一种蓝藻整合型穿梭表达载体及其构建方法

专利名称：一种蓝藻整合型穿梭表达载体及其构建方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，尤其是一种蓝藻整合型穿梭表达载体及其构建方法。
背景技术：
蓝藻生长只需光照、空气和无机盐，自身不含毒蛋白，一旦外源目的基因能在蓝藻受体细胞中正常表达，在光照下就可生产目的基因的产物。蓝藻可作为外源基因的表达宿主，与常用的表达宿主如大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞宿主相比，蓝藻具有环境适应能力强、培养成本低、不形成包含体、不含内毒素、本身含有对人类有益的营养成分等优点。因此，蓝藻在食品、环境、健康和能源方面的作用越来越受到人们的重视，具有很大的开发前
旦
ο蓝藻基因工程主要研究来源于蓝藻目的基因的克隆、向蓝藻中转移外源基因、所需载体平台的构建、基因转移方法和检测方法的建立等，其中，载体的构建是藻类基因工程的关键所在，是影响外源基因表达稳定性和表达效果的重要因素，常用的载体主要有两类， 表达载体和整合型表达载体。表达载体的构建及完善大大推动了蓝藻基因工程的基础研究和应用研究。目前表达载体在蓝藻细胞中的表达中不是很稳定，容易丢失。构建整合型表达载体可定位整合到受体细胞染色体DNA的同源重组位点上，稳定地随染色体DNA的复制而遗传，并在染色体上原有的调控元件或外源基因表达单元自带的调控元件作用下表达。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种蓝藻整合型穿梭表达载体及其构建方法，本发明所述蓝藻整合型表达载体是一种环状载体，包含整合片段、筛选标记基因和外源基因表达元件等组成部分。本发明实现目的的技术方案如下一种蓝藻整合型穿梭表达载体，包含整合片段F1、蓝藻启动子PpsbA1、筛选标记基因nptll和整合片段F2，所述载体序列上游至下游的方向依次为整合片段F1、蓝藻启动子 PpsbA1、筛选标记基因nptll和整合片段F2，具体序列见序列5。而且，所述外源片段插入位点为Ndel/Clal位于649_667bp之间，具体为 “ CATATGGGGATCCATCGAT”。而且，所述蓝藻载体序列部分来自于克隆载体pBluescript II SK(+)。而且，所述同源重组整合片段为Fl和F2，来自于鱼腥藻7120 Anabaena sp. PCC 7120基因组DNA序列第46M703-4655672位点，是ORFs alr3857和alr3858之间的非编码区。而且，所述筛选标记基因为带有专用启动子的新霉素磷酸转移酶Neomycin Phosphotransferase II基因nptll，该酶表现卡那霉素抗性。而且，所述蓝藻启动子PpsbA1来自鱼腥藻7120光系统II的Dl蛋白质强启动子序列。
一种蓝藻整合型穿梭表达载体的构建方法，步骤如下(1)以鱼腥藻7120的基因组DNA为模板，用Fl弓丨物1和2进行PCR扩增，得到整合片段Fl片段；(2)以鱼腥藻7120的基因组DNA为模板，用F2弓丨物3和4进行PCR扩增，得到整合片段F2片段；(3)以鱼腥藻7120的基因组DNA为模板，用PpsbA1弓丨物5和6进行PCR扩增，得到
蓝藻启动子Ppsmi片段；(4)以pET30载体为模板，用nptll基因引物7和8进行PCR扩增，得到筛选标记基因nptll片段；(5)载体pPpsbA1_F2的构建依次将整合片段F2、蓝藻启动子PpsbA1导入大肠杆菌受体细胞中，获得的克隆重组质粒PTF2和pTPpsbA1，用^(bal+BamHI双酶切，纯化回收后进行连接，将F2插入到自连的pTPpsbA1载体中获得pPpsbA1_F2载体；(6)载体pFl-PpsbA1_F2的构建将Fl导入大肠杆菌受体细胞中，获得的克隆重组质粒PTF1，用Xbal+PstI双酶切质粒pPpsbA1_F2和PTFl后，将pPpsbA1_F2连接到载体PTFl上， 获得 pFl-PpsbA1-F2 载体。(7)载体pAnFP的构建将nptll导入大肠杆菌受体细胞中，获得的克隆重组质粒 pTnptll，用BamHI分别酶切质粒pFl-PpsbA1_F2和pTnptll，纯化回收后进行连接，将nptll 插入到pFl-PpsbA1-F2载体中获得pFl-PpsbA1-nptII-F2载体即pAnFP载体。一种含有蓝藻整合型穿梭表达载体的全序列，其特征在于序列见序列16。本发明的有益效果和优点是本发明的优点和积极效果如下1、本发明中pAnFP整合型表达穿梭载体能够直接与蓝藻染色体DNA同源位点重组，将外源基因定位整合到染色体DNA上，可在蓝藻细胞中稳定表达，避免质粒复制丢失的问题。2、本发明的整个基因重组和表达过程操作简单，实验周期短，重组效率高，能够快速高效地构建蓝藻整合型穿梭表达载体并实现外源基因的稳定表达，具有很好的应用前景，可为产业化开发转基因蓝藻开辟一条新途径。3、本发明的蓝藻整合型穿梭表达载体pAnFP，可运用三亲接合转移方法和基因整合平台系统进行外源基因表达。


图1为本发明提供的整合型表达载体pAnFP的表达元件盒示意图，包括同源重组序列Fl和F2，蓝藻特异启动子Ppsmi序列，筛选标记基因nptll，以及外源基因插入位点的限制性内切酶种类；图2为本发明提供的整合型表达载体pAnFP的构建方法流程示意图；图3-A到图3-E为本发明提供的整合型表达载体pAnFP构建方法及应用的一个实施例的鉴定结果，其中图3-A、图3-B为载体pTPpsbA1-F2的鉴定结果；图3_C为载体 PTF1-PPSM1-F2的鉴定结果；图3-D为载体pAnFP的鉴定结果；图3-E为载体pAnFP-gfp的
鉴定结果；
图4为本发明提供的整合型表达载体pAnFP构建方法及应用的一个实施例的表达绿色荧光蛋白GFP的荧光显微镜观察结果。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。一种蓝藻整合型穿梭表达载体，命名为pAnFP，包含整合片段F1、蓝藻启动子 PpsbA1、外源基因插入位点和筛选标记基因nptll、整合片段F2 ；所述载体序列上游至下游的方向依次为整合片段F1、蓝藻启动子PpsbA1、外源基因插入位点(下划线)、筛选标记基因 nptll和整合片段F2，序列见序列表，起顺序均为5’ -3，。外源片段插入位点为Ndel/Clal 位于649-667bp之间，见划线处，具体为“CATATGGGGATCCATCGAT”,外源基因插入位点为内切酶Ndel/Clal的位置。其中，所述蓝藻载体序列部分来自于克隆载体pBluescript II SK(+)；所述同源重组整合片段为Fl和F2，来自于鱼腥藻7120 (Anabaena sp. PCC 7120)基因组DNA序列第 4654703-4655672位点，是ORFs alr3857和alr3858之间的非编码区；所述筛选标记基因为带有专用启动子的新霉素磷酸转移酶(Neomycin Phosphotransferase II)基因nptll， 该酶表现卡那霉素抗性；所述蓝藻启动子PpsbA1来自鱼腥藻7120光系统II的Dl蛋白质强启动子序列。一种蓝藻整合型穿梭表达载体的构建方法，包括如下步骤参考表1、图1和图2，(1)以鱼腥藻7120的基因组DNA为模板，用Fl弓丨物1和2进行PCR扩增，得到整合片段Fl片段；(2)以鱼腥藻7120的基因组DNA为模板，用F2弓丨物3和4进行PCR扩增，得到整合片段F2片段；(3)以鱼腥藻7120的基因组DNA为模板，用PpsbA1弓丨物5和6进行PCR扩增，得到
蓝藻启动子Ppsmi片段；(4)以pET30载体为模板，用nptll基因引物7和8进行PCR扩增，得到筛选标记基因nptll片段；(5)载体pPpsbA1_F2的构建依次将整合片段F2、蓝藻启动子PpsbA1导入大肠杆菌受体细胞中，获得的克隆重组质粒PTF2和pTPpsbA1，用^(bal+BamHI双酶切，纯化回收后进行连接，将F2插入到自连的pTPpsbA1载体中获得pPpsbA1_F2载体。(6)载体pFl-PpsbA1_F2的构建将Fl导入大肠杆菌受体细胞中，获得的克隆重组质粒PTF1，用Xbal+PstI双酶切质粒pPpsbA1_F2和PTFl后，将pPpsbA1_F2连接到载体PTFl上， 获得 pFl-PpsbA1-F2 载体；(7)载体pAnFP的构建将nptll导入大肠杆菌受体细胞中，获得的克隆重组质粒 pTnptll，用BamHI分别酶切质粒pFl-PpsbA1_F2和pTnptll，纯化回收后进行连接，将nptll 插入到pFl-PpsbA1-F2载体中获得pFl-PpsbA1-nptII-F2载体即pAnFP载体；(8)上述各载体的酶切鉴定结果见图3。用BamHI+Xbal双酶切，经琼脂糖凝胶电泳得到F2片段和载体pBS-T(见图3-A)；用^(bal+Pstl双酶切，经琼脂糖凝胶电泳得到 PpsbAl+F2 片段和载体 pBS-T(见图 3-B)；分别用 EcoRI+PstI、BamHI+Xbal 和 Pstl+BamHI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测，泳道1、2和3分别为Fl、F2、PpsbA1片段和载体pBS-T (见图 3-C)；分别用Xbal+PstLBamHI+XbaUstl+BamHI和BamHI酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测， 泳道1、2、3和4分别为Fl、F2、PpsbA1、nptII片段和载体pBS-Τ (见图3-D)；用Ndel+Clal双酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测，得到gfp片段和载体PAnFP (见图3-E)。应用实施例本实施例提供的整合型表达载体pAnFP在鱼腥藻7120中表达绿色荧光蛋白GFP 的具体步骤如下(1)以含有gfp基因的pART27为模板，用引物9和10进行PCR扩增，得到片段 gfp ；(2)载体pAnFP-gfp的构建通过Ndel+Clal双酶切载体pAnFP，将gfp片段插入载体pAnFP中(见图幻，用Ndel+Clal双酶切鉴定载体pAnFP-gfp，经过琼脂糖凝胶电泳检测gfp的正确连接(见图3E)；(3)载体pAnFP-gfp用CaCl2法转化感受态大肠杆菌，用三亲接合转化鱼腥藻 7120。每管感受态细胞中加入5ul连接液，轻弹混勻，冰浴30min，42°C热休克90sec，冰浴 3min使体系冷却，加入温浴至37°C的LB培养液，150rpm振荡45min。取适量菌液铺于含相应抗生素的LB平板上，待平板表面干燥后，倒置培养过夜。 鱼腥藻7120培养在BG-Il负氮培养基中，温度27°C，pH 7. 2，液体培养时摇床转速为130r/ min0经过三亲接合转化，在含有卡那霉素的培养液中筛选具有抗性的转基因鱼腥藻7120 ；上述连接液购自Takara生物公司的商品化试剂2XT4 DNA Rapid Ligation Buffer，用量一般为5ul (以IOul反应体系为例)。三亲接合转化方法具体如下(1)大肠杆菌的准备在含有相应抗生素的LB培养液中接种含有穿梭表达载体的大肠杆菌及含有接合质粒RP4和辅助质粒pRL623的大肠杆菌，摇菌过夜。离心收菌，用普通LB培养液洗，用适量LB培养液重悬。等体积混合两种菌液；(2)蓝藻的准备取对数生长早期(OD665 = 0 . 4)蓝藻培养物，离心收集细胞，用培养液洗涤，再以适当体积的培养液悬浮藻细胞；(3)接合转化将藻细胞与细菌以适当的比例混合均勻，轻轻地将其涂于无抗生素的含滤膜的LB固体培养基上，尽量使滤膜上的混合液均勻，正置平板使液体完全渗入培养基中，倒置光照培养使蓝藻表达抗性，小心地转移滤膜到含有相应抗生素的平板上，继续照光培养直至出现阳性克隆。(4)荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的表达。荧光显微镜结果如图4所示，在488nm 光激发作用下，绿色荧光蛋白发出绿色荧光。转gfp基因鱼腥藻7120出现绿色荧光，表明有绿色荧光蛋白表达，而且表达的蛋白具有生物活性。表1是本发明提供的整合型表达载体pAnFP构建涉及的基因特异性引物。包括Fl 的引物1、2 ；F2的引物3、4 ；Ppsmi的引物5、6 ；基因nptll的引物7、8 ；基因gfp的引物9、 10。表达元件序列可以将外源基因整合至染色体上。具体应用时，需要将它与“其他序列”组成融合载体进行功能的体现，如本例就是将这个表达元件序列与pBluescript II SK(+)载体组合来表达外源基因。
上述的“其他序列”就是商品化克隆或表达载体，这些载体只有在多克隆位点插入外源片段-包括基因或表达元件序列才能表现出载体功能，如果没有外源片段插入，就是空载体，不会表达任何功能。本例的表达元件序列插入pBluescript II SK(+)载体形成一个新功能的整合表达载体，PBluescript II SK(+)载体使用非常广泛，许多新载体都是以它为出发载体构建新的功能载体。表达元件序列与“其他序列”的连接通过EcoRI和^(bal，它们分别位于表达元件的两端，即Fl的5，-端EcoRI位点和F2的3，-端)(baI位点。表1中已经列出。表 1
基因引物序列酶切位点产物(bp)Fl引物1 5'CCGGAATTCACGCCATAATCATGTGTC 3'EcoRI479引物2 5'TGCACTGCAGTGGGGATAATTACAACTC 3'PstIF2引物3 5'CGCGGATCCCCCCAATTTTGAAACCTATC 3' 引物4 5 'CTAGTCTAGAGGCTCACCATAGGTGAATGCAC 3 ‘BamHI XbaI431PpsbAl引物5 5 'GAGCTGCAGGGATTCCCAAAGATAGGG 3' 引物6 5 'CTCGGATCCCCATATGTTTTTATGATTGCTTTG 3 ‘ 引物7PstI BamHI/ NdeI BamHI/182nptll5 'CGGGATCCCATCGAT ACTCACGTTAAGGGAT3 ‘ 引物8 5 'CGGGATCC CAGGTGGCACTTTTCGGGGA3 ‘ClaI BamHI985Φ引物9 5'GGAATTCCATATG TTATTCAACA GCTGT3' 引物10 5 'CCATCGATGG ATGGCGAACAACGA3 ‘NdeI ClaI7171、整合型表达载体pAnFP的表达元件序列(2077bp)，外源片段插入位点为NdeI/ ClaI (位于649-667bp之间，见划线处)5 ’ -TATTATTGTTTACTCTACGCTTTACATAGAAATTGTGAAAAGCTCTTTTCCAGACGCTTAGAACTT AGGGACAAAAATGATTTCTGGATACTTGCGCTCACCGTGTAGTACGTTTCCAGTGGCAATTGTTCAGTCTGTAGCAG ATATTCAAACTGATTGACTTTACGACTGAACAGCTTGATAGGCTTAGATAGTATTGCTATTAAGTTTCAGTTTGGTC ACAAAAAGTAACAAATTAATTAATCAGTCAGATTTTTATTCCTTTGTTATCTTTAAATTTTCGCATCAATAAATAAC ACAGATAGGAGTTGACTTTGATTTCTGTTGGCGCAGTGTGGCATAGCTATAGGTACTTGTGTATCTAGGGGATGGTC ACTCCTTCACCAACAAAATTTAAATGGGATGCCTTATGGAAGTCTAATTGTATGGTTAGAGTTGTAATTATCCCCAA TTTTGAAACCTATCAACTATATTATTAACTTTAGAGTAATTTTAACATCTCGGTGTCAATTGTCATGCGGATAACAT TTATGTACTCAGCCGAAAAATTTTACTTACTTCGCTTGACAACTATATTATTATAAAGTTATATATGATTGTAAGACAAGTTACACCCTTGTCGGTTGATATTCAAAGCAATCATAAAAACATATGGGGATCCATCGATACTCACGTTAAGGGA TTTTGGTCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGA AACGTCTTGCTCTAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATG TCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAA GGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCAT CAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTAT TAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCT GTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGT TGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAACTTTTGC CATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATA GGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGA GTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTC ATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAAGAATTAATTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACA AATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGGCAGTGAAGACTTGCCATAACCTATATTTCTCGCAT GAAGTAATCTGCTGAGAACTATGAGTTGTGTAATATATTGTATTTTTATTAAGTGTAGGTTTAATTGCATAGAGTTA GCCGTTAGAACTAATTATCCCAGAATAGATACCTCAAATTCTCAGTAGCAGAAATTAAATAGATAACAAAATATACA AAATGCCTTCAGTATTTAAAACTTCTTCTCAGAAGACAAACACAGTTAGTAACCAGATGAATAACTCATCAAAATCA TCAACAGAAGTATTAGCTGTGTCTCCTGCATCCCAAAGGTATACTATGCAAAAATTGCCATGTAGAGACAATATTAA TAAGTTGTGGAAGTTATACAGATCAATTTTAAGTAAATGTATGTATACTTCTCTAGAATTAGCTGTGCATTCACCTA TGGTGAGCC-3’2、整合型表达载体pAnFP全序列(5014bp)，划线处为表达元件序列 (707bp-2783bp，共 2077bp)5 ’ -CTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTT TAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAG TTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGC CCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGG GAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGG GCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAG GGCGCGTCCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCA GCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAA CGACGGCCAGTGAGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGT ATCGATAAGCTTGATATCGAATTCTATTATTGTTTACTCTACGCTTTACATAGAAATTGTGAAAAGCTCTTTTCCAG ACGCTTAGAACTTAGGGACAAAAATGATTTCTGGATACTTGCGCTCACCGTGTAGTACGTTTCCAGTGGCAATTGTT CAGTCTGTAGCAGATATTCAAACTGATTGACTTTACGACTGAACAGCTTGATAGGCTTAGATAGTATTGCTATTAAG TTTCAGTTTGGTCACAAAAAGTAACAAATTAATTAATCAGTCAGATTTTTATTCCTTTGTTATCTTTAAATTTTCGC 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TTAATTGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAA CATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGC TCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGG TTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTAT CAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGC CAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCA CAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCT CCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCG CTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACC CCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGC CACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGG CCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGT 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CATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCA CTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAAT GCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCAT TTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCA CATTTCCCCGAAAAGTGCCAC-3‘。
权利要求
1.一种蓝藻整合型穿梭表达载体，其特征在于包含整合片段F1、蓝藻启动子PpsbA1、筛选标记基因nptll和整合片段F2，所述载体序列上游至下游的方向依次为整合片段F1、蓝藻启动子Ppsmi、筛选标记基因nptll和整合片段F2，具体序列见序列5。
2.根据权利要求1所述的蓝藻整合型穿梭表达载体，其特征在于所述外源片段插入位点为 Ndel/Clal 位于 649_667bp 之间，具体为 “CATATGGGGATCCATCGAT，，。
3.根据权利要求1所述的蓝藻整合型穿梭表达载体，其特征在于所述蓝藻载体序列部分来自于克隆载体PBluescript II SK(+)。
4.根据权利要求1所述的蓝藻整合型穿梭表达载体，其特征在于所述同源重组整合片段为Fl和F2，来自于鱼腥藻7120 Anabaena sp. PCC 7120基因组DNA序列第 4654703-4655672 位点，是 ORFs alr3857 和 alr3858 之间的非编码区。
5.根据权利要求1所述的蓝藻整合型穿梭表达载体，其特征在于所述筛选标记基因为带有专用启动子的新霉素磷酸转移酶Neomycin Phosphotransferase II基因nptll，该酶表现卡那霉素抗性。
6.根据权利要求1所述的蓝藻整合型穿梭表达载体，其特征在于所述蓝藻启动子 PpsbAi来自鱼腥藻7120光系统II的Dl蛋白质强启动子序列。
7.—种如权利要求1所述的蓝藻整合型穿梭表达载体的构建方法，其特征在于步骤如下(1)以鱼腥藻7120的基因组DNA为模板，用Fl弓丨物1和2进行PCR扩增，得到整合片段Fl片段；(2)以鱼腥藻7120的基因组DNA为模板，用F2弓丨物3和4进行PCR扩增，得到整合片段F2片段；(3)以鱼腥藻7120的基因组DNA为模板，用PpsbA1引物5和6进行PCR扩增，得到蓝藻启动子Ppsmi片段；(4)以pET30载体为模板，用nptll基因引物7和8进行PCR扩增，得到筛选标记基因 nptll片段；(5)载体pPpsbA1_F2的构建依次将整合片段F2、蓝藻启动子PpsbA1导入大肠杆菌受体细胞中，获得的克隆重组质粒PTF2和pTPpsbA1，用^(bal+BamHI双酶切，纯化回收后进行连接，将 F2插入到自连的pTPpsbA1载体中获得pPpsbA1_F2载体；(6)载体pFl-PpsbA1-F2的构建将Fl导入大肠杆菌受体细胞中，获得的克隆重组质粒 PTF1，用Xbal+PstI双酶切质粒pPpsbA1_F2和PTFl后，将pPpsbA1_F2连接到载体PTFl上，获得 pFl-PpsbA1-F2 载体。(7)载体pAnFP的构建将nptll导入大肠杆菌受体细胞中，获得的克隆重组质粒 pTnptll，用BamHI分别酶切质粒pFl-PpsbA1_F2和pTnptll，纯化回收后进行连接，将nptll 插入到pFl-PpsbA1-F2载体中获得pF l-PpsbA1-nptII-F2载体即pAnFP载体。
8.一种含有如权利要求1所述的蓝藻整合型穿梭表达载体的全序列，其特征在于序列见序列16。
全文摘要
本发明涉及一种蓝藻整合型穿梭表达载体及其构建方法，包含整合片段F1、蓝藻启动子PpsbAl、筛选标记基因nptII和整合片段F2，所述载体序列上游至下游的方向依次为整合片段F1、蓝藻启动子PpsbAl、筛选标记基因nptII和整合片段F2，具体序列见序列表。本发明中pAnFP整合型穿梭表达载体能够直接与蓝藻染色体DNA同源位点重组，将外源基因定位整合到染色体DNA上，可在蓝藻细胞中稳定表达，避免质粒复制丢失的问题。
文档编号C12N15/66GK102352374SQ201110319828
公开日2012年2月15日 申请日期2011年10月20日 优先权日2011年10月20日
发明者付静娟, 宋东辉, 朱义平, 杨国兰 申请人:天津科技大学