专利名称：一种mbr-FPGS高效表达载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于遗传工程中基因转录调控技术领域。具体涉及一种FPGS高效表达载体及构建方法和应用。
背景技术：
自从1948年Farber等首次报道甲氨蝶呤前体——氨蝶呤可以使急性白血病患儿得到缓解以来，以此为基础的化疗方案应运而生。甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)成为目前应用于白血病、淋巴瘤、头颈部肿瘤、骨肉瘤以及多种自身免疫性疾病最为广泛的一种抗代谢药物。研究表明MTX为叶酸同类物，主要借助于还原性叶酸载体(RFC)进入细胞， 进入细胞的MTX在叶酰多聚谷氨酸盐合成酶(FPGS)的作用下形成甲氨喋呤多聚谷氨酸盐 (MTXPG), MTX γ -谷氨酸水解酶(GGH)则起水解MTXPG的作用，两者的动态平衡保持MTXPG 的相对恒定。MTX及MTXPG共同和二氢叶酸竞争与二氢叶酸还原酶(DHFR)结合，从而使二氢叶酸不能被还原成四氢叶酸。因缺乏四氢叶酸，一碳单位形成减少，DNA、RNA合成受限， 快速增生的肿瘤细胞因缺乏复制所需的原料而逐渐死亡。决定MTX疗效的主要因素是细胞内MTX和MTXPG的浓度和停留时间。但是，MTX在抑制肿瘤细胞DNA合成的同时也抑制了正常细胞DNA合成，进而导致多种不良反应。大剂量MTX是治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)常用的方法，尤其是治疗T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)需要更大剂量，这是由于T-ALL 细胞中FPGS的表达水平很低，细胞内MTX活性代谢产物MTXPG的量很低，必须高剂量使用 MTX来补偿，而严重的毒副反应是制约疗效的关键因素。因此，增强肿瘤细胞内的FPGS表达水平，是提高肿瘤细胞对MTX的敏感性，减少MTX对正常细胞的毒性的关键环节。
发明内容
发明目的针对现在技术中的不足，本发明的目的是提供一种FPGS高效表达载体，以期实现通过转染该质粒后有效提高Jurkat细胞内FPGS的表达水平，并显著增强了细胞对MTX的敏感性，提高了 MTX对细胞的抑制率。本发明的另一目的是提供一种构建FPGS 高效表达载体的方法。本发明还有一目的是提供FPGS高效表达载体的应用。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为
一种FPGS高效表达载体，质粒载体为pEGFP-Cl，在pEGFP-Cl的CMV启动子上游含有 279bp长的mbr序列，在pEGFP-Cl的Hind III和EcoR I两个酶切位点之间含有FPGS的蛋白质编码区；其中，FPGS序列为说明书核苷酸和氨基酸序列表中的序列1，mbr序列为说明书核苷酸和氨基酸序列表中的序列2。一种构建FPGS高效表达载体的方法，包括如下步骤
(1)用Trizol法从Jurkat细胞中提取总RNA，经特异性逆转录引物将RNA逆转录成特异性cDNA，再经PCR扩增得到目的片段FPGS ；
特异性逆转录引物 FPGS-reverse 序列为 5，-GGCCAGGCAGCGCACACAAT-3’ ； PCR 引物为 FPGS-F :5，-CCCAAGCTTCTATGTCGCGGGCGCGGAGC-3，，FPGS-R :5， -CCGGAATTCCTACTGGGACAGTGCGGGCT-3，；
(2)用HindIII和EcoR I两个酶分别切取质粒pEGFP-Cl和片段FPGS，在"Γ4连接酶的作用下，将酶切后的FPGS片段克隆至pEGFP-Cl，制得FPGS-EGFP-C1质粒；采用酶切结合测序的方法鉴定FPGS-EGFP-C1质粒质量；
(3)以Jurkat细胞基因组DNA为模板，用PCR扩增Bcl2基因mbr序列，用AseI酶分别切取纯化后的mbr序列和FPGS-EGFP-C1质粒，在T4连接酶的作用下，连接切取后的两个片段，构建出含有mbr序列的mbr-FPGS高效表达载体，采用菌落PCR结合测序的方法鉴定 pEGFP-Cl质粒质量；其中，PCR扩增Bcl2基因mbr序列的引物为
Ase I -mbrF:5’ -AGTTATATTAATCTTTAGAGTTGCTTTACGTGGC-3’， Ase I -mbrR:5’ -AGTTATATTAATAGGATAGCAGCACAGGATTG-3’。mbr-FPGS高效表达载体在高效表达FPGS蛋白中的应用。mbr-FPGS高效表达载体在制备用于增强肿瘤细胞对化疗药物MTX敏感性的药物中的应用。mbr-FPGS高效表达载体在制备用于治疗人类白血病细胞对于化疗药物不敏感的药物中的应用。本发明应用分子克隆技术，构建了含有mbr-FPGS高效表达质粒，由于该质粒能够高表达FPGS蛋白，而MTX又为FPGS体内作用的底物，所以具有增强肿瘤细胞对化疗药物 MTX敏感性的作用，因此，该质粒可能应用于人类白血病细胞对于化疗药物不敏感的治疗。有益效果本发明所构建的mbr-FPGS高效表达质粒经WiesternBlot实验、MTT实验测得IC50结果表明mbr-FPGS高效表达质粒可以显著提高细胞内FPGS蛋白表达水平， mbr-FPGS高效表达质粒比FPGS对照质粒提高了 FPGS的表达水平30%(p<0. 05)。mbr-FPGS 高效表达质粒可以明显增强肿瘤细胞对MTX的敏感性，并具有一定的剂量-时间依赖性。 mbr-FPGS高效表达组细胞IC50值(72h)为2. 63ng/ml，约是对照组细胞IC50值(19. Olng/ ml)的1/7 (p<0. 05)。因此，mbr-FPGS高效表达载体在高效表达FPGS蛋白中、在制备用于增强肿瘤细胞对化疗药物MTX敏感性的药物中，以及在制备用于治疗人类白血病细胞对于化疗药物不敏感的药物中等方面均能够具有广泛的应用，能够产生很好的经济效益和社会效应。
图1是实施例1的FPGS-EGFP-C1质粒双酶切鉴定电泳图； 图2是实施例1的mbr-FPGS高效表达质粒PCR鉴定电泳图； 图3是载体mbr-FPGS高效表达质粒的示意图4是WesternBlot结果图5是MTT实验中加药后24h细胞MTT结果图6是MTT实验中加药后4 细胞MTT结果图7是MTT实验中加药后7 细胞MTT结果图8是以1 X l(T5mg/ml浓度的MTX刺激细胞，各时间梯度下的MTT结果；
图9是质粒pEGFP-Cl的结构示意图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释。以下实施例所使用的仪器设备为PTC_200型PCR仪(Bio-Rad公司，美国)，琼脂糖凝胶电泳设备(Bio-Rad公司，美国)，聚丙烯酰胺凝胶电泳设备(Bio-Rad公司，美国)， 全波长酶标仪(Bio-Rad公司，美国)，NanoDrop 1000型分光光度计(Thermo公司，美国)， Westernblot系统(Bio-Rad公司，美国)，GenePulser II电转仪(Bio-Rad公司，美国)；其他未列出的设备为常用设备。以下实施例所使用的细胞及试剂为Jurkat (人白血病T淋巴细胞)由美国洛杉矶希望城国立医学中心的Dr. Krontiris实验室馈赠； GIBCOi RPMI-1640 细胞培养基(InvitrogenLifeTechnologies 公司，美国)；小牛血清购自GIBCO公司；MTT购自Sigma公司(St. Louis, MO, USA) ；MTX(甲氨喋呤)标准品购自江苏省食品药品检验所，MTX用DMSO配制为100mg/ml溶液，4°C避光保存；anti-FPGS抗体 (SantaCruzBiotechnology 公司，美国)；anti- β -Actin 抗体(SigmaChemical 公司，美国)； HRP标记的抗兔、抗小鼠IgG (北京中杉)；质粒pEGFP-Cl由Dr. Krontiris实验室惠赠，其结构示意图如图9所示。其他未列出试剂为分析纯试剂。以下实施例的数据处理采用SPSS10. O软件进行统计学分析处理，p<0. 05具有统计学意义。实施例1
用Trizol法从Jurkat细胞中提取总RNA，步骤包括(1)取约IO6个Jurkat细胞，加入
1ml Trizol后用1 ml移液器吹打裂解细胞，然后将细胞裂解液转移至1. 5 ml离心管， 室温放置5 min。(2)加入0.2 ml氯仿，剧烈振摇15 s，室温静置2-3 min后，4°C、12，000 g离心15 min。(3)将上层水相转移至一个新的1.5 ml离心管中，加入0.5 ml异丙醇，混勻，室温静置10 min，4°C、12，000 g离心10 min。(4)弃上清，加入1 ml 75%的乙醇，清洗， 并将上述样品于4°C、7，500 g离心8 min。(5)小心弃上清，室温或真空干燥5-10 min，加入20 μ 1无RNA酶水溶解。(6)用紫外分光光度计进行RNA定量及纯度分析，结果显示， RNA浓度为800ng/ μ 1，Α260/Α280为2. O。(7)用0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性， 结果显示RNA结构完整。取Iyg RNA，用ABI逆转录试剂盒进行逆转录，特异性逆转录引物FPGS-reverse 的序列为 5’ -GGCCAGGCAGCGCACACAAT-3，。20μ1 反应体系如下2 μ 1 IOXRT Buffer,0. 8 μ 1 25XdNTP Mix(100 mM),
2μ 1 FPGS-reverse, 1 μ 1 MultiScribe Reverse transcriptase, 1 μ g RNA,乘Ij余为 Nuclease-free 水。反应程序为25°C，10 min ；37°C,120 min ；85°C,5 min;降温至 4°C，得到 cDNA。特异性CDNA再经PCR扩增得到目的FPGS片段(序列表中的序列1 )， 引物为 FPGS-F :5，-CCCAAGCTTCTATGTCGCGGGCGCGGAGC-3，，
FPGS-R 5 ‘ -CCGGAATTCCTACTGGGACAGTGCGGGCT-3 ‘。20 μ 1 的 PCR 体系为1 μ 模板(特异性 cDNA)，4 μ 1 ^ 5 X PrimeSTAR Buffer, 0. 4 μ 1 的上游引物(2 μ mol/l)，0. 4 μ 的下游引物(2 μπιο1/1)，1·6μ 1 的 dNTP Mixture (各 2. 5mM)，0. 2 μ 1 的 I^rimeSTAR HS DNA Polymerase (2. 5U/μ 1)，剩余为 ddH20。PCR 反应条件为95°C 10 s，68°C 15s，72°C 2min，30个循环。经琼脂糖电泳验证条带大小正确，后经Axygen切胶纯化试剂盒纯化DNA片段， 回收FPGS片段备用。选取表达载体pEGFP-Cl上多克隆位点中Hind III、EcoR I两个酶切位点，将FPGS 片段克隆至PEGFP-Cl ；在T4连接酶的作用下，纯化的FPGS片段插入同样经双酶切的 PEGFP-Cl载体。重组质粒经Hind III、EcoR I双酶切鉴定，后经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，表明大小与预期值相符，阳性克隆送北京华大基因公司测序，结果表明序列正确。其中，20μ1 酶切体系为IygFPGS 片段或 pEGFP-Cl 质粒，2μ1 IOX Buffer M，1 μ 1 Hind III，1 μ 1 EcoR I，剩余为ddH20 ；酶切条件为37°C酶切2h。20 μ 1的连接体系为:4μ 1 片段(酶切后的FPGS片段)，1μ酶切后的pEGFP-Cl质粒载体，2 μ 1 10ΧΤ4 Buffer, 1 μ 1 Τ4连接酶，剩余为ddH20 ；连接条件为16°C连接过夜。以Jurkat细胞基因组DNA为模板，用Ase I -mbr引物对PCR扩增Bcl2基因mbr 序列(序列表中的序列2)，在T4连接酶的作用下，将纯化后的目的片段经Ase I酶切，与同样经Ase I酶切的FPGS-EGFP-C1表达质粒连接，构建出mbr_FPGS高效表达质粒，结构如图 3所示。mbr-FPGS高效表达质粒经菌液PCR鉴定及测序验证，结果表明序列正确，mbr菌液 PCR结果电泳图如图2所示。其中，Ase I -mbr引物对序列包括
Ase I -mbrF :5’ -AGTTATATTAATCTTTAGAGTTGCTTTACGTGGC-3’， Ase I -mbrR :5’ -AGTTATATTAATAGGATAGCAGCACAGGATTG-3’。菌液PCR鉴定引物序列如下
mbr-identify-F :5’ -AGTTATATTAATCTTTAGAGTTGCTTTACGTGGC-3’ ； mbr-identify-R :5’ -TATTGGCGTTACTATGGGAACAT-3，。20μ IPCR 体系为1 μ 1 菌液，2 μ 1 IOXPCR Buffer, 1 μ 1 上游引物(2 μ mol/ 1),1 μ 下游引物(2 μπιο1/1)，1·6μ 1 dNTP Mixture (各 2.5mM )，0· 1μ 1 Taq 酶(5U/ μ 1)，剩余为 ddH20。反应条件94°C 30 s，58°C 30s，72°C lmin，35 个循环。实施例2
人BCL2基因是Tsujimoto等1985年从伴有t (14，18)染色体易位的滤泡样B细胞淋巴瘤中克隆的原癌基因SetoM，JaegerU, HockettRD, Graningerff, Bennetts, GoldmanP, KorsmeyerSJAlternativepromotersandexons, somaticmutationandderegulationofthe Bcl-2-Igfusiongeneinlymphoma. EMB0J1988, 7 (1) : 123-131，其编码产物 BCL2 蛋白是调节细胞凋亡的关键因子HockenberyD，NunezG, MillimanC, SchreiberRD, KorsmeyerSJ Bcl-2isaninnermitochondrialmembraneproteinthatblocksprogrammedcelldeath. Naturel990, 348(6299) :334-336.，14号和18号染色体易位是与人类癌症相关的最常见的染色体易位方式。滤泡样淋巴瘤病人的淋巴瘤细胞中绝大多数的易位发生在BCL2基因的3，端非翻译区(3，-UTR)的主要断裂点区(majorbreakpointregion，mbr)。利用报告基因系统和基因定向打靶技术已证实，位于BCL2基因3’ UTR的mbr序列是一个正向调控元件，可显著增强BCL2表达水平，这一效应在人类T细胞性白血病细胞(Jurkat)中尤为显著，这与Jurkat细胞特异性地高表达核基质附着区结合蛋白SATBl密切相关ZhangJ， MaC, HanX, DurrinLK, SunY :The bcl-2 major breakpoint region (mbr) possesse stranscriptional regulatory function, Gene2006,379 127-131 ；MaC, ZhangJ, DurrinLK, LvJ, ZhuD, HanX, SunY :The BCL2 major breakpoint region (mbr) regulates
6geneexpression. 0ncogene2007, 26 (18) 2649-2657 。据此，选定 Jurkat 为研究 mbr 调节转录活性的理想细胞系。采用电转方法分别将实施例1制备的mbr-FPGS高效表达质粒、FPGS-EGFP-C1质粒、EGFP-Cl质粒转染Jurkat细胞，然后利用Westernblot检测细胞内FPGS蛋白表达水平，具体操作步骤为(1)将1 X IO7个Jurkat细胞重悬于350 μ 1不含抗生素的培养液中； (2)加入20ug质粒混勻，在室温下静置15min ； (3)将混合物转移至电转杯，选择参数250V， 975 μ F进行电击；(4)电击后室温下静置15min，转移至8ml不含抗生素的培养液中，37°C 培养48h，收获细胞。Westernblot 分析方法为
收获细胞，用预冷的PBS洗一次，加入预冷的三去污裂缓冲液(50 mmol/L Tris · HCl (ρΗ8· 0),150 mmol/L NaCl,0. 02% NaN3,0.1% SDS, 100 μ g/ml PMSF，1 μ g/ml Aprotinin, 0. 5%去氧胆酸钠)裂解，收集于离心管中，置冰上进一步裂解20min后，收集蛋白上清液用 BIO-RAD的蛋白定量检测试剂按照说明书的方法测定蛋白浓度，加入5XSDS凝胶加样缓冲液，煮沸5min。按照蛋白浓度进行加样，行10%SDS-PAGE，采用湿转法将蛋白转移至PVDF 膜上。将PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭，分别加入FPGS抗体(1 :300)和β -actin单抗(1 4000)，4°C摇床孵育过夜；用抗兔或抗鼠二抗(1:4000)于室温孵育Ih ；用ECL发光，胶片显色，分析结果。以β-actin为内参照。如图4所示，FPGS对照质粒及mbr-FPGS高效表达质粒都能够表达EGFP-FPGS融合蛋白，其中mbr-FPGS高效表达质粒比FPGS对照质粒提高了 FPGS的表达水平30%(p<0. 05)。实施例3
利用MTT法检测MTX半数抑制浓度(IC50)，方法为收集对数生长期的Jurkat细胞，接种于96孔板。参照临床药物MTX血浆峰值浓度配制成5个药物浓度梯度，浓度为 2Xl(T6mg/ml、lXl(rtig/ml、5Xl(rtig/ml、2· 5X l(T4mg/ml、l. 25Xl(T3mg/ml ；以含有 10% 小牛血清的RPMI-1640培养液溶解。Jurkat细胞每孔接种10000个，加入不同浓度的MTX， 每个浓度设3个复孔，培养Mh、36h、48h、60h、72h。加入5mg/mlMTT10ul，孵育4h后加入 IOOul三联溶液(10%SDS，5%异丁醇，0. O12mol/LHC1,以蒸馏水溶解)，在全自动酶标仪上测定570nM波长的吸光度值(A)。应用SPSS10. 0软件计算IC50。细胞存活率=(试验孔A值 /对照孔A值)X 100%。在分别转染了 mbr-FPGS高效表达质粒及FPGS对照质粒后，Jurkat细胞对MTX的敏感性显著增加，如图5、6和图7所示，不同浓度MTX处理不同时间后对Jurkat细胞均有增殖抑制作用，图8为以1 X l(T5mg/ml浓度的MTX刺激细胞，MTX对Jurkat细胞的抑制作用呈时间依赖关系。mbr-FPGS高效表达组细胞IC50值(7 )为2. 63ng/ml，约是对照组细胞 IC50 值(19. 01ng/ml)的 1/7 (ρ<0·05)。
权利要求
1.一种mbr-FPGS高效表达载体，其特征在于质粒载体为pEGFP-Cl，在pEGFP-Cl的 CMV启动子上游含有279bp长的mbr序列，在pEGFP-Cl的Hind III和EcoR I两个酶切位点之间含有FPGS的蛋白质编码区；其中，FPGS序列为说明书核苷酸和氨基酸序列表的序列1， mbr序列为说明书核苷酸和氨基酸序列表的序列2。
2.—种构建权利要求1所述的mbr-FPGS高效表达载体的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)用Trizol法从Jurkat细胞中提取总RNA，经特异性逆转录引物将RNA逆转录成特异性cDNA，再经PCR扩增得到目的片段FPGS ；特异性逆转录引物FPGS-reverse序列为 5，-GGCCAGGCAGCGCACACAAT-3，；PCR 引物为 FPGS-F :5，-CCCAAGCTTCTATGTCGCGGGCGCGGAGC -3，，FPGS-R :5，-CCGGAATTCCTACTGGGACAGTGCGGGCT-3，；(2)用HindIII和EcoR I两个酶分别切取质粒pEGFP-Cl和片段FPGS，在"Γ4连接酶的作用下，将酶切后的片段FPGS克隆至pEGFP-Cl，制得FPGS-EGFP-C1质粒；采用酶切结合测序的方法鉴定FPGS-EGFP-C1质粒质量；(3)以Jurkat细胞基因组DNA为模板，用PCR扩增Bcl2基因mbr序列，用AseI酶分别切取纯化后的mbr序列和FPGS-EGFP-C1质粒，在T4连接酶的作用下，连接切取后的两个片段，构建出含有mbr序列的mbr-FPGS高效表达载体，采用菌落PCR结合测序的方法鉴定 mbr-FPGS高效表达质粒质量；其中，PCR扩增Bcl2基因mbr序列的引物为Ase I _mbrF:5’ -AGTTATATTAATCTTTAGAGTTGCTTTACGTGGC-3‘,Ase I -mbrR5，-AGTTATATTAATAGGATAGCAGCAC AGGATTG-3’。
3.权利要求1所述的mbr-FPGS高效表达载体在高效表达FPGS蛋白中的应用。
4.权利要求1所述的mbr-FPGS高效表达载体在制备用于增强肿瘤细胞对化疗药物 MTX敏感性的药物中的应用。
5.权利要求1所述的mbr-FPGS高效表达载体在制备用于治疗人类白血病细胞对于化疗药物不敏感的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种mbr-FPGS高效表达载体，质粒载体为pEGFP-C1，在pEGFP-C1的CMV启动子上游含有279bp长的mbr序列，在pEGFP-C1的HindⅢ和EcoRⅠ两个酶切位点之间含有FPGS的蛋白质编码区；其中，mbr序列如序列表2所示。所构建的mbr-FPGS高效表达质粒经WesternBlot实验、MTT实验测得IC50结果表明mbr-FPGS高效表达质粒比FPGS对照质粒提高了FPGS的表达水平30%(p<0.05)，mbr-FPGS高效表达质粒可以明显增强肿瘤细胞对MTX的敏感性，并具有一定的剂量-时间依赖性，mbr-FPGS高效表达组细胞IC50值(72h)为2.63ng/ml，约是对照组细胞IC50值(19.01ng/ml)的1/7(p<0.05)。
文档编号A61P35/02GK102337297SQ20111032161
公开日2012年2月1日 申请日期2011年10月21日 优先权日2011年10月21日
发明者孙玉洁, 胡文佳, 韩晓 申请人:南京医科大学