始点多至数千碱基对处。启动子包括组成型和诱导型启动子。“组成型”启动子是在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下有活性的启动子。术语“可操作相连”指核酸表达控制序列(诸如启动子、或转录因子结合位点阵列)和第二核酸序列之间的功能性连接，其中所述表达控制序列指导对应于所述第二序列的核酸转录。
[0074]“异源序列”或“异源核酸”，用于本文中时，是来源于与特定宿主细胞异源的来源的序列或核酸，或如果来自相同来源，则由其初始形式进行修饰。因此，细胞中的异源表达盒不是特定宿主细胞内源的表达盒，例如通过与来自表达载体的核酸序列而非染色体DNA相连，与异源启动子相连，与报道基因相连等。
[0075]术语“试剂”或“测试化合物”指用于本文所述的筛选测定中的任一化合物。试剂可以是，例如，有机化合物，多肽(例如，肽或抗体)，核酸(例如，DNA、RNA、双链、单链、寡核苷酸、反义RNA、小抑制RNA、微小RNA、核糖核酸酶等)，寡糖，脂质。通常，本发明筛选方法中使用的试剂具有小于10，000道尔顿，例如，小于8000，6000，4000，2000道尔顿，例如，50-1500，500-1500, 200-2000, 500-5000之间道尔顿的分子量。测试化合物可以采用测试化合物文库的形式，诸如提供充足多样性范围的组合文库或随机文库。测试化合物任选地与融合配偶体，例如靶向化合物，拯救化合物，二聚化合物，稳定化合物，可寻址化合物(addressable compounds),和其他功能结构部分相连。常规地，具有有用特性的新化学个体通过下述来产生:鉴定具有一些理想特性或活性，例如在某些条件下诸如本文中所述的条件下诱导多能性的能力的测试化合物(称为“前导化合物”)，产生所述前导化合物的变体，和评估那些变体化合物的特性和活性。通常，将高通量筛选(HTS)方法用于所述分析。
[0076]术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换地用于指采用单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语包括包含已知的核苷酸类似物或修饰的主链残基或连锁的核酸，其是合成的、天然存在的、和非天然存在的，其具有与参照核酸类似的结合特性，且其以与参照核苷酸类似的方式代谢。所述类似物的实例包括，但不仅限于，硫代磷酸酯，磷酰胺，甲基膦酸酯(methyl phosphonates)，手性-甲基膦酸酯，2_0_甲基核糖核酸，肽-核酸(PNAs)。
[0077]除非另外指出，特定核酸序列还包括其保守修饰变体(例如，简并密码子置换)和互补序列，以及明确指出的序列。特别地，简并密码子置换可以通过产生这样的序列来获得，在所述序列中，一个或多个所选(或全部)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer 等，Nucleic Acid Res.(核酸研究)19:5081 (1991) ；0htsuka等，J.B1l.Chem.(生物化学杂志)260:2605-2608(1985) ；Rossolini 等，Mol.Cell.Probes (分子细胞探针)8:91-98 (1994))。
[0078]表达或活性的“抑制剂”、“活化剂”和“调节剂”分别用来指利用关于所述靶蛋白(或编码多核苷酸)表达或活性的体外和体内测定所鉴定的抑制分子、活化分子或调节分子，例如，配体、激动剂、拮抗剂、及其同系物和模拟物。术语“调节剂”包括抑制剂和活化剂。抑制剂是，例如，抑制所述靶蛋白表达或与之结合，部分或全部阻断刺激或蛋白酶抑制剂活性，降低、防止、延迟活化，失活，脱敏，或下调所述靶蛋白活性的试剂，例如拮抗剂。活化剂是例如，诱导或活化所述靶蛋白表达或与之结合，刺激、增加、开放、活化、促进、增强活化或蛋白酶抑制剂活性，致敏或上调所述靶蛋白(或编码多核苷酸)的活性，例如，激动剂。调节剂包括天然存在的和合成的配体，拮抗剂和激动剂(例如，起激动剂或拮抗剂功能的小化学分子、抗体等)。所述关于抑制剂和活化剂的测定包括，例如，将推定的调节剂化合物应用到表达所述靶蛋白的细胞，然后确定对所述靶蛋白活性的功能性作用，如上所述。将用潜在的活化剂、抑制剂、或调节剂处理的包括所述靶蛋白的样品或测定与无抑制剂、活化剂、或调节剂的对照样品进行比较，以检验作用程度。对照样品(未用调节剂处理)被赋予100%的相对活性值。当活性值相对于对照为约80%，任选50%或25，10%，5%或1%时，实现所述靶蛋白的抑制。当活性值相对于对照为约110 %，任选150 %，任选200，300 %，400 %，500 %，或1000-3000 %或更高时，实现所述靶蛋白的活化。
[0079]“Oct多肽”指Octomer转录因子家族的任一天然存在成员，或其保留与最接近的相关天然存在家族成员相类似的转录因子活性(在至少50%，80%，或90%活性之内)的变体，或至少包括天然存在家族成员的DNA结合结构域的多肽，并且可以进一步包括转录活化结构域。示范性 Oct 多肽包括,例如，Oct-1, Oct-2, 0ct-3/4, Oct-6, Oct-7, Oct-8,0ct-9，和Oct-11。0ct3/4(本文中称为"0ct4 ")，其包含POU结构域，其为在Pit_l，Oct-1, Oct-2,和 uric-86 之间保守的 150 个氨基酸序列。参见 Ryan, A.K.&Rosenfeld,M.G.Genes Dev.(基因发育)11，1207-1225 (1997)。在一些实施方案中，与天然存在Oct多肽家族成员诸如与以上列出的那些或诸如Genbank登记号NP_002692.2 (人0ct4)或NP_038661.1(小鼠0ct4)列出的那些相比，变体在其整个序列上具有至少85%、90%或95%的氨基酸序列同一性。Oct多肽(例如，0ct3/4)可以来自于人、小鼠、大鼠、牛、猪、或其它动物。一般地，将使用与所操作的细胞物种为相同物种的蛋白。
[0080]“Klf多肽”指Krilppel样因子(Klfs)家族的任一天然存在成员，含有与果蝇(Drosophila)胚胎模式调控子Kriippel类似的氨基酸序列的锌指蛋白，或保留与最接近相关的天然存在家族成员相类似的转录因子活性(在至少50%，80%，或90%活性之内)的天然存在的成员的变体，或至少包括天然存在家族成员的DNA结合结构域的多肽，并且可以进一步包括转录活化结构域。参见，Dang,D.T.,Pevsner, J.&Yang, VW..Cell B1l.(细胞生物学)32，1103-1121 (2000)。示范性 Klf 家族成员包括，Klfl, Klf2, Klf3, Klf-4, Klf5,Klf6, Klf7, Klf8, Klf9, KlflO, Klfll, Klfl2, Klfl3, Klfl4, Klfl5, Klf 16,Klfl7。发现Klf2和Klf-4是能够在小鼠中产生iPS细胞的因子，并且相关的基因Klfl和Klf5也能够在小鼠中产生iPS细胞,虽然效率降低。参见,Nakagawa,等,Nature B1technology (自然生物技术)26: 101-106 (2007)。在一些实施方案中，与天然存在Klf多肽家族成员诸如与以上列出的那些或诸如Genbank登记号CAX16088 (小鼠Klf4)或CAX14962 (人Klf4)列出的那些相比，变体在其整个序列上具有至少85 %、90 %或95 %的氨基酸序列同一性。Klf多肽(例如，Klfl，Klf4，和Klf5)可以来自于人、小鼠、大鼠、牛、猪、或其它动物。一般地，将使用与所操作的细胞物种为相同物种的蛋白。就本文中描述的KLF多肽而言，其可以用雌激素-相关受体β (Essrb)多肽替换。因此，意欲对于本文中所述的各种Klf多肽实施方案同等地描述使用Essrb替代Klf4多肽的相应的实施方案。
[0081]“Myc多肽”指Myc家族的任一天然存在成员(参见,例如Adhikary, S.&Eilers,M.Nat.Rev.Mol Cell B1l.(自然分子细胞生物学综述)6:635-645 (2005))，或其保留与最接近相关的天然存在家族成员相类似的转录因子活性(在至少50%，80%，或90%活性之内)的变体，或至少包括天然存在家族成员的DNA结合结构域的多肽，并且可以进一步包括转录活化结构域。示范性Myc多肽包括,例如，c-Myc,N_Myc和L-Myc。在一些实施方案中，与天然存在Myc多肽家族成员诸如与以上列出的那些或诸如Genbank登记号CAA25015 (人Myc)列出的那些相比，变体在其整个序列上具有至少85%、90%或95%的氨基酸序列同一性。Myc多肽(例如，c-Myc)可以来自于人、小鼠、大鼠、牛、猪、或其它动物。一般地,将使用与所操作的细胞物种为相同物种的蛋白。
[0082]“Sox多肽”指SRY-相关的HMG-box (Sox)转录因子的任一天然存在成员，其特征在于存在高运动基团(high-mobility group) (HMG)结构域,或其保留与最接近相关的天然存在家族成员相类似的转录因子活性(在至少50^,80%,或90%活性之内)的变体，或至少包括天然存在家族成员的DNA结合结构域的多肽，并且可以进一步包括转录活化结构域。参见，例如，Dang, D.T.，等Int.J.B1chem.Cell B1l.(国际生物化学细胞生物学杂志)32:1103-1121 (2000)。示范性 Sox 多肽包括，例如，Soxl, Sox-2, Sox3, Sox4, Sox5,Sox6，Sox7，Sox8，Sox9，SoxlO，Soxll，Soxl2，Soxl3，Soxl4，Soxl5，Soxl7，Soxl8，Sox-21,和Sox30。已经表明Soxl以与Sox2相似的效率产生iPS细胞，并且还已经表明基因Sox3，Soxl5和Soxl8也产生iPS细胞，虽然其效率略低于Sox2。参见，Nakagawa,等，NatureB1technology (自然生物技术)26:101-106 (2007)。在一些实施方案中，与天然存在Sox多肽家族成员诸如与以上列出的那些或诸如Genbank登记号CAA83435 (人Sox2)列出的那些相比，变体在其整个序列上具有至少85%、90%或95%的氨基酸序列同一性。Sox多肽(例如，Soxl, Sox2, Sox3, Soxl5，或Soxl8)可以来自于人、小鼠、大鼠、牛、猪、或其它动物。一般地，将使用与所操作的细胞物种为相同物种的蛋白。
[0083]发明详述
[0084]1.介绍
[0085] 本发明基于意外的发现，即，ALK5抑制剂显著提高细胞的保持，且任选地在细胞中诱导多能性。组合ALK5抑制剂和MAPK抑制剂(例如，MEK抑制剂，Erk抑制剂或p38抑制剂)或组合ALK5抑制剂与FGF途径抑制剂(例如，FGF受体抑制剂)允许:
[0086]以新的功能特征保持细胞的多能性，所述新的功能特征在下文中定义，并且显著不同于常规的人胚胎干细胞或先前所述的诱导的多能干细胞(例如，在美国专利号5，843 ；6，200，806 ;和7，029，913中)，并且更类似于mESC特征；和
[0087]例如，与先前已知的保持多能性的方法(例如，包括GSK3和MEK抑制剂-参见W02008/015418)相比，极大地提高细胞的效率和稳定性。实际上，令人惊讶的是，ALK5的抑制剂有效地部分提高多能性的保持，因为本领域目前集中在激动而不是拮抗TGFii途径从而刺激多能性。参见，例如，WO 2008/056173。
[0088]本发明部分提供细胞培养物，其包含ALK5抑制剂(或其它TGFβ /激活蛋白途径抑制剂)和MAPK抑制剂或FGF信号传导途径抑制剂，任选地包含哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞在存在所述抑制剂的条件下已经是多能性的或将是多能性的或已经被诱导为多能性的。任选地，所述细胞培养物还可以包括GSK3 0抑制剂和/或白血病抑制因子(LIF)。其它培养基成分和条件可以是本领域通常已知的且包括，例如，基本培养基成分，维生素，矿物质等。
[0089]保持细胞为多能性的能力允许以另外将是不可能的多种方式研究和使用所述细胞。例如，多种多能干细胞在培养中迅速分化或死亡，并且因此不允许进行筛选测定、遗传改造、和其它需要或便利地保持多能性某段时间或经过多次细胞传代(例如，细胞分裂)的应用。本发明允许人们克服这样的问题。
[0090]I1.培养物
[0091 ] 提供细胞培养物，其包括ALK5抑制剂(或其它TGF β /激动蛋白途径抑制剂)，任选地具有MAPK (例如，MEK或Erk或ρ38抑制剂)或FGF信号传导抑制剂(例如，FGF受体抑制剂)，从而诱导或保持哺乳动物细胞的多能性。在一些实施方案中，用所述抑制剂培养的细胞具有在实施例中所述的特征，包括但不限于，在培养物中形成圆顶群落，表达ESC标记(例如，0ct4, Sox2，和Nanog)，具有几乎完全的0ct4启动子去甲基化，表达Rex-1和ALP (例如，在植入后阶段的上胚层和EpiSCs中不存在的ESCs和早期上胚层标记)，在体外分化为内胚层、神经外胚层、和中胚层的能力以及体内多能性特征，诸如形成畸胎瘤(例如，在SCID小鼠中)的能力，并且对于非人细胞，当注射到胚泡中并且植入到接受体子宫内时，形成嵌合体后代的能力。此外，在一些实施方案中，培养中的细胞在相同的培养条件中时保持所述特征持续多次细胞传代，例如，至少1，2，3，4，5，7，10，20，30，或更多代。
[0092]所述细胞培养物可以任选地还包括GSk3 β抑制剂和LIF中的一种或两种。如在实施例中所解释的，在一些实施方案中，存在LIF可以提高多能细胞的长期保持(例如，超过10代)，并且因此充足量的LIF可以包含在培养物中，从而允许长期保持多能性。此外，有或无LIF，还可以包括充足量的GSK3 0抑制剂。在一些实施方案中，GSK3 0抑制剂的量足以提高培养效率，即，提高所形成的阳性多能群落的数量。
[0093]每种抑制剂的量可以不同，并且可以取决于精确的培养条件、所用的具体抑制剂、和培养的细胞类型，为最佳优点而确定。在一些实施方案中，本发明的培养物包括0.05-10 μ Μ,例如，0.1-1 μ Μ,例如，0.5 μ M 的 ALK5 抑制剂(例如，Α-83-01，和 0.1 ~20 μ Μ,例如，2~10 μ M SB431542)。本发明人已经发现TGF-β RI激酶抑制剂11 [2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1，5- 二氮杂萘]可以用作ALK5抑制剂，如本文所述，例如以约1.5 μ M的浓度使用。因此，在一些实施方案中，本发明的培养物包括0.05-20 μ Μ，例如，0.l-ΙΟμΜ的TGF-13RI激酶抑制剂II。在一些实施方案中，本发明的培养物包括10ηΜ-5μΜ，例如，50ηΜ-1μΜ的FGF途径抑制剂(例如，PD173074)。在一些实施方案中，本发明的培养物包括0.05-50 μ Μ，例如，0.1-5 μ Μ，例如，0.5 μ M的MEK抑制剂(例如，PD0325901)。在一些实施方案中，本发明的培养物包括0.05-20 μ Μ，例如，0.5-5 μ Μ，例如，
3μ M 的 GSK3 β 抑制剂(例如，CHIR99021)。
[0094] TGF^受体(例如，ALK5)抑制剂可以包括抗体，其显性阴性变体和靶向TGFβ受体(例如，ALK5)的反义核酸。示例性的TGF β受体/ALK5抑制剂包括，但不限于，SB431542 (参见，例如,Inman,等，Molecular Pharmacology (分子药理学)62 (I):65-74(2002))，A-83-01，也已知为3-(6-甲基-2-吡啶基)-N_苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代酰胺(参见,例如，Tojo,等，Cancer Science (癌症科学)96 (11):791-800(2005)，并且例如可从Toicris B1science (Toicris生物科学)商购获得)；TGF- β RI激酶抑制剂II [2- (3- (6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑_4_基)-1，5- 二氮杂萘]；2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1Η-吡唑-4-基)-1，5_ 二氮杂萘，Wnt3a/B10(参见，例如，Dalton,等，W02008/094597,通过引用结合于此)，BMP4(参见，Dalton,同前所述)，GW788388 (- {4- [3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]吡啶 _2_ 基} N-(四氢-2H-吡喃-4-基)苯甲酸胺)(参见,例如,Gellibert,等,Journal of Medicinal Chemistry (医学化学杂志)49 (7):2210-2221 (2006))，SM16 (参见，例如，Suzuki，等，Cancer Research (癌症研究)67(5):2351-2359(2007)), IN-1130 (3-((5-(6-甲基吡啶-2-基)-4-(喹喔啉-6-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)苯甲酰胺)(参见，例如，Kim，等，Xenob1tica38(3):325-339 (2008))，GW6604 (2-苯基-4- (3-吡啶-2-基-1H-吡唑 _4_ 基)吡啶)(参见，例如，de Gouville,等，Drug News Perspective (药物信息观点)19 (2):85-90(2006)),SB-505124 (2-(5-苯[1，3]间二氧杂环戊烯_5_基-2-叔-丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶氢氯化物)(参见，例如，DaCosta,等,Molecular Pharmacology (分子药理学)65(3):744-752(2004))和嘧啶衍生物(参见，例如，在Stiefl，等，W02008/006583中列出的那些，通过引用结合于此)。不意欲限制本发明的范围，据信ALK5抑制剂影响间质向上皮的转化/转变(MET)过程。TGFii/激活蛋白途径是上皮向间质转变(EMT)的推动剂。因此，抑制TGF β /激活蛋白途径可以促进MET (即，重编程)过程。
[0095]考虑本文中显示抑制ALK5的作用的数据，据信TGF0 /激活蛋白途径的抑制将具有相似的作用。因此，TGFii/激活蛋白途径的任何抑制剂(例如，上游或下游)可以与本文每段中所述的ALK5抑制剂组合使用或替代ALK5抑制剂使用。示例性的TGF β /激活蛋白途径抑制剂包括，但不限于:TGF β受体抑制剂，SMAD2/3磷酸化抑制剂，SMAD2/3和SMAD4相互作用抑制剂，以及SMAD6和SMAD7的激活剂/激动剂。此外，下文所述的分类仅是为了组织目的，并且本领域技术人员已知化合物可以影响途径中的一点或多点，并且因此化合物可以在多于一种所定义的分类中起作用。
[0096]TGF^受体抑制剂可以包括抗体，其显性阴性变体和靶向TGFii受体的反义核酸。抑制剂的具体实例包括但不限于，SU5416 ;2-(5_苯[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基-2-叔-丁基-3Η-咪唑基-4-基)-6-甲基吡啶氢氯化物(SB-505124);乐地单抗(Ierdelimumb) (CAT-152);美替木单抗(metelimumab) (CAT-192) ;GC_1008 ；ID11 ；AP-12009 ；AP-11014 ；LY550410 ；LY580276 ；LY364947 ；LY2109761 ；SB-505124 ；SB-431542 ；SD-208 ；SM16 ;NPC_30345 ；Ki26894 ；SB-203580 ;SD_093 ;格列卫(Gleevec) ;3，5，7，2 '，
4'-五轻黄酮(3, 5, 7, 2 ' , 4 ' -pentahydroxyf lavone)(桑色素(Morin));激活蛋白-M108A ；P144 ;可溶TBR2_Fc ;和靶向TGF β受体的反义转染的肿瘤细胞。(参见，例如，Wrzesinski,等,Clinical Cancer Research (临床癌症研究)13 (18):5262-5270 (2007)；Kaminska,等，Acta B1chimica Polonica52(2):329-337(2005);和 Chang,等，Frontiersin B1science (生物科学前沿)12:4393-4401 (2007))。
[0097]SMAD2/3磷酸化的抑制剂可以包括抗体，其显性阴性变体和靶向SMAD2或SMAD3的反义核酸。抑制剂的具体实例包括PD169316 ；SB203580 ；SB-431542 ；LY364947 ;A77_01 ；和3,5,7,2' ,4 '-五轻黄酮(桑色素(Morin))。(参见，例如，Wrzesinski,同前所述；Kaminska,同前所述；Shimanuki,等，Oncogene (癌基因)26:3311-3320 (2007)；和Kataoka,等，EP1992360,通过引用结合于此。)
[0098]SMAD2/3和smad4相互作用的抑制剂可以包括抗体，其显性阴性变体和靶向SMAD2, SMAD3和/或smad4的反义核酸。SMAD2/3和SMAD4相互作用抑制剂的具体实例包括但不限于，Trx-SARA, Trx-xFoxHlb 和 Trx-Lefl.(参见，例如，Cui,等,Oncogene (癌基因)24:3864-3874(2005)和 Zhao，等，Molecular B1logy of the Cell(分子分子生物学)，17:3819-3831(2006))ο
[0099]MEK的抑制剂可以包括抗体，其显性阴性变体和靶标MEK的反义核酸。MEK抑制剂的具体实例包括，但不限于，PD0325901,(参见，例如，Rinehart,等,Journal ofClinical Oncology (临床肿瘤学杂志)22:4456-4462 (2004))，PD98059 (例如，可从 CellSignaling Technology (细胞信号传导技术)获得)，U0126 (例如，可从 Cell SignalingTechnology (细胞信号传导技术)获得)，SL327 (例如,可从Sigma-Aldrich (西格玛-奥地里奇)获得)，ARRY-162 (例如，可从Array B1pharma获得)，PD184161 (参见，例如 Klein,等，Neoplasia(瘤形成)8:1-8 (2006))，PD184352 (C1-1040)(参见，例如，Mattingly,等，The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics (药理学和实验治疗学杂志)316:456-465 (2006))，舒尼替尼(sunitinib)(参见，例如，Voss，等，US2008004287，其通过引用并入本文)，索拉非尼(sorafenib)(参见，Voss同前所述)，凡德他尼(Vandetanib)(参见,Voss同前所述)，帕唑帕尼(pazopanib)(参见,例如,Voss同前所述)，阿昔替尼(Axitinib)(参见，Voss同前所述)和PTK787 (参见，Voss同前所述)。
[0100]目前，一些MEK抑制剂正在进行临床实验评估。C1-1040已经在I期和II期癌症临床实验中进行评估(参见，例如，Rinehart,等，Journal of Clinical Oncology (临床肿瘤学杂志)22(22) =4456-4462 (2004)) ο临床实验中评估的其它MEK抑制剂包括PD184352 (参见，例如，English,等，Trends in Pharmaceutical Sciences (制药科学趋势)23 (I):40-45(2002)), BAY43-9006 (参见，例如，Chow，等，Cytometry (血细胞计数)(Communicat1ns in Clinical Cytometry (临床血细胞技术通讯))46:72-78 (2001)),PD-325901(也为 PD0325901)， GSK1120212, ARRY-438162， RDEAl19, AZD6244(也为ARRY-142886 或 ARRY-886)，R05126766，XL518 和 AZD8330 (也为 ARRY-704)。(参见，例如，来自全国卫生研究所(Nat1nal Institutes of Health)位于万维网 www.clinicaltrials.gov的信息以及来自全国癌症研究所(Nat1n Cancer Institute)位于万维网www.cancer, gov/clinicaltrials 的信息。
[0101]p38(还已知为CSBP，mHOGl, RK和SAPK2)抑制剂可以包括抗体，其显性阴性变体和靶向P38的反义核酸。抑制剂的具体实例包括但不限于SB203580 (4- (4-氟苯基)-2- (4-甲基亚磺酰苯基)-5- (4-吡啶基)IH-咪唑)；SB202190 (4- (4-氟苯基)-2-(4-羟苯基)-5(4-吡啶基)-1Η-咪唑);SB220025 ；N-(3-叔-丁基-1-甲基-5-吡唑基)-N ' -(4-(4-吡啶基甲基)苯基)脲；RPR200765A ;UX_745 ;UX_702 ；UX-850 ；SC10-469 ；RWJ-67657(Rff Johnson Pharmaceutical Research Institute(RW约翰逊制药研究所))；RDP-58 (SangStat Medical Corp.(SangStat 医药公司)；由Genzyme Corp.(Genzyme 公司)获得)；Sc1s_323 (SC10323 ；Sc1s Inc.(Sc1s 公司))；Sc1s-469(SC10-469 ；Sc1s Inc.(Sc1s 公司));MKK3/MKK6 抑制剂(Signal ResearchDivis1n(信号研究部门));p38/MEK 调节剂(Signal Research Divis1n(信号研究部门))；SB-210313 类似物；SB-238039 ；HEP-689(SB235699) ；SB-239063 ；SB-239065 ；SB-242235 (SmithKline Beecham Pharmaceuticals (SmithKline Beecham 制药))；VX_702和 VX-745(Vertex Pharmaceuticals Inc.(Vertex 制药公司))；AMG_548(Amgen Inc.(Amgen 公司))；Astex p38 激酶抑制剂(Astex Technology Ltd.(Astex 技术有限公司))；RPR-200765 类似物(Aventis SA) ；Bayer p38 激酶抑制剂(Bayer Corp.(Bayer 公司))；BIRB-796 (Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc.(Boehringer Ingelheim 制药公司))；Celltech p38MAP 激酶抑制剂(Celltech Group pic.(Celltech 集团股票上市公司))；FR-167653 (Fujisawa Pharmaceutical C0.Ltd.(Fujisawa 制药有限公司))；SB-681323 和 SB-281832 (GlaxoSmithKline pic (GlaxoSmithKline 股票上市公司))；LEO制药MAP激酶抑制剂(LEO Pharma A/S) ；Merck C0.(默克公司)p38MAP激酶抑制剂(Merck research Laboratories (默克研究实验室));SC_040 和 SC-XX906 (MonsantoC0.(Monsanto 公司))；腺苷 A3 拮抗剂(Novartis AG) ;p38MAP 激酶抑制剂(NovartisPharma AG) ；CN1-1493 (Picower Institute for Medical Research (Picower 医药研究所))；RPR-200765A(Rhone-Poulenc Rorer Ltd.(Rhone-Poulenc Rorer 有限公司))；和Roche p38MAP 激酶抑制剂(例如，R03201195 和 R04402257 ;Roche B1science (罗氏生物科学))。参见，例如，Roux,等，Microb1logy and Molecular B1logy Reviews(微生物和分子生物学综述)68 (2):320-344 (2004) ;Engelnan,等，Journal of B1logicalChemistry (生物化学杂志)273(48):32111-32120(1998) ;Jackson,等，Journal ofPharmacology and Experimental Therapeutics (药理学和实验治疗学杂志)284 (2):687-692 (1998) ;Kramer,等，Journal of B1logical Chemistry (生物化学杂志)271 (44):27723-27729(1996);和 Menko,等，US20080193504。
[0102]另外的p38抑制剂包括但不限于，1,5- 二芳基-取代的吡唑和取代的吡唑化合物(US6509361和US6335336);取代的吡啶基化合物(US20030139462);喹唑啉衍生物(US6541477，US6184226，US6509363 和 US6635644);芳基脲和杂芳基类似物(US6344476)；杂环脲(W01999/32110);其它脲化合物(W01999/32463，W01998/52558, W01999/00357 和W01999/58502);以及取代的咪唑化合物和取代的三唑化合物(US6560871和US6599910)。
[0103]Erk抑制剂可以包括抗体，其显性阴性变体和靶向Erk的反义核酸。Erk抑制剂的具体实例包括但不限于Η)98059(参见，例如，Zhu，等，Oncogene(癌基因)23:4984-4992(2004))，U0126(参见，Zhu,同前所述)，FR180204 (参见，例如，Ohori, DrugNews Perspective (药物信息观点)21(5):245-250 (2008))，舒尼替尼(参见，例如，Ma，等，US2008004287，其通过引用结合于此)，索拉非尼(参见，Ma，同前所述)，凡德他尼(参见，Ma,同前所述)，帕唑帕尼(参见，Ma,同前所述)，阿昔替尼(参见，Ma,同前所述)和PTK787 (参见，Ma,同前所述)。Erk抑制剂可以包括仅抑制Erk的分子或还抑制第二靶标的分子。例如，在一些实施方案中，所述Erk抑制剂是:
[0104]
【权利要求】
1.通过至少一次细胞分裂培养多能细胞的方法，所述方法包括: 在充足量的: a.MEK抑制剂； b.GSK3 β抑制剂；和 c.充分的营养足够的时间， 存在时培养多能动物细胞，以允许至少一次细胞分裂同时保持细胞的多能性，其中所述多能动物细胞不是人胚胎干细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述GSK30抑制剂是CHIR99021。
3.权利要求1的方法，其中所述MEK抑制剂是Η)0325901。
4.权利要求1的方法，其中所述多能动物细胞进一步在充足量的TGF-β抑制剂存在时培养。
5.权利要求4的方法，其中所述TGF-β抑制剂是ALK5抑制剂。
6.权利要求5的方法，其中所述ALK5抑制剂是Α-83-01。
7.权利要求5的方法，其中所述ALK5抑制剂是SB431542。
8.权利要求1的方法，其中所述多能动物细胞进一步在存在足量成纤维细胞生长因子(FGF)受体抑制剂时培养。
9.权利要求8的方法，其中所述FGF受体抑制剂是ΗΗ73074。
10.权利要求1的方法，其还包括在充足量的bFGF存在时培养所述多能动物细胞。
11.权利要求1的方法，其中所述多能动物细胞通过至少5次细胞分裂进行培养，同时保持细胞多能性。
12.权利要求1的方法，其还包括向所述多能动物细胞中引入异源核酸，并且培养所得到的细胞，以允许至少一次另外的细胞分裂，同时保持多能性。
13.权利要求12的方法，其中将异源核酸引入到所述多能动物细胞中，然后诱导多能性，再然后进行培养步骤。
14.权利要求1的方法，其中所述多能动物细胞是大鼠细胞或人细胞。
15.权利要求1的方法，其中所述多能动物细胞是灵长类、羊、牛、猫、狗、或猪的细胞。
16.权利要求1的方法，其中所述多能动物细胞是胚胎干细胞。
17.权利要求1的方法，其中所述多能动物细胞是诱导的多能干细胞。
18.多能哺乳动物细胞的培养物，其包括充足量的: a.MEK抑制剂；和
b.GSK3 β抑制剂； 以允许至少一次细胞分裂，同时保持细胞多能性，其中所述多能动物细胞不是人胚胎干细胞。
19.权利要求18的培养物，其中所述GSK30抑制剂是CHIR99021。
20.权利要求18的培养物，其中所述MEK抑制剂是Η)0325901。
21.权利要求18的培养物，其还包括充足量的TGF-β抑制剂。
22.权利要求21的培养物，其中所述TGF-β抑制剂是ALK5抑制剂。
23.权利要求22的培养物，其中所述ALK5抑制剂是Α-83-01。
24.权利要求22的培养物，其中所述ALK5抑制剂是SB431542。
25.权利要求18的培养物，其还包括足量成纤维细胞生长因子(FGF)受体抑制剂。
26.权利要求25的培养物，其中所述FGF受体抑制剂是HH73074。
27.权利要求18的培养物，其还包括充足量的bFGF。
28.权利要求18的培养物，其中所述细胞是人细胞或大鼠细胞。
29.权利要求18的培养物，其中所述细胞是胚胎干细胞。
30.一种细胞培养基，其包括充足量的下述: a.MEK抑制剂；和 b.GSK3 β抑制剂； 从而在所述培养基中培养多能细胞时，允许至少一次细胞分裂，同时保持细胞多能性。
31.权利要求30的培养基，其中所述GSK30抑制剂是CHIR99021。
32.权利要求30的培养基，其中所述MEK抑制剂是Η)0325901。
33.权利要求30的培养基，其还包括充足量的TGF-β抑制剂。
34.权利要求33的培养基，其中所述TGF-β抑制剂是ALK5抑制剂。
35.权利要求34的培养基，其中所述ALK5抑制剂是Α-83-01。
36.权利要求34的培养基，其中所述ALK5抑制剂是SB431542。
37.权利要求30的培养基，其还包括足量成纤维细胞生长因子(FGF)受体抑制剂。
38.权利要求37的培养基，其中所述FGF受体抑制剂是ΗΗ73074。
39.权利要求30的培养基，其还包括充足量的bFGF。
40.权利要求30的培养基，其中所述培养基在预先包装的、密封容器中。
41.通过权利要求1-17中任一项的方法获得的分离的多能动物细胞，条件是所述分离的多能动物细胞不是胚胎干细胞(ESC)。
42.权利要求41的分离的细胞，其中所述分离的多能动物细胞是人细胞。
43.权利要求41的分离的细胞，其中所述分离的多能动物细胞是大鼠细胞。
【文档编号】C12N5/0735GK104130976SQ201410347355
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2009年12月16日 优先权日:2008年12月17日
【发明者】李文林, 周宏彦, 丁生 申请人:斯克里普斯研究所