干细胞和祖细胞分化的调节、鉴定及其应用的制作方法

专利名称：干细胞和祖细胞分化的调节、鉴定及其应用的制作方法
干细胞和袓细胞分化的调节、鉴定及其应用本申请为分案申请，原申请的申请日为2003年4月13日，申请号为 03813627. 9 (PCT/US03/11327)，发明名称为“干细胞和祖细胞分化的调节、鉴定及其应用”。本申请要求2002年4月12日提交的美国临时申请60/372348，2002年12月31日提交的美国临时申请60/437348及2002年12月31日提交的美国临时申请60/437350的优先权，在此引用每一篇的全部内容。1.介绍本发明涉及调节哺乳动物干细胞和/或祖细胞分化的方法。本发明的方法可用于调节和控制哺乳动物，尤其是人的干细胞沿着特定细胞和组织谱系的分化和成熟。本发明的方法涉及使用某些小的有机分子来调节干细胞或祖细胞群沿着特定细胞和组织谱系的分化，尤其是源于产后胎盘的胚胎样干细胞的分化或沿着特定分化途径，特别是粒细胞分化途径的早期造血祖细胞的调节。本发明还涉及使用这些有机分子来调节特定谱系祖细胞，如CD34+，CD45+和CD133+祖细胞的分化。本发明还涉及祖细胞发育的时间方面，以及基于这些时间方面的体外模型。本发明进一步涉及这些得到调节的细胞在预防和治疗方法中，包括在这种细胞和/或小的有机化合物的药物组合物中的应用。最后，本发明涉及这种分化的细胞在移植和其他医学治疗中的应用。2.
背景技术：
在人的干细胞和祖细胞的鉴定、分离和增殖上有重要的关注。干细胞是能产生多种成熟细胞谱系的全能或多能前体细胞，前体细胞是能产生特定细胞谱系细胞的细胞。这些能力作为对于器管和组织发育必需的细胞分化和特化的基础。近来在移植干细胞和祖细胞上的成功已经提供了新的临床工具以用于因疾病、暴露于有毒化学物质和/或辐射的骨髓切除后的骨髓重建和/或补充。进一步证据的存在证明干细胞可用于重建许多，即使不是全部的组织以及修复生理状况和生理学和解剖学上的功能。干细胞在组织工程、基因治疗传送以及细胞疗法中的应用也正迅速地发展着。许多不同类型的哺乳动物干细胞和祖干细胞已得到鉴定。例如，已知的有胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、成体干细胞、或定向干细胞或祖细胞。某些干细胞还未被分离和鉴定， 但已经在允许向限定的范围分化的条件下得到培养。然而，剩下一个基本问题，就是，控制和调节干细胞和祖细胞，如造血祖细胞的分化是很困难的。目前，现有的调节这些细胞分化的方法是不成熟的和不可控制的，从而细胞在不需要的时间分化成不需要的细胞类型。而且，细胞产品的产率一般比较低。此外，获得足够数量的用于治疗或研究目的的人干细胞尚有问题。部分地，由于在血或组织中找到的干细胞或祖细胞的有限数量以及与获得骨髓吸出物有关的显著不适，分离成体组织中正常存在的干细胞或祖细胞群体有技术上的困难，且费用昂贵。一般而言，从替代性来源收获足够数量用于治疗或研究目的的干细胞或祖细胞通常是很费力的，包括， 例如，从供体或患者收获细胞或组织、体外培养和/或传播细胞、解离细胞等。至于干细胞尤其是从胚胎或胎儿组织，包括流产儿中获得这些细胞，已上升到宗教和伦理道德的顾虑。 广泛认定的人胚胎或胎儿就构成独立生命的信念已促成在如此来源的细胞用于所有目的，包括医学研究的用途上政府的禁止。因而，不需要应用从胚胎或胎儿获得的细胞的替代性来源就期望在干细胞临床应用中的进一步发展。然而，很少有可用的干细胞或祖细胞，特别是人干细胞或祖细胞的替代性来源，因此，供给是有限的。Hu等(W0 00/73421，题为“人羊膜上皮细胞的分离、深低温保藏的方法以及治疗用途”，公开于2000-12-07)公开了源于分娩时胎盘的人羊膜上皮细胞的分离、培养、为了将来使用的深低温保藏或诱导分化。按照Hu等所述，分娩后立即获得一胎盘并从绒毛膜分离羊膜，例如通过解剖。羊膜上皮细胞按照标准的细胞分离技术从羊膜分离。该公开的细胞可以在各种培养基中进行培养、在培养中增殖、冷藏或被诱导分化。Hu等公开了羊膜上皮细胞是全能造血干细胞(也可能是多能造血干细胞)，且能分化为上皮组织，如角膜表皮组织或阴道组织。然而，该方法的缺点是劳动密集，且干细胞的产率非常低。现有的细胞群体的体外增殖方法也是劳动密集型的。例如，Emerson等(Emerson 等，美国专利号63^198，题为“用于体内干细胞的复制、造血祖细胞培养的优化以及增强人基质细胞的代谢、GM-CSF分泌和/或IL-6分泌的方法和组分”，公布于2001-12-04)公开了人干细胞分裂和/或人造血祖细胞的优化的方法及体外培养的培养基条件。按照所公开的方法，源于骨髓的人干细胞或祖细胞在液体培养基中培养，其可被替换，优选灌注培养， 连续地或周期性地，以每毫升培养物1毫升培养基的速率，每约M小时至48小时为周期。 在生理上可接受的条件下维持培养时，除去代谢产物，补充消耗的养分。Kraus等(Kraus等，美国专利号6338942，题为“靶细胞群体的选择性增殖”，公布于2002-01-15)公开了预定的靶细胞群体可选择性地增殖，通过在生长培养基中引进源于脐带血或外周血地起始标样细胞，致使靶细胞群体分裂，以及在生长培养基中用选择成分接触细胞，包括对预定的细胞群体(如CD34细胞)有特定亲和力的结合分子(例如CD34 细胞的单集落抗体)，以在生长培养基中从其他细胞选择出预定的靶细胞群体。Rodgers等(美国专利号6335195题为“促进造血和间充质细胞增殖和分化的方法”公布于2002-01-01)公开了造血和间充质细胞体外培养以及通过在有血管紧张素原、 血管紧张素I(AI)、AI同功异质体、AI片段和其类似物，血管紧张素II (All)、AII同功异质体、AII片段和其类似物或All AT2型2受体激动剂，单独或与其他生长因子和细胞因子联合存在下生长的谱系特异的细胞增殖和分化的诱导方法。该干细胞源于骨髓、外周血或脐带血。然而，如上面所讨论的，该方法的缺点是该体外诱导干细胞增殖和分化的方法耗时， 也导致了干细胞的低产量。干细胞和祖细胞具有用于治疗多种病症的潜能，包括恶性肿瘤、遗传性代谢缺陷、 血红蛋白病及免疫缺陷。涉及源于脐带血或胎盘的干细胞的运用或研究的一个主要领域为使用这些细胞生产少量细胞用于骨髓及其他相关的移植术。然而，迄今为止，没人提出生产大量干细胞或祖细胞，如人CD34+或CD133+祖细胞的方法。尤其是，大量的后者细胞将使使用祖细胞的治疗方法变的容易。在此，本发明公开的方法涉及该需求。视黄醛衍生物，如维生素A和视黄酸(RA)，已知可影响干细胞的分化。例如，视黄酸已被用于抑制不规则定向(慢性骨髓性白血病)造血干细胞的增殖(Nadkarni等， 1984, Tumori 70 =503-505)以及在前髓白血病细胞中诱导分化和自我更新潜能的丧失 (Melchner等，1985，Blood 66(6) :1469-1472)。视黄酸还被用于诱导源于胚胎干细胞的神经元的分化以及抑制自发的中胚层分化(Slager等，Dev. Genet. 1993,14(3) :212-24, Ray等，1997，J.Biol. Chem. 272(30) 18702-18708)。视黄酸还进一步被用于诱导转化的生殖细胞前体(Damjanov 等，1993，Labor. Investig, 68 (2) :220-232)、胎盘细胞前体(Yan 等， 2001，Devel. Biol. 235 :422-432)、及内皮细胞前体(Hatzopoulos 等，1998，Development 125:1457-1468)的分化。然而，视黄醛衍生物在分化中的作用已十分了解，其可作为控制干细胞分化的调节手段而使用。叶酸类似物，如氨基蝶呤和氨甲蝶呤(甲氨蝶呤)在造血干细胞分化中的作用已得到研究。叶酸类似物作为化学疗法试剂用于急性成淋巴细胞贫血和其他血增殖病症及癌症，且表明其通过杀光某类干细胞群体来影响干细胞的分化(DeLoia等，1998，Human Reproduction 13(4) :1063-1069)，因此，不能成为用于调节给药于患者的大量干细胞的分化的有效工具。一些细胞因子，如IL-1、IL-2、IL_3、IL_6、IL7、IL-11，与一些蛋白如促红细胞生成素、Kit配体、M-CSF及GM-CSF，也已被显示指导干细胞按造血谱系分化为特定细胞类型 (Dushnik-Levinson 等，1995，Biol. Neonate 67 :77-83)，但是，这些过程没有得到充分了解并仍然太粗糙和不精确而不能作为控制干细胞分化的调节手段。迄今为止，没人描述化合物，如下述的免疫调节剂化合物在干细胞或前体细胞分化中的应用。尤其是，没人证明这样的化组合物调节祖细胞，如CD34+祖细胞，远离树突细胞谱系分化的用途，这种分化是用于提高移植免疫耐受性的有益能力。而且，没人描述在此所述的化合物在为了生产含有该细胞的医药组合物而增殖祖细胞群体中的用途。该增殖的祖细胞培养物在治疗移植物抗宿主病和免疫耐受性的提高中是有用的。因为控制干细胞和前体细胞分化可生产在治疗上有效的细胞群体，因此，对于控制和调节髓样树突细胞谱系细胞，或早期祖细胞，如人CD34+或CD133+祖细胞的分化的能力有所需要，以控制树突细胞和/或粒细胞的产生。3.发明概述本发明提供了调节哺乳动物，特别是人干细胞或祖细胞分化的方法。具体地说，本发明的方法可用于调节和控制人干细胞沿着特定的细胞和组织谱系的分化和成熟。本发明包括影响该调节和控制的免疫调节小分子有机物，更优选氨基取代的异吲哚啉化合物，尤其是Actimid 或Revimid 化合物的用途。本发明进一步涉及在特定时段这些化合物的给药于祖细胞，以从特定途径调节分化。本发明的方法包括干细胞或祖细胞分化成特定细胞谱系的调控，这些细胞谱系包括但不限于，间质的、造血的、生脂的、生肝的、生神经的、成胶质的、生软骨的、生血管的、生肌的、生软骨的或生骨的谱系。在特定的实施方案中，本发明的方法包括干细胞分化为造血谱系细胞的调控。本发明还包括定向细胞成为特定细胞类型的调控，所述细胞类型是例如间充质细胞、造血细胞、脂肪细胞、肝细胞、成神经细胞、成胶质细胞、软骨细胞、内皮细胞(EC)祖细胞、肌细胞、软骨细胞或成骨细胞。在特定的实施方案中，本发明包括定向造血祖细胞分化成红细胞、血小板或白细胞(白血细胞)，如嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱细胞、肥大细胞、B细胞、T细胞或浆细胞的调控。在另一个实施方案中，本发明的方法涉及调节干细胞向造血谱系细胞，尤其是， ⑶34+、⑶133+和⑶45+造血谱系的分化，以及生产含有该细胞的预防或治疗上有益的药物组合物的方法。在另一个实施方案中，本发明的方法涉及调节早期祖细胞向树突细胞谱系、 或粒细胞谱系、内皮细胞谱系或心肌细胞谱系的分化。在另一个实施方案中，本发明提供了调节祖细胞向造血细胞谱系，尤其是树突细胞谱系或粒细胞谱系、内皮细胞谱系、神经细胞谱系或心肌细胞谱系分化的方法。在具体的实施方案中，所述的祖细胞为CD34+或CD133+细胞。该调控通过在培养过程中用本发明的化合物接触祖细胞而完成。在一个实施方案中，所述化合物为TNF-α活性抑制因子。在更具体的实施方案中，所述化合物是本文所述的免疫调节剂化合物，或沙利度胺，或更优选地，为氨基取代的异吲哚啉化合物。在更进一步具体的实施方案中，所述化合物为Actimid 或 Revimid 。在另一个具体的实施方案中，本发明的方法包括祖细胞分化为树突细胞的抑制。 在另一个具体的实施方案中，本发明提供了调节在起始六天培养过程中的祖细胞分化的方法，其培养用于生产该祖细胞的增殖培养物。在另一个实施方案中，本发明的方法包括对早期祖细胞发育成粒细胞的促进，该粒细胞可能对于抵抗感染是有效的。粒细胞谱系定向祖细胞(CD15+细胞)的增加在减轻中性白细胞减少症和其随后的感染并发症中具有潜在的用途，该病症代表了癌症化学疗法最普遍的剂量限制性毒性。在另一个实施方案中，本发明的方法可用于抑制树突细胞的分化，其对于缓和移植物抗宿主病的效应是有效的。本发明的祖细胞，用本发明的化合物调节后，对于移植是有效的(即造血的恢复)，并可作为替代细胞和组织(如胰脏、心脏、肝脏、肾脏、肝、脑、肺、膀胱、肠或肌肉细胞) 的可再生来源用于治疗正常的衰老、损伤或疾病如心脏病、中风、帕金森病和阿尔茨海默病中的再生药物。该细胞在测定介导本发明的化合物的作用的胞内生化途径中也是有用的。 这些细胞对于筛选新的药物和毒素也是有用的，例如，用于确定抗癌药物的潜能，理解出生缺陷的起因等。本发明的方法可用于特异性地抑制红血细胞或红细胞集落(BFU-E和CFU-E)的生成，同时增加白细胞和血小板集落形成(CFU-GM)的生成以及提高总的集落形成单位的产量。本发明的方法不仅可用于调节干细胞和祖细胞如CD34+祖细胞的分化，还可用于刺激集落形成率，通过提高骨髓移植物移入速度而给造血干细胞移植提供重要的帮助。除人胚胎干细胞外的任何哺乳动物干细胞可按照本发明的方法而使用，包括但不限于，从脐带血、胎盘及除人胚胎外的其他来源分离的干细胞。干细胞可以从任何哺乳动物种类中分离，例如，大鼠、小鼠、兔、豚鼠、狗、猫、猪、羊、牛、马、猴等，更优选地，人。干细胞可包含多能细胞，即，具有完全的分化多样性、能自我更新以及在组织中维持休眠或静止的细胞。干细胞还可以包括多潜能性细胞或定向祖细胞。在一个优选的实施方案中，本发明利用活的、静止的、多能性的干细胞，其存在于或随后产生于足期的胎盘，就是说，该细胞可随着成功的分娩和胎盘娩出、放血和胎盘灌注而得到回收，致使多达十亿个有核细胞的产生和回收，其有核细胞产生50至100百万的多潜能性或多能性干细胞。该细胞在此被称为人胎盘干细胞或胚胎样干细胞。在本发明的一个具体的实施方案中，细胞，例如骨髓或产后灌注的胎盘的内源性细胞，包括但不限于，胚胎样干细胞、祖细胞如CD34+或CD133+细胞、多能细胞或多潜能细胞，暴露于本发明的化合物并受到诱导分化。该内源性细胞可在体外繁殖。在另一个实施方案中，内源性细胞可从胎盘和培养基中收集得到，并在体外适当的条件下培养，且培养一段时间至足以按期望的细胞类型或谱系来诱导分化。在本发明的另一个实施方案中，干细胞或祖细胞源自其它来源如脐带血、外周血或成人血，并暴露于本发明的化合物中被诱导分化。在一个优选的实施方案中，分化在体外合适的条件下进行一段时间，所述时间足以诱导向所期望的细胞系或细胞类型分化。本发明的化合物用于通过添加，在原位产生或其他任何允许干细胞或祖细胞与本发明的化合物接触的方式用于分化介质/培养基中。已经发现本发明的化合物给药的时间对CD34+祖细胞的分化有极深的影响。因此， 在本发明的一个实施方案中，CD34+祖细胞分化为树突细胞通过一种包括使祖细胞在第一天培养时接触本发明的化合物的方法而得到延迟或抑制。在另一个实施方案中，从CD34+祖细胞来的CDla+细胞的发育通过一种包括使所述祖细胞在第一天培养时接触本发明的化合物的方法而得到降低或阻碍。在另一个实施方案中，源于CD34+祖细胞的CDla+细胞群体的持久性通过在无本发明的化合物存在下培养所述祖细胞六天后接触该化合物而得到提高。本发明还包括调节早期祖细胞如人⑶34+和⑶133+细胞分化的方法，包括使祖细胞在增殖和分化期间的不同时间与一种或多种本发明的化合物接触。因此，在一个实施方案中，本发明包括一种调节祖细胞分化的方法，包含使所述细胞仅在培养第一天与本发明的一种或多种化合物接触。在另一个实施方案中，所述细胞与所述化合物在培养的第一天至第12天中任何一天以一次剂量接触。在另一个实施方案中，所述细胞在0至12天，包括 0天和12天的不同天数中至少和所述化合物接触两次。仍在另一个实施方案中，所述细胞在增殖和/或分化时期与一种或多种化合物接触一天两次、一天一次或隔一天一次。在另一个实施方案中，所述接触在体外进行。仍在另一个实施方案中，所述接触在受治疗者体内进行。在一个更具体的实施方案中，所述受治疗者是人、非人的哺乳动物、鸟类或爬行动物。总而言之，可在产后灌注的胎盘中培养的内源性或外源性干细胞或祖细胞暴露于本发明的化合物可以在这些细胞被培养于产后灌注的胎盘发生，或优选地，可以将在体外细胞从胎盘中回收或移去后发生。本发明包括具有TNF-α活性的化合物作为干细胞和/或祖细胞发育调节剂的用途。在一个具体的实施方案中，该化合物为免疫调节剂化合物，如已知的IMiDs 类的化合物，包括但不限于沙利度胺类似物、Actimid (Ce 1 gene Corp.，Warren，NJ)及 Revimid (Celgene Corp.，Warren, NJ)。本发明还包括经预处理的干细胞或祖细胞用于治疗和预防疾病的移植。在一个实施方案中，一需要移植的患者在移植前、中间和/或移植后菌给予化合物的药物。本发明进一步包括由本发明的方法产生的祖细胞或特定类型细胞的用途。换言之，本发明包括由造血祖细胞分化制得的白细胞、粒细胞或树突细胞的用途，其中所述祖细胞分化用本发明的化合物调节或调控。在另一个实施方案中，本发明包括干细胞的控制或调控，通过在体内以干细胞和本发明的小分子化合物给药于其所需的患者。在一个实施方案中，本发明提供了包含⑶34+或⑶133+祖细胞和可药用载体的药物组合物，其中所述祖细胞已经在培养的前6天在促进所述祖细胞增殖和分化的条件下与本发明的化合物，尤其是移植TNF-α活性的化合物接触。在一个具体的实施方案中，药物组合物包含六天培养后收集和深低温保藏的细胞。在另一具体的实施方案中，药物组合物中的细胞为⑶；34+⑶38XD34—或⑶34+CD38TD34+细胞。在另一个具体的实施方案中，与细胞接触的化合物为本发明的免疫调节剂化合物，或沙利度胺或沙利度胺类似物。在另一个具体的实施方案中，与细胞接触的化合物为Actimid 或Revimid 。在另一个实施方案中，本发明还提供了制备药物组合物的方法，包括用抑制 TNF-α活性的化合物接触CD34+或CD133+祖细胞，其中所述祖细胞在允许增殖的培养条件下在培养基中培养了六天，其中所述祖细胞在允许所述祖细胞增殖和分化的培养条件下在培养基中培养了六天；在培养六天后收集所述细胞；以及将可药用的载体与所述细胞组合。在该方法的一个具体实施方案中，所述接触在培养第一天进行。在该方法的另一个具体实施方案中，所述接触在所述的六天培养中至少进行两次。在该方法的另一个具体实施方案中，所述化合物为本发明的小分子免疫调节剂化合物。在另一个具体实施方案中，与细胞接触的化合物为Actimid 或Revimid 。在仍是该方法的另一个具体实施方案中，所述祖细胞在所述培养前已从其他的血细胞中分离。在该方法的另一个具体实施方案中，所述培养基另外还包含GM-CSF和TNF-α。在该方法的另一个更具体实施方案中，所述Actimid 或Revimid 以0. 1 μ M至10. 0μ M的浓度存在。在该方法的另一个更具体实施方案中，所述Actimid 或Revimid 以Ι.ΟμΜ的浓度存在。在该方法的另一个具体实施方案中，将所述细胞在收集后进行深低温保藏。本发明进一步提供在哺乳动物受治疗者中增殖祖细胞群体的方法，包括给药以治疗上有效量的⑶；34+或⑶133+祖细胞和Actimid 或Revimid 于所述受体哺乳动物受治疗者。在该方法的具体实施方案中，所述祖细胞在受体哺乳动物受治疗者中分化。在该方法的另一个具体实施方案中，所述祖细胞以基本上无红血细胞的细胞制备物形式给药于所述受治疗者。在该方法的另一个具体实施方案中，所述祖细胞以包含骨髓细胞、胎盘细胞、脐带血细胞或PBMC的细胞制备物形式给药于受体哺乳动物受治疗者。在该方法的另一个具体实施方案中，所述祖细胞以与载体联合的形式给药于受体哺乳动物受治疗者。在该方法的另一个具体实施方案中，所述祖细胞为CD34+CD133+祖细胞。在该方法的另一个具体实施方案中，所述祖细胞表达掺入的目的遗传材料。本发明还提供由上述方法制备的作为药物组合物的细胞。仍在另一个实施方案中，本发明包括在深低温保藏和融化后调节干细胞或祖细胞例如CD34+祖细胞，以消除深低温保藏和暴露于冷冻保藏剂对于干细胞的有害影响的方法。 在某些实施方案中，本发明提供了在深低温保藏和融化后调节干细胞，以消除暴露于冷冻保藏剂(例如，DMS0)而对干细胞增殖和迁移能力的有害影响的方法。3. 1 定义如本文所用的，术语“生物反应器”是指用于繁殖细胞、生产或表达生物材料以及生长或培养细胞组织、类器官、病毒、蛋白、多核苷酸和微生物的体外系统。如本文所用的，“DC细胞”是指树突细胞。如本文所用的，“早期祖细胞”是指CD34+祖细胞、CD133+祖细胞或哺乳动物、禽类或爬行类中的任一等效物。如本文所用的，术语“胚胎干细胞”是指源于囊胚泡(例如4-5天的人胚胎)内生细胞团的细胞，且具有多能性。如本文所用的，术语“胚胎样干细胞”是指非源于囊胚泡内生细胞团的细胞。如本文所用的，“胚胎样干细胞”还可能是指“胎盘干细胞”。优选胚胎样干细胞是多能性的。然而，可以从胎盘获得的干细胞包括胚胎样干细胞、多潜能性细胞及定向祖细胞。按照本发明的方法，源于胎盘的胚胎样干细胞可从分离的胎盘中收集，其经过了一段时间的放血和灌注，足以除去残留细胞。优选地，胚胎样干细胞是人源的，虽然可来源于任何哺乳动物。如本文所用的，术语“放血的”或“放血”，当与胎盘相关使用时，是指从胎盘除去和 /或排出基本上所有的脐带血。按照本发明，胎盘放血可通过，例如，但并不由此限定，排出、 重力诱导的流出、按摩、挤压、抽吸等等而完成。在一个优选的实施方案中，胎盘的放血可进一步通过灌注、漂洗或用含或不含试剂，如抗凝剂的液体冲洗胎盘，以助于胎盘的放血而完成。如本文所用的，术语“灌注”或“灌注法”是指透过器官或组织流出或排出液体，优选地，透过器官或组织的液体的排出具有足够的力量或压力以除去任何残留细胞，即，源于器官或组织的非粘附细胞。如本文所用的，术语“灌注液”是指随着从器官或组织排出而收集的液体。在一个优选的实施方案中，灌注液包含一种或多种抗凝剂。如本文所用的，术语“内源细胞”指一种“非外源”细胞，即，一种自身的或自体同源的细胞，它源于胎盘。如本文所用的，术语“外源细胞”是指“外来的”细胞，S卩，异种细胞(即，源于非胎盘供体来源的“非自我”细胞)或源于非胎盘的器官或组织的自体同源细胞(即，源于胎盘供体的“自我细胞”)。如本文所用的，术语“免疫调节剂化合物”是指下文5. 3节公开的化合物。如本文所用的，术语“类器官”是指以表面外观形式或如任何器官或哺乳动物体， 优选人体的腺体的实际结构形式装配的一种或多种细胞类型的聚集体。如本文所用的，术语“多潜能性细胞”是指具有生长为哺乳动物体约260种细胞类型任一亚类的能力的细胞。不同于多能性细胞，多潜能性细胞不具有形成所有细胞类型的能力。如本文所用的，术语“多能性细胞”是指具有完全分化多样性的细胞，S卩，生长为哺乳动物体约260种细胞类型的能力。多能性细胞可自我更新，且能在组织中维持休眠或静止。不同于全能性细胞(例如，受精的二倍体卵细胞)，胚胎样干细胞通常不能形成新的囊胚泡。如本文所用的，术语“祖细胞”是指定向分化为特定细胞类型或形成特定组织的细胞。如本文所用的，术语“干细胞”是指能不确定地再生而形成组织和器官的限定细胞的标准细胞。干细胞是在发育上具有多能性或多潜能性的细胞。一个干细胞可分裂产生两个子代干细胞，或一个子代干细胞和一个祖(转变)细胞，其随后增殖为组织的成熟的、完全形态的细胞。如本文所用的，术语“全能性细胞”是指能形成一个完整胚胎(例如，一个囊胚泡) 的细胞。4.附图简述

图1.柱状图显示了在沙利度胺(THD), Actimid ^P Revimid 以浓度1μ g/ml 和10 μ g/ml存在下培养脐带血⑶34+细胞的结果。等体积的DMSO作为阴性对照。红细胞造血爆发集落形成单位(BFU-E)、红细胞集落形成单位(CFU-E)、粒巨噬系集落形成单位 (CFU-GM)和集落总数(CFU-Total)在光学显微镜下记录。Y-轴集落数。详见6. 1节。图2(A_F).流式细胞图。人脐带血CD45+细胞暴露于Actimid 和Revimid 抑制了红细胞的生成和⑶34+CD38_细胞的增殖。脐带血⑶45+细胞在有细胞因子IL3、IL6、 G-CSF、Epo和KL下培养14天。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞群体的百分比。A.对照，免疫球蛋白(Ig)。B.对照，不加化合物。C. DMS0(5yg/ml)o D.沙利度胺(“Thai” ) (5 μ g/ml)。Ε. Actimid (5 μ g/ml)。F. Revimid (5 μ g/ml)。X_ 轴: Gly-A(FLl-H)染色的相对强度。Y-轴⑶34 (FL2-H)染色的相对强度。详见6.1节。图3(A_F).流式细胞图。人脐带血CD45+细胞暴露于Actimid 和Revimid 抑制了在有细胞因子IL3、KL和G_gsf下培养14天的人脐带血⑶34+细胞中CXCR4的表达。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞群体的百分比。A.对照，免疫球蛋白 (Ig)。B.对照，CD45+细胞。C. DMSO (0. 3 μ g/ml)。D. Thai (0. 3 μ g/ml)。Ε. Actimid (0. 3 μ g/ ml)。F. Revimid (0. 3 μ g/ml)。X-轴CD34(FL1_H)染色的相对强度。Y-轴CXCR4 (FL2-H) 染色的相对强度。详见6. 2节。图4(A_F).流式细胞图。人脐带血CD45+细胞暴露于Actimid 和Revimid 刺激了⑶34+和/或⑶34+CD38_细胞群体的增殖。脐带血⑶45+细胞在有细胞因子IL3、 IL6、G-CSF, Epo和KL下培养14天。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞群体的百分比。A.对照，免疫球蛋白(Ig)。B.对照，不加化合物。C.DMS0(0.3yg/ ml)。D. Thai (0. 3 μ g/ml)。Ε. Actimid (0. 3 μ g/ml)。F. Revimid (0. 3 μ g/ml)。X-轴 ⑶38 (FLl-H)染色的相对强度。Y-轴⑶34(FL2-H)染色的相对强度。详见6. 2节。图5(A_F).流式细胞图。人脐带血CD45+细胞暴露于Actimid 和Revimid 产生了人脐带血祖细胞的重要的保存。脐带血⑶45+细胞在有细胞因子IL3、IL6.G-CSF.Epo 和KL下培养14天。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞群体的百分比。A.对照，免疫球蛋白(Ig)。B.对照，不加化合物。C. DMSO(5 μ g/ml) 0 D. Thai (5 μ g/ ml)。Ε. Actimid (5 μ g/ml)。F. Revimid (5 μ g/ml)。X-轴CD38 (FL1-H)染色的相对强度。Y-轴⑶34(FL2-H)染色的相对强度。详见6. 2节。图6 (A-F).流式细胞图。人脐带血CD45+细胞暴露于Actimid 和Revimid 抑制了 ⑶45+细胞的CXCR4的表达和增殖了⑶45+细胞群体。脐带血⑶45+细胞在有细胞因子IL3、 IL6.G-CSF.Epo和KL下培养14天。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞群体的百分比。A.对照，免疫球蛋白(Ig)。B.对照，不加化合物。C. DMSO (5 μ g/ml)。 D.Thai (5 μ g/ml)。Ε. Actimid (5 μ g/ml)。F. Revimid (5 μ g/ml)。X-轴:CD45(FL1_H)染色的相对强度。Y-轴CXCR4(FL2-H)染色的相对强度。详见6. 2节。图7(A_F).流式细胞图。人脐带血CD45+细胞暴露于Actimid 和Revimid 产生了 CD34+祖细胞数量上的增殖以及提高了粒细胞和单核细胞的产量。脐带血CD45+细胞在有细胞因子IL3、IL6、G-CSF, Epo和KL下培养14天。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞群体的百分比。A.对照，免疫球蛋白(Ig)。B.对照，不加化合物。 C. DMSO (5 μ g/ml)。D. Thai (5 μ g/ml)。Ε· Actimid (5 μ g/ml)。F. Revimid (5 μ g/ml)。 X-轴⑶lib (FLl-H)染色的相对强度。Y-轴⑶34(FL2-H)染色的相对强度。详见6. 2节。图8 (A-F).流式细胞图。人脐带血CD45+细胞暴露于Actimid 和Revimid 增殖了CD34+祖细胞以及消除了 DMSO介导的单核细胞产量的抑制。脐带血CD45+细胞在有细胞因子 IL3、IL6、G-CSF、Epo和KL下培养14天。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞群体的百分比。A.对照，免疫球蛋白(Ig)。B.对照，不加化合物。C.DMS0(5yg/ ml)。D. Thai (5 μ g/ml)。Ε. Actimid (5 μ g/ml)。F. Revimid (5 μ g/ml)。X-轴CD14 表达(FLl-H)染色的相对强度。Y-轴⑶34(FL2-H)染色的相对强度。详见6.3节。图9 (A-F).流式细胞图。人脐带血CD45+细胞暴露于Actimid 和Revimid 显示了在分化为B细胞上的较小的抑制效应。脐带血⑶45+细胞在有细胞因子IL3、IL6、G-CSF、 Epo和KL下培养14天。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞群体的百分比。A.对照，免疫球蛋白(Ig)。B.对照，不加化合物。C. DMSO(5 μ g/ml) 0 D. Thai (5 μ g/ ml)。Ε. Actimid (5 μ g/ml)。F. Revimid (5 μ g/ml)。X-轴CD38 (FL1-H)染色的相对强度。Y-轴⑶19(FL2-H)染色的相对强度。详见6. 3节。图IO(A-F).流式细胞图。人脐带血CD45+细胞暴露于Actimid 和Revimid 克服了由暴露于DMSO而产生的CXCR5的抑制。脐带血CD45+细胞在有细胞因子IL3、IL6、G-CSF, Epo和KL下培养14天。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞群体的百分比。A.对照，免疫球蛋白(Ig)。B.对照，不加化合物。C. DMSO(5 μ g/ml) 0 D. Thai (5 μ g/ ml)。Ε. Actimid (5 μ g/ml)。F. Revimid (5 μ g/ml)。X-轴C)(CR5 (FLl-H)染色的相对强度。Y-轴⑶34(FL2-H)染色的相对强度。详见6. 3节。图Il(A-E).流式细胞图。人脐带血单核细胞(MNCs)暴露于Actimid 和Revimid 提高了 CD34+CD38+细胞群体数。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞群体的百分比。A.对照，免疫球蛋白(Ig)。B.对照，不加化合物。C. DMSO (5 μ g/ml)。 D. Actimid (5 μ g/ml)。Ε. Revimid (5 μ g/ml)。X-轴:CD38 (FLl-H)染色的相对强度。 Y-轴⑶34(FL2-H)染色的相对强度。详见6. 3节。图 12 (A-E).流式细胞图。MNCs 暴露于 Actimid 和 Revimid 下调 CXCR4+CD45+细胞群体数，但高了 CXCR4+CD45—细胞群体数。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞群体的百分比。A.对照，免疫球蛋白(Ig)。B.对照，不加化合物。C. DMSO(5 μ g/ ml)。D. Actimid (5 μ g/ml)。Ε. Revimid (5 μ g/ml)。X-轴CD45 (FL1-H)染色的相对强度。Y-轴CXCR4(FL2-H)染色的相对强度。详见6. 3节。图13 (A-E).流式细胞图。沙利度胺、Actimid 和Revimid 在造血祖细胞向脐带血成分的有核细胞分化的谱系定向化上的影响。流式细胞图显示Actimid 和Revimid 与对照相比提高了单核谱系细胞的百分比，表明存在分化的调节，其转向引起淋巴样和髓样细胞的谱系。A.对照，免疫球蛋白(Ig)。B. DMSO (5 μ g/ml)。C. Thai (5 μ g/ml)。 D. Actimid (5 μ g/ml)。Ε· Revimid (5 μ g/ml)。详见 6. 4 节。图14. Actimid 对⑶34+细胞分化和成熟为DC细胞的影响的研究略图。在增殖和成熟期(第1天至第12天)或成熟期(第6天至第12天)，⑶34+细胞在1. 0 μ M Actimid 和DMSO(二甲基亚砜)存在或缺乏的条件下培养。在第6天或第12天用FITC和PE缀合的单克隆抗体对免疫组织化学标记进行测试。详见6. 6节。图15 (A-D).流式细胞图显示了 6天的⑶34+细胞的表型特征，从第1天起暴露于 Actimid 。Actimid 几乎完全抑制了 CD86+CD1+细胞的发育。细胞用CDlaFITC和CD14PE 或CDlaFITC和CD86PE双标记。A 用DMSO(对照)处理的CD34.细胞产生的CD86+CD1.细胞。B 用DMSO(对照)处理的⑶；34+细胞产生的⑶14+⑶1+细胞。C 用Actimid 处理的 CD34+细胞产生的CD86+CD1+细胞。D 用Actimid 处理的CD34+细胞产生的CDH+CDl+细胞。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定定重组标记的细胞群体的百分比。详见6. 6 节。图16(A_D).流式细胞图显示了在⑶34+细胞增殖期(第1天至第6天)暴露于Actimid 在第6天的影响。暴露于Actimid 的CD34+CD38—细胞在6天后分化为 CD34+CD38XD33+ 细胞。细胞用 CD33FITC 和 CD83PE 或 CD38PE 和 CD34PE 双标记。A 细胞用 DMSO处理，且对⑶34和⑶38标记。B 细胞用DMSO处理，且对⑶83和⑶33标记。C 细胞用Actimid 处理，且对⑶；34和⑶38标记。D 细胞用处理。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞群体的百分比。详见6. 6节。图17.从培养的第0天至第6天Actimid 诱导⑶34+细胞来源的细胞群体的转变。从第0天至第6天细胞在不同浓度Actimid 下培养，然后用⑶34和⑶38或⑶Ia和 ⑶14双标记。Actimid 在⑶34+0038_细胞中引起显著的提高，在⑶Ia+⑶14_细胞中引起降低。详见6. 6节。图18.在不同时间用Actimid 处理的⑶34+细胞在第6天的表型改变。细胞接种于培养皿培养6天。用Actimid 仅从第0天至第1天、仅第0天至第2天、仅第0天至第 3天、仅第0天至第4天、仅第0天至第5天或第0天至第6天处理细胞。对于少于6天的温育，Actimid 在指示的那天洗去，且细胞重悬于DMSO中。在第6天，细胞用⑶34和⑶38 或CDla和CD14标记。详见6. 6节。图19 (A-B).用单剂量或多剂量的Actimid 处理的⑶34+祖细胞在第6天的表型改变。图19A 条件1 在第0天单剂量Actimid ；条件2 在第0天和第4天给药Actimid ； 条件3 在第0天、第2天和第4天给药Actimid 。Y轴表示表达特定标记或重组标记的细胞的百分比。图19B 条件1 在第0天单剂量Actimid ;条件2 在第0天、第4天、第6天、 第8天给药Actimid ；条件3 在第0天、第2天、第4天、第6天、第8天给药Actimid 。 细胞由⑶Ilc和⑶15的表达而估定，其为粒细胞标记。Y轴表示与Actimid 或DMSO(对照)接触的⑶Ilc+⑶15_和⑶llc_CD15+细胞的百分比。详见6. 6节。图20 (A-F).从第1天至第12天暴露于ActimidTM(l μ Μ)的CD34+细胞产生的树突细胞在第12天的流式细胞图。与对照相比Actimid 在第12天引起⑶86和⑶80分子共刺激的降低。细胞用CDlaFITC和CD86PE抗体、CDlaFITC和CD80PE抗体或CDlaFITC和 ⑶14PE抗体双标记。A 细胞用DMSO处理，且在第12天对⑶86和⑶Ia染色。B 细胞用DMSO 处理，且在第12天对⑶80和⑶Ia染色。C 细胞用DMSO处理，且在第12天对⑶14和⑶Ia 染色。D 细胞用Actimid 处理，且在第12天对CD86和CDla染色。E 细胞用Actimid 处理，且在第12天对⑶80和⑶Ia染色。F 细胞用Actimid 处理，且在第12天对⑶14和 ⑶Ia染色。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞的百分比。详见6. 6 节。图21 (A-D).从第1天至第12天暴露于ActimicT(IyM)的CD34+细胞产生的树突细胞在第12天的流式细胞图。暴露于Actimid 导致CM4粘附分子表达的改变，相对于对照(与图21D中次屏板E和F比较)，引起⑶54toight表达的降低和⑶Mdim表达的提高。A 细胞用DMSO处理，且用IgGl对HLADR染色。B 细胞用DMSO处理，且对⑶讨和⑶40染色。C 细胞用Actimid 处理，且用IgGl对HLA-DR染色。D 细胞用Actimid 处理，且对CM4 和⑶40染色。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞的百分比。详见 6. 6 节。图22 (A-B). Actimid 促进从CD34+祖细胞的粒细胞分化。在DMSO (图22A)或 Actimid (图22B)下生长12天，然后用粒细胞分子标记⑶15的抗体标记的⑶34+细胞的流式细胞图。每张细胞图上显示的百分比表示表达特定重组标记的细胞的百分比。详见6. 6 节。图23 (A-D). Actimid 并不诱导 CDla+或 CD14+前体细胞的凋亡。CDla+CDlf 禾口 CDlaXDH+分离细胞(DC祖细胞)的流式细胞图。CD34+祖细胞在SCF、FlOL, GMXSF和 TNF-α下经过6天的培养。在第6天，通过磁性细胞分选器(Miltenyi)收集⑶la+CD14_* □)1&飞014+细胞，在存在61 ^ 和1顺-0以及存在或不存在ActimicT(IyM)的条件下培养⑶Ia+⑶14_和⑶IaTDH+细胞群额外2天。凋亡细胞随后用膜联蛋白V-FITC，一种凋亡的标记，染色，与碘化丙锭(PI)，一种活性探针，联合使用。每张细胞图上的百分比表示对膜联蛋白V-FITC和/或碘化丙锭染色阳性的细胞的百分比。对膜联蛋白V-FITC阳性的细胞数量与Actimid 处理的和对照的细胞(尤其与每张细胞图中的B3和B4比较)作比较。 A 用DMSO处理的CDla+CDlf细胞。B 用Actimid 处理的CDla+CDlf细胞。C 用DMSO处理的CDlaTDH+细胞。D 用Actimid 处理的CDlaTDH+细胞。详见6. 6节。图M(A-D).在由Actimid 存在或缺乏下生长12天的CD34+细胞的流式细胞图。 Actimid 引起甘露糖受体介导的胞饮作用的降低，其与DMSO对照比较，通过FITC标记的右旋糖酐摄取的降低而得到证明。A :DMS0和40C ο B =ActimidTM ^P 4°C。C :DMS0和37°C。D ActimidTM和37°C。每张细胞图上的百分比表示呈现胞饮作用的细胞分数。详见6. 6节。图25 (A-D).培养12天的⑶34+细胞的流式细胞图，且从第6天至第12天在存在或缺乏Actimid 下培养。在第1至5天Actimid 缺乏下培养后，在第6至12天Actimid 存在下培养，与DMSO对照相比，导致甘露糖受体介导的胞饮作用。每张细胞图上的百分比表示呈现胞饮作用的细胞分数。A:DMS0和4°C。B :ActimidTM和4°C。C:DMS0和37°C。D ActimidTM 和 37°C。详见 6. 6 节。图沈.Actimid 降低培养12天的⑶34+细胞呈递抗原的能力。⑶34+细胞在存在或缺乏Actimid 下培养12天；Actimid 处理的细胞，在第12天，与DMSO对照比较显示基本上降低的刺激作用指标。图27.对从第6天至第12天在Actimid 存在下培养的CDM+细胞，Actimid 具有抗原呈递细胞(APC)减少的活性。⑶34+细胞在存在或缺乏Actimid 下培养5天。处理过的细胞的抗原呈递能力与对照，DMSO处理的细胞作比较。详见6. 6节。图28.在GM-CSF和TNF- α存在下培养的⑶34+造血祖细胞的分化途径。图29.显示以Actimid 对于在GM-CSF和TNF- α存在下培养的⑶；34+造血祖细胞的分化途径的效果的总结图表。详见6. 6节。图30.显示鼠ka+LirT造血祖细胞成熟条件的图表。细胞在存在干细胞因子(SCF)、Flt-3L、粒巨噬集落刺激因子(GM-CSF)和巨噬集落刺激因子(MCSF)及0. 1 % DMSO (对照)下生长9天，10 μ M Actimid 或10 μ M全反式视黄酸(ATRA)用以驱动细胞向 DC前体细胞表型分化。细胞随后从第9天至第12天在GM-CSF和TNF- α存在下培养，加入DMS0、ACtimid 或ATRA，以驱动鼠细胞向未成熟的树突细胞的分化。详见6. 8节。图31 (A-E).鼠细胞在普通培养条件下第9天出现(见实施例1，材料和方法，图 30的描述)。细胞用CD80的抗体(图31A)、CDll的抗体(图31B)、CD32/16的抗体(图 31C)、MHC II (I-Ab)的抗体(图31D)、CD14的抗体(图31E)或Gr-I的抗体(图31F)标记。细胞在第9天呈现出被⑶88、⑶11或⑶32/16分子标记的抗体标记上，被I-Ab分子标记的抗体少许标记上，未被⑶14或Gr-I分子标记的抗体标记上。详见6.8节。图32 (A-I).用DMS0、ACtimid 或ATRA处理的鼠细胞第12天的流式细胞图。细胞用CD86和CDllb的抗体标记。图32A-32C (顶行)细胞图显示用DMSO (对照)、Actimid 或全反式视黄酸(ATRA)处理时表达⑶86 (Y-轴)的细胞百分数。图32D-32F (中间行)在如顶行处理时，表达主要的组织相容性复合物II (MHC-II)的细胞百分数。图32G-32I (底行)在如顶行处理时，表达⑶lib的细胞百分数。详见6. 8节。5.发明详述本发明部分基于意外的发现，即干细胞或祖细胞暴露于本发明的化合物致使产生一种控制干细胞或祖细胞向特定祖细胞群体分化或祖细胞向特定细胞类型，如树突细胞、 粒细胞、内皮细胞或神经细胞分化的可调控的方法。尤其是，干细胞或祖细胞暴露于本发明的化合物致使产生造血细胞特定群体，包括⑶；34+、⑶38+和⑶133+细胞的可调控的分化和增殖。这种分化的调控在没有因细胞死亡或分化为不需要的细胞类型或细胞谱系而造成产量的显著损失的情况下完成；换言之，本发明的化合物没有引发一种或多种细胞群体的凋亡。进一步地，造血祖细胞暴露于本发明的化合物导致特定细胞类型的可调控的分化和增殖。因此，本发明提供调节人干细胞分化的方法，特别是⑶34+造血祖细胞和⑶133+ 祖细胞的分化。尤其是，本发明提供使用抑制TNF-α活性的小的有机分子调节祖细胞沿着特定细胞和组织谱系分化的方法。进一步地，本发明包括增殖早期祖细胞，如人CD133+或 CD34+细胞，尤其是CD34+CD38_细胞，以移植入哺乳动物、鸟类或爬行动物中的方法，包括将造血祖细胞暴露于TNF_a抑制剂或拮抗剂，其中抑制剂或拮抗剂是小分子物质。本发明还提供了从这些早期祖细胞产生其他类型细胞的方法，包括但不限于脑细胞、肾细胞、肠道细胞和肌肉细胞。本发明的化合物还对抑制从早期祖细胞，如人CD34+祖细胞的树突细胞分化以及促进粒细胞的分化起作用。与本发明相关地使用的小分子化合物的实例包括但不限于，抑制ΤΝΓα活性的化合物。在本发明的方法中使用的化合物在5. 3节详细描述。在一个实施方案中，虽然也使用沙利度胺水解产物、代谢物和前体，优选的化合物为沙利度胺类似物。在特别优选的实施方案中，化合物为 LniDsTM(Celgene)，如 Actimid 和 Revimid 。本发明的方法包括干细胞或祖细胞向特定细胞谱系分化的调控，包括但不限于间充质的、造血的、生脂的、生肝的、生神经的、成胶质的、生软骨的、生血管的、生肌的、生软骨的或成骨的谱系，其包括优选在体外将干细胞或祖细胞和本发明的化合物温育足够的一段时期，致使细胞向期望的细胞谱系的细胞分化。在一个具体的实施方案中，干细胞或祖细胞向造血谱系细胞的分化受到调节。具体地说，本发明的方法可用于以一种剂量相关的方式调节由⑶34+、⑶133+和⑶45+造血祖细胞生成血细胞集落的发生。本发明的方法还包括CD34+祖细胞向树突细胞分化的调节，其包括优选在体外将祖细胞和本发明的化合物温育足够长的一段时期，致使细胞向期望的细胞谱系的细胞分化。在一个具体的实施方案中，该祖细胞向树突细胞谱系细胞的分化通过将所述细胞接触 Actimid 或Revimid 或其类似物或前药而调节。在另一个具体的实施方案中，⑶34+祖细胞的分化得到调节以抑制沿着髓样谱系的分化并支持沿着粒细胞谱系的分化。在一个更具体的实施方案中，CD34+祖细胞向粒细胞谱系细胞的分化通过包括将CD34+祖细胞和本发明的化合物在对祖细胞培养的第1天接触的方法而调节。任何哺乳动物干细胞或祖细胞可以按照本发明的方法使用，包括但不限于，从脐带血(“CB”细胞)、胎盘和其他来源分离的干细胞。干细胞可包括多能性细胞，即，具有完全的分化多样性、能自我更新以及在组织中维持休眠或静止的细胞。干细胞还可包括多潜能性细胞和定向祖细胞。在一个优选的实施方案中，本发明利用活的、静止的、多能性的干细胞，其存在于足期的胎盘中，可随着导致多潜能性和多能性干细胞的回收的成功的分娩和胎盘娩出、放血和胎盘灌注而得以回收。在另一个优选的实施方案中，祖细胞为早期祖细胞，尤其是CD34+或CD133+细胞。 优选地，⑶34+或⑶133+祖细胞来源于人骨髓、胎盘或脐带血。从其他哺乳动物来源的这些细胞的等效物也可使用。例如，在小鼠中，Sca+祖细胞可在本发明的方法中使用。从鸟类或爬行动物来源的等效的早期祖细胞也可使用。在本发明的一个具体的实施方案中，胎盘内生性的或通过产后灌注胎盘产生的细胞，包括但不限于，胚胎样干细胞、祖细胞、多能性细胞和多潜能性细胞，在分离的和灌注的胎盘中培养时暴露于本发明的化合物，且诱导分化。在产后灌注的胎盘中繁殖的内生性细胞可以进行回收，和/或生物活性分子可从灌注液、培养基或从胎盘细胞自身进行回收。在本发明的另一个实施方案中，将源于除了后胎盘的其它来源的干细胞或祖细胞在体外培养时暴露于本发明的化合物并且进行诱导分化。因此，本发明包括使哺乳动物干细胞分化为特定祖细胞的方法，其包括使干细胞在适于期望的分化的条件和/或培养基的情况下以及在本发明的化合物存在的情况下将干细胞进行分化。进一步地，本发明包括调节或调控特定祖细胞群体向特定细胞类型分化的方法， 其包括使所述祖细胞在适合所述分化的条件下以及在一种或多种本发明的化合物存在下进行分化。可选择地，干细胞或祖细胞可暴露于本发明的化合物，随后用合适的条件进行分化。合适条件的实例包括用人血清和细胞培养基质补充的营养培养基制剂，如用生长因子补充的 MATRIGEL 。本发明的方法还涉及不同的细胞群体，其可通过用本发明的化合物在培养的不同时期，无论是增殖或分化期接触祖细胞而产生。参见5. 4节，具体为下面的5. 4. 2节。在一个具体的实施方案中，本发明提供了使用酰胺和酰亚胺小分子，尤其是沙利度胺的氨基结合物来调节和调控在造血祖细胞移植前调节时期的血细胞生成的方法。本发明还提供了使用本发明的小分子物质来调节和调控在先体外后体内造血祖细胞调节时期的血细胞生成的方法。本发明的方法包括干细胞或祖细胞体外分化的调控， 包括体外温育化合物和干细胞或祖细胞，随后向受治疗者直接移植分化的细胞。本发明还包括通过将干细胞或祖细胞以及本发明的化合物给药于其有需求的患者而在体内对干细胞或祖细胞的控制和调控。本发明进一步包括预处理的干细胞或祖细胞的移植以治疗或预防疾病。在一个实施方案中，对需要移植的患者在移植前、移植中和/或移植后给药以本发明的化合物。在另一个实施方案中，还对需要移植的患者给药未经处理的干细胞或祖细胞，例如脐带血细胞、 成人血细胞、外周血细胞或骨髓细胞。在另一个实施方案中，本发明的方法包括对受治疗者给药以化合物，所述受治疗者为未调节的干细胞或祖细胞的受体，以诱发出对已移植的干细胞的调节效应。在某些实施方案中，本发明包括骨髓移植，其包括移植脐带血(或从脐带血获得的干细胞)、外周(即，成体)血(或从外周血获得的干细胞)，其中所述脐带血或干细胞已用本发明的化合物预处理过。另外，本发明包括由在本发明的化合物存在下已分化的造血祖细胞制得的白细胞的用途。例如，通过分化造血祖细胞而产生的白细胞可用于移植或可在移植前与脐带血或脐带血干细胞混合。在其它的实施方案中，本发明包括骨髓移植，其包括按照本发明的方法获得的早期祖细胞，如CD34+或CD133+祖细胞的移植，其中所述祖细胞已用本发明的化合物预处理过。在本发明的一个实施方案中，所述树突细胞的前体细胞为⑶34+⑶38_CD33+或 ⑶34+CD38TD33_前体细胞。进一步地，本发明包括由已在本发明的化合物存在下分化的 CD34+祖细胞制得的细胞的用途。例如，通过CD34+祖细胞的分化而用本发明的化合物产生的CD34+CD38TD33+前体细胞、CD34+CD38XD33-前体细胞、粒细胞等，可用于移植中。用本发明的化合物从CD133+细胞分化来的细胞也为本发明所包括。本发明进一步包括在深低温保藏和融化后调节干细胞，以消除深低温保藏和暴露于冷冻保藏剂对干细胞的有害影响的方法。在某些实施方案中，本发明提供跟随深低温保藏和融化的调节干细胞，以消除暴露于冷冻保藏剂(例如，DMS0)对干细胞的增殖和迁移能力的有害影响的方法。5. 1干细胞和⑶34+或⑶133+祖细胞的分化的调节5. 1.1 干细胞本发明提供调节人干细胞分化的方法。在某些实施方案中，本发明的方法包括在体外干细胞或祖细胞分化的调控，包括体外将干细胞与化合物一起温育，随后向受治疗者直接移植分化的细胞。在另一个实施方案中，本发明的方法包括体内干细胞或祖细胞分化的调控，包括向未调节的干细胞受体的受治疗者递送化合物，随后向受治疗者直接给药以化合物。通过本发明的方法获得的胚胎样干细胞可诱导向特定细胞谱系的分化，这些细胞谱系包括但不限于间充质的、造血的、生脂的、生肝的、生神经的、成胶质的、生软骨的、生血管的、生肌的、生软骨的或成骨的谱系。在某些实施方案中，将按照本发明的方法获得的胚胎样干细胞诱导分化，以用于移植和先体外后体内治疗的方案中。在某些实施方案中，通过本发明的方法获得的胚胎样干细胞向特殊的细胞类型诱导分化，且受到遗传操纵以提供基因治疗的产品。在一个具体的实施方案中，通过本发明的方法获得的胚胎样干细胞在体外与诱导其分化的化合物如小的有机分子一起温育，随后向受治疗者直接移植分化的细胞。在一个优选的实施方案中，用于控制和调控干细胞分化的化合物不是多肽、肽、蛋白、激素、细胞因子、寡核苷酸或核酸。按照本发明而使用的干细胞包括但不限于，脐带血(CB)细胞、胎盘细胞、胚胎干 (ES)细胞、胚胎样干细胞、滋养层干细胞、祖细胞、骨髓干细胞及多潜能性、多能性和全能性细胞。尤其是，本发明的方法包括除间充质干细胞外的干细胞群体向特定组织谱系分化的调控。例如，通过促进特定肌肉骨骼的再生和修复、新血管的发生及特定肌肉组织，如心肌和骨骼肌，以及各种器官和组织的血运重建，所述器官和组织包括但不限于脑、脊髓、肝、 肺、肾和胰脏，本发明的方法可用于调控多潜能性干细胞向生软骨的、生血管的、生肌肉的和成骨谱系细胞的分化。本发明的方法可用于调控多潜能性干细胞向生脂、生软骨、成骨、 生神经或生肝的谱系的分化。用于调节分化的试剂可导入产后灌注的胎盘以诱导在胎盘中培养的细胞的分化。 选择性地，该试剂可用于从胎盘中收集或移除细胞后在体外调节分化。本发明的方法包括祖细胞向造血谱系细胞分化的调控，包括在体外将祖细胞和化合物温育足够的一段时期，致使细胞向造血谱系的分化。尤其是，本发明的方法可用于以剂量相关方式调节由CD34+、CD133+和CD45+造血祖细胞生成血细胞集落的发生(关于剂量的讨论，见5.7节)。优选地，本发明的方法可用于特异性地抑制红血细胞或红细胞集落(BFU-E和 CFU-E)的生成，同时增加白细胞和血小板集落形成(CFU-GM)的生成以及提高总的集落形成单位的产量。本发明的方法不仅可用于调控干细胞的分化，还可刺激集落形成率，通过提高骨髓植入物的速度和白细胞和/或血小板产物的恢复而给造血干细胞移植提供显著的益处。在其它的实施方案中，本发明的方法可用于调控例如神经元前体细胞或神经母细胞向特定的神经细胞类型如感觉神经元(例如，视觉细胞、嗅觉细胞、机械感应神经元、化学感应神经元等)、运动神经元、皮质神经元或中间神经元的分化。在其它的实施方案中， 本发明的方法可用于调控包括但不限于胆碱能神经元、多巴胺能神经元、Y-氨基丁酸能神经元、神经胶质细胞(包括少突胶质细胞，其产生髓磷脂)和室管膜细胞(其排列于脑室系统)细胞类型的分化。仍在其它的实施方案中，本发明的方法可用于调控为器官组分的细胞的分化，包括但不限于，心脏的普尔基涅细胞、肝的胆管上皮细胞、胰脏的β胰岛细胞、 肾皮质或髓细胞及眼睛的视觉感光细胞。按照本发明的方法获得的干细胞分化状态的评价可通过细胞表面标记的存在而鉴定。例如，本发明的胚胎样干细胞，可通过下面的细胞表面标记0CT-4+和ABC-pt而区分。进一步地,本发明包括具有下列标记⑶10、⑶四、⑶44、⑶M、⑶90、SH2、SH3、SH4、0CT-4 和ABC-p或者如前所描述的缺乏下列细胞表面标记⑶34、⑶38、⑶45、SSEA3和SSEA4的胚胎样干细胞。这样的细胞表面标记可按照本领域熟知的方法常规测定，例如，通过流式细胞计数法，伴随洗涤和用抗细胞表面标记的抗体染色。例如，为测定CD34或CD38的存在，细胞可在PBS中洗涤，然后用抗⑶34的藻蓝蛋白和抗⑶38的异硫氰酸荧光素(Becton Dickinson, Mountain View, CA)双染色。5. 1. 2 CD34+ 和 CD133+ 早期祖细胞本发明还提供调节人⑶34+或⑶133+细胞分化的方法。在某些实施方案中，本发明的方法包括在体外干细胞或祖细胞的调控，包括体外温育干细胞和化合物，随后将分化的细胞直接移植入受治疗者。通过本发明的方法获得的祖细胞可沿着特定细胞谱系诱导分化，包括但不限于，对于CD34+祖细胞，沿着髓样或粒细胞谱系，对于CD133+细胞，沿着内皮或神经细胞谱系。 在某些实施方案中，祖细胞被诱导分化以用于移植和先体外后体内治疗方案。在某些实施方案中，祖细胞向特殊的细胞类型诱导分化，且受到遗传操纵以提供基因治疗的产品。在具体的实施方案中，将祖细胞在体外与诱导其分化的化合物，如小的有机分子一起温育，随后向受治疗者直接移植分化的细胞。在一个优选的实施方案中，用于控制和调控干细胞分化的化合物不是多肽、肽类、蛋白、激素、细胞因子、寡核苷酸或核酸。在另一个优选的实施方案中，祖细胞促成向⑶34+⑶38TD33+或⑶34+⑶38XD33-祖细胞分化。优选地，本发明的方法可用于特异性地抑制红血细胞或红细胞集落(BFU-E和 CFU-E)的生成，同时增加白细胞和血小板集落形成(CFU-GM)的生成以及提高总的集落形成单位的产量。本发明的方法不仅可用于调控干细胞的分化，还可刺激集落形成率，通过提高骨髓植入物的速度和白细胞和/或血小板产物的恢复而给造血干细胞移植提供显著的益处。在其它的实施方案中，本发明的方法可用于减少CD34+祖细胞向CDla+细胞，尤其是CD86+CDla+细胞的分化。在另一个实施方案中，本发明的方法可用于减少或防止CD34+ 祖细胞向⑶14+CDla—细胞的分化。⑶14+⑶la—细胞为表皮树突细胞或单核/巨噬祖细胞。 在另一个实施方案中，本发明的方法可用于减少在增殖的CD34+祖细胞上CD80和CD86共刺激分子的表达。在另一个实施方案中，本发明的方法可用于减少增殖的CD34+祖细胞向 CD54toight细胞的分化，且激励向细胞的分化。在另一个实施方案中，本发明的方法可用于增加CD133+细胞的数量，其为内皮细胞祖细胞。仍在另一个实施方案中，本发明的方法可用于减少增殖的⑶34+细胞向⑶llc_CD15+细胞的分化，且增加向⑶llc+CD15_细胞的分化，由此分化从髓样树突细胞谱系转变为粒细胞谱系。按照本发明的方法获得的干细胞分化状态的评价可通过细胞表面标记的存在而鉴定。例如，本发明的祖细胞，可通过⑶34+或⑶133+细胞表面标记而区分。进一步地，本发明包括拥有或显示相对于对照高表达如前所描述的一种或多种下列标记CD15、CD34、 ⑶33、⑶133或OTMdim的增殖的祖细胞。本发明进一步包括缺乏或显示相对于对照低表达一种或多种下列标记HLA_DR、CDla, CDllc、CD38、CD80、CD86、CD54bright 或 CD14 的增殖的祖细胞。在一个优选的实施方案中，本发明的增殖的祖细胞呈现CD34+CD38_CD33+或 ⑶34+CD38TD33_。这样的细胞表面标记可按照本领域熟知的方法常规测定，例如，通过洗涤和用抗细胞表面标记的抗体染色，随后经过流式细胞计数法测定。例如，为测定CD34或 CD38的存在，细胞可在PBS中洗涤，然后用抗CD34的藻蓝蛋白和抗CD38的异硫氰酸荧光素 (Becton Dickinson, Mountain View, CA)双染色。在某些实施方案中，分化的细胞可通过鉴定分化的细胞吞噬能力而表征。例如，可通过用FITC标记右旋糖酐及用已知的方法测定摄取量而评价已分化的或正在分化的细胞的吞噬作用。分化的或正分化的细胞刺激T细胞的能力可在混合淋巴细胞反应(MLR)中测定，其中假定的负载抗原的细胞与T细胞混合，然后测定T细胞的活性水平。5. 1.3细胞的鉴定和表征在某些实施方案中，已分化的细胞可通过表现差异表达的基因而鉴定(例如，表现未分化的祖细胞来源的基因库与源于祖细胞的已分化的细胞的基因库的差别)。例如， 核酸扩增方法如聚合酶链式反应(PCR)或基于转录的扩增方法(例如，体外转录(IVT))可用于展现在不同细胞群体中的基因表达，例如，通过使用多核苷酸微阵列。该用于展现差别基因表达的方法在本领域中是熟知的(见，例如，Wieland等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 87 :2720-2724(1990) ；Lisitsyn 等，Science 259:946-951(1993) ；Lisitsyn 等 Meth. Enzymology 254 :291-304(1995)；美国专利号 5，436，142 ；美国专利号 5，501，964 ； Lisitsyn 等，Nature Genetics 6:57—63(1994) ；Hubank 禾口 Schatz，1994，Nucleic Acids Research 22 :5640-5648 ；Zeng ^,1994, Nucleic Acids Research 22 :4381-4385 ； _ 国专利号5，525，471 ；Linsley等，美国专利号6，271，002，题为“RNA扩增方法”，公开于 2001-08-07 ；Van Gelder等，美国专利号5，716，785，题为“使用启动子进行基因操作的过程，，，公开于 1998-02-10 ；Stoflet 等，Science 239 :491-494,1988 ；Sarkarand Sommer, 1989，Science 244 :331-334 ；Mullis 等，美国专利号 4，683，195 ；Malek 等，美国专利号 5，130，238 ；Kacian 和 Fultz,美国专利号 5，399，491 ；Burg 等，美国专利号 5，437，990 ； R. N Van Gelder 等，(1990)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87，1663 ；D. J. Lockhart 等，1996， Nature Biotechnol. 14，1675 ；Shannon 美国专利号 6，132，997 ；Lindemann 等，美国专利号 6，235，503，题为“削减杂交和差异分析的方法”，公开于2001-05-22)。商业上现有的试剂盒对于基因展现是有用的，例如，展示PROFILE 系列试剂盒 (Qbiogene, Carlsbad, CA)，其使用基于凝胶的处理方法来展现基因表达。该试剂盒利用限制性片段差异显示PCR(RFDD-PCR)在真核细胞内比较基因表达模式。PCR-选择性削减试剂盒(Clontech)和PCR-选择性差示筛选试剂盒(Clontech)也可使用，其允许削减文库中差异表达克隆的鉴定。在用POT选择性削减试剂盒产生差异表达基因库后，POT选择性差示筛选试剂盒得到使用。用直接由检测和驱动子集群合成的探针与削减文库与杂交，一种产自削减cDNA的探针，以及一种制自反向削减cDNA(反向进行的第二次削减)的探针。与检测子而不是驱动子探针杂交的克隆得到差异表达；然而，未削减的探针对于检测微量信息不够灵敏。削减的探针为差异表达cDNA而得到大量富集，但可能给出假阳性的结果。按照制造商的(Clontech)指导使用削减的和未削减的探针来鉴定差异表达基因。在另一个实施方案中，分化的干细胞或祖细胞通过集落形成单位测定法而得到鉴定和表征，其在本领域中是通常所知的，例如Mesen Cult 培养基(干细胞技术，Inc., Vancouver British Columbia)。干细胞或祖细胞已分化为特殊的细胞类型的测定可通过本领域熟知的方法完成， 例如，使用如流式细胞计数法或免疫细胞化学(如，用组织特异性或细胞标记特异性抗体对细胞染色)测量形态学上的和细胞表面标记的变化，通过用光学或共聚焦显微镜对细胞形态学检查，或使用本领域熟知的技术，如PCR和基因表达展示，测量基因表达的变化。5. 2干细胞和祖细胞群体本发明提供调节人干细胞分化的方法。任何哺乳动物干细胞可在本发明的方法中使用，包括但不限于，分离自脐带血(CB细胞)、外周血、成体血、骨髓、胎盘、间充质干细胞及其他来源的干细胞。在非优选的实施方案中，干细胞为胚胎干细胞或已从非胎盘的来源分离的细胞。间充质干细胞的来源包括骨髓、胚胎卵黄囊、胎盘、脐带、胎儿和青少年皮肤和血液。例如，骨髓细胞可从髂骨嵴、腿节、胫节、肋骨或其他髓的空腔获得。按照本发明的方法使用的干细胞可包括多能性细胞，S卩，具有完全的分化多样性、能自我更新以及在组织中维持休眠或静止的细胞。干细胞还可包括多潜能性细胞、定向祖细胞和成纤维细胞。在一个优选的实施方案中，本发明利用的干细胞为从足期的放血灌注的胎盘分离的活的、静止的、多能性的干细胞。干细胞群体可以由通过商业服务获得的胎盘干细胞而组成，例如LifeBank美国(Cedar Knolls, NJ)、ViaCord(Boston ΜΑ)、Cord Blood Registry (San Bruno, CA)禾口 Cryocell (Clearwater, FL)。干细胞群体还包括按照美国申请，
发明者D·I·斯蒂尔林, K·W·H·陈, L·A·穆托-德帕塞瓦尔, R·J·哈里里 申请人:细胞基因公司