专利名称：培养雨生红球藻及生产虾青素的方法
技术领域：
本发明涉及工业规模培养雨生红球藻的方法，本发明还涉及工业规模生产虾青素的方法。所述的雨生红球藻属于淡水藻类。
背景技术：
雨生红球藻又叫做湖生红球藻或湖生血球藻，属于团藻目，红球藻科。在1899年发现这种藻经常以一种血红色外壳的形式附着在水坛或靠海的周期性有水的浅水湾边上，这种藻的生命历程是经过一个红色的休眠阶段，之后是一个绿色的游动阶段，再之后又是一个红色的休眠阶段。1934年，Elliot从细胞形态学的角度补充了这种藻类的生长史的细节。在整个生命周期中出现四种典型的细胞形态小虫体、长有鞭毛的大虫体、没有运动能力的胶鞘体、 带有坚硬细胞壁的红色大细胞——红孢囊(Haematocysts)。在有充足营养的清洁环境中， 大虫体占主导地位；一旦环境恶化就会转化为叫胶鞘体，之后转化为具有抵抗力的红孢囊， 并开始积累虾青素。随后，当周围的环境又变得营养充足适宜的时候，红孢囊变成可运动的小虫体，这些小虫体长成胶鞘体或者大虫体。雨生红球藻中虾青素含量为1. 5% 3. 0%，被看作是天然虾青素的“浓缩品”。雨生红球藻对虾青素的积累速率和生产总量较其它绿藻高，而且雨生红球藻所含虾青素及其酯类的配比(约70%的单酯，25%的双酯及5%的单体)与水产养殖动物自身配比极为相似， 这是通过化学合成和利用红发夫酵母等提取的虾青素所不具备的。此外，雨生红球藻中虾青素的结构以3S-3’ S型为主，与鲑鱼等水产生物体内虾青素结构基本一致；而红发夫酵母中虾青素结构则为3R — 3’R型。当前，雨生红球藻被公认为自然界中生产天然虾青素的最好生物，因此，利用这种微藻提取虾青素无疑具有广阔的发展前景，已成为近年来国际上天然虾青素生产的研究热点。在与红球藻相关的文献中没有任何有毒性的报道。雨生红球藻于在2010年11月11日“中华人民共和国卫生部第17号公告”中获得“准生证”。从此在抗氧化剂行业，天然虾青素的生产及其研发将进入快车道，天然虾青素将对氧化应激类疾病，如糖尿病、痛风、高血压等的防治产生革命性的改变。与螺旋藻、小球藻等人类常用保健的微藻相比，雨生红球藻有着更加令人惊异的抗氧化作用，同时也有着更加高难度的养殖与保存技术。雨生红球藻这种淡水藻类不同于海藻，后者主要含有叶绿素a和叶绿素b，雨生红球藻细胞中含有的光合作用色素主要是叶绿素a和虾青素。雨生红球藻这种淡水藻类不同于海藻和其它淡水藻类的特征之一是其生活史由绿色和红色两个阶段组成。雨生红球藻这种淡水藻类不同于海藻和其它淡水藻类的另一个特征是在绿色阶段细胞内虾青素含量低，繁殖速度快，需光弱，不耐以上的高温；而在红色阶段虾青素含量高，繁殖慢，生长快，喜高光照，耐至36°C的相对高温。因此，雨生红球藻的培养比较困难，对温度和光照等培养条件要求十分苛刻。目前的科研和生产中大多采用的自然光照方法，很难做到精确控温。特别是在夏季和冬季，大量
3的能源被浪费于夏季的降温和冬季的加热升温。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种雨生红球藻生产方法，在有效节约能源的前提下，通过严格控制温度和光照等培养条件，使得雨生红球藻繁殖较快，以进一步提高生产效率，并得到更高的细胞浓度。本发明还提供一种利用雨生红球藻生产虾青素的方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下 雨生红球藻培养生产方法，其特征在于
培养过程在大型容器内进行，采用人工LED光源对雨生红球藻照光培养； 该LED光源发出的单色光的波长范围在450nm带宽30nm和640nm带宽30nm，优选 475nm和663nm ；同时使用两种上述不同波长的光源，总光照强度为30 μ E/m2. s 3000 μ E/ m2. s，优选500 2000 μ E/m2. s ；LED光源光照时间6 Mh/天，优选12- M h /天；
培养过程利用通气方式使细胞在培养液中保持悬浮，温度保持在1 5 2 8°C，优选 23-26 0C ； ρ H 保持在 6. 8 8. 5。利用雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于
第一步积累虾青素在容器中，采用人工LED光源对绿色藻液进行光照，积累虾青
素；
该LED光源发出的单色光的波长范围在450nm带宽30nm和640nm带宽30nm，优选475nm和663nm ；同时使用两种上述不同波长的光源，总光照强度为200 μ E/m2. s 30000 μ E/m2. s，优选 1000 μ E/m2. s 10000 μ E/m2. s ；
培养过程使细胞在培养液中保持悬浮，温度保持在28 36°C，优选30 33°C ； 第二步、采收红色红球藻培养到培养液中的细胞内充满了红色的虾青素，藻液呈深
红
色时，进行离心或沉降采收；
第三步、干燥将第二步采收的雨生红球藻在低于1 Q Q °C的温度下干燥至含水量低
于
10% ；
第四步、破壁用高压均剂法对细胞进行破壁处理； 第五步、提取虾青素用二氧化碳超临界萃取仪提取虾青素。本发明的积极效果在于雨生红球藻的繁殖时期适宜生长在弱光下。因此本发明采用发光二极管(LED)作光源，一方面可以连续M小时使细胞进行光合作用，积累营养物质，加速生长繁殖；另一方面避免了采用自然太阳光源带来的温控困难，节省了夏冬两季控温所消耗的大量能源，降低了生产成本和对环境的污染。同时根据光合作用色素对不同光质的需求特点，采用最有效的单色二极管光源，提高了能量利用率、生产效率、细胞浓度以及虾青素产率。
具体实施例方式下面结合附图
和实施例进一步说明本发明。本发明培养雨生红球藻的方法，包括下列步骤 培养过程在500升以上的大型容器内进行，第一步、反应器灭菌用化学或蒸汽法对反应器进行灭菌处理。第二步、选择培养基采用GBll培养基。第三步、培养基灭菌对培养基进行次氯酸化学灭菌或高温灭菌。化学灭菌后将培养基进行中和至PH6. 0-8. 5，高温灭菌后培养基冷却至以下。第四步、接种与培养将雨生红球藻绿色游动细胞接种到培养基中，通气培养。培养过程在保温容器中进行，采用人工LED光源进行雨生红球藻M小时不间断光照培养。也可以白天利用日光，夜间采用人工LED光源。所述人工LED光源由高亮度发光二极管提供，该LED光源发出的单色光的波长范围在450nm带宽30nm和640nm带宽30nm，优选的单色光的波长是475nm和663nm。同时使用两种上述不同波长的光源。总光照强度为30 μ E/m2. s 3000 μ E/m2. s，优选的光照强度范围是1000 μ E/m2. S。培养过程利用通气方式使细胞在培养液中保持悬浮，温度保持在1 5 2 8 °C， 优选的
温度范围是2346°C，ρ H保持在6. 8 8. 5。第五步、采收当细胞浓度达到80-120万个/ml，进行离心或沉降采收。第五步所采收的雨生红球藻为绿色藻液。与传统的培养方法相比较，本培养方法的突出特点在于 第一、经测算，明显节省了控温的能耗；
第二、培养周期较传统方法缩短了 50%以上；
第三、经生化分析，所得到的绿色藻液中雨生红球藻细胞浓度达到120万/ml，是传统方法的2-5倍。本发明生产虾青素的方法，包括下列步骤
第一步积累虾青素将采收的绿色藻液转入开放式跑道池进行虾青素积累培养。具体步骤是在容器中，采用人工LED光源对绿色藻液进行光照，积累虾青素；
该LED光源发出的单色光的波长范围在450nm带宽30nm和640nm带宽30nm，优选475nm和663nm。同时使用两种上述不同波长的光源，总光照强度为200 μ E/m2. s 30000 μ E/m2. s，优选 1000 μ E/m2. s 10000 μ E/m2. s。培养过程使细胞在培养液中保持悬浮，温度保持在28 36°C，最好是30 33°C， ρ H 7. 0 9. 0)。第二步、采收红色雨生红球藻培养到细胞内充满了红色的虾青素，藻液呈深红色时，进行离心或沉降采收。第三步、破壁用高压均剂法对细胞进行破壁处理。第四步、干燥将破壁后的雨生红球藻在低于1 Q O °C的温度下干燥至含水量低于 10% O第五步、提取虾青素用二氧化碳超临界萃取仪提取虾青素。本发明虾青素产率可达4500mg/m2. d，与传统方法相比较提高了一倍以上。
权利要求
1.雨生红球藻培养生产方法，其特征在于培养过程在大型容器内进行，采用人工LED光源对雨生红球藻照光培养； 该LED光源发出的单色光的波长范围在450nm带宽30nm和640nm带宽30nm ；同时使用两种上述不同波长的光源，总光照强度为30 μ E/m2. s 3000 μ E/m2. s ；LED光源光照时间 6 24h/天；培养过程利用通气方式使细胞在培养液中保持悬浮，温度保持在1 5 2 8 °C ； ρ H 保持在6. 8 8. 5。
2.如权利要求1所述的雨生红球藻培养生产方法，其特征在于LED单色光的波长分别是 475nm 和 663nm。
3.如权利要求1所述的雨生红球藻培养生产方法，其特征在于总光照强度是500 2000 μ E/m2. S。
4.如权利要求1所述的雨生红球藻培养生产方法，其特征在于培养温度范围是 23H
5.如权利要求1所述的雨生红球藻培养生产方法，其特征在于LED光源光照时间 12 24 h / 天。
6.利用雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于第一步积累虾青素在容器中，采用人工LED光源对绿色藻液进行光照，积累虾青素；该LED光源发出的单色光的波长范围在450nm带宽30nm和640nm带宽30nm ；同时使用两种上述不同波长的光源，总光照强度为200 μ E/m2. s 30000 μ E/m2. s ； 培养过程使细胞在培养液中保持悬浮，温度保持在观 36°C ； 第二步、采收红色红球藻培养到培养液中的细胞内充满了红色的虾青素，藻液呈深红色时，进行离心或沉降采收；第三步、干燥将第二步采收的雨生红球藻在低于1 Q Q °C的温度下干燥至含水量低于10% ；第四步、破壁用高压均剂法对细胞进行破壁处理； 第五步、提取虾青素用二氧化碳超临界萃取仪提取虾青素。
7.如权利要求6所述的利用雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于LED单色光的波长为475nm和663nm。
8.如权利要求6所述的利用雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于总光照强度范围是1000 μ E/m2. S 10000 μ E/m2. s。
9.如权利要求6所述的利用雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于培养过程温度保持在30 33°C。
全文摘要
本发明是一种雨生红球藻培养生产方法及进一步生产虾青素的方法，培养过程在大型容器内进行，采用人工LED光源对雨生红球藻照光培养；所述人工LED光源由高亮度发光二极管提供，该LED光源发出的单色光的波长范围在450nm带宽30nm和640nm带宽30nm；所用光照强度为30μE/m2.s～3000μE/m2.s；培养过程利用通气方式使细胞在培养液中保持悬浮，温度保持在15～28℃；pH保持在6.8～8.5。一方面积累了更多的营养物质，加速了生长繁殖；另一方面避免了采用自然太阳光源带来的温控困难，节省了夏冬两季控温所消耗的大量能源，降低了生产成本和对环境的污染。同时根据光合作用色素对不同光质的需求特点，采用最有效的单色二极管光源，提高了能量利用率、生产效率以及细胞浓度。
文档编号C12P23/00GK102337215SQ201110319768
公开日2012年2月1日 申请日期2011年10月20日 优先权日2011年10月20日
发明者邹宁, 陈勇 申请人:烟台华融生物科技有限公司