专利名称：一种用于检测锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的引物组、试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的引物组、试剂盒及二重RT-PCR检测方法。
背景技术：
锯缘青蟹肉质鲜美、营养丰富，是我国重要的水产经济动物，在广东、福建、海南、 浙江等省沿海地区养殖广泛。但是，随着养殖规模和密度的增加，病害日益严重。自2004 年春天以来，广东省各个地区的养殖锯缘青蟹不断发生死亡，给养殖者造成了巨大的经济损失，沉重的打击了该行业的发展。通过调查研究发现，锯缘青蟹呼肠孤病毒和锯缘青蟹双顺反子病毒是造成大规模死亡的主要原因，并且在发病的锯缘青蟹中这两种病毒常常都能同时检测到。到目前为止，对于病毒病还没有有效的治疗方法，防止病毒的传染和流行是能够采取的主要措施，早期快速诊断是减少损失的有效途径，因此，简便快速、特异性好、灵敏度高的诊断试剂盒及其检测方法对于疾病的预防意义重大。目前流行的多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR技术)是一种体外扩增特异DNA片段的技术，由于具有快速、敏感、特异性强等特点，近年来发展出了多重PCR检测技术可能够同时检测多种病原，提高工作效率，但尚未见用于同时检测锯缘青蟹呼肠孤病毒病和锯缘青蟹双顺反子病毒的二重RT-PCR的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的引物组，该引物组能够特异性的分别扩增这两种病毒的核酸序列，可以用于这两种病毒的检测。本发明的目的还在于提供一种含有上述引物组的锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒检测试剂盒，该试剂盒灵敏度高，特异性好，节省时间，可以同时对这两种病毒进行检测。本发明的最后一个目的在于提供一种利用上述试剂盒检测锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的二重RT-PCR方法，该方法简便快速，特异性好，灵敏度高。本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的
一种用于检测锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的引物组，包括锯缘青蟹呼肠孤病毒引物组和锯缘青蟹双顺反子病毒引物组，其中锯缘青蟹呼肠孤病毒引物组包括呼肠孤病毒正向引物ReoF和反向引物ReoR，锯缘青蟹双顺反子病毒引物组包括双顺反子病毒正向引物DicF和反向引物DicR，各引物具体如下 ReoF 5- ACTCATAGAGCAGTCATGGG-3 ReoR 5- ATATCGTCAGAATGTCGTTC-3 DicF 5- GGATACTATGGATGATGTTTC-3DicR 5- ACAAAATACCAGATAAAGCAA-3。本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的
一种含有上述引物组的锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒检测试剂盒，含有以下部
件
(1)A液用于RNA裂解，为Trizol液；
(2)B液用于RNA萃取，为氯仿；
(3)C液用于沉淀RNA，为异丙醇；
(4)D液用于洗涤RNA，为体积百分含量为70%的乙醇；
(5)E液用于溶解RNA，为内装DEPC水；
(6)F液RT反应液;
(7)G液=RT-PCR反应液，含有上述锯缘青蟹呼肠孤病毒引物组呼肠孤病毒正向引物 ReoF和反向引物ReoR以及锯缘青蟹双顺反子病毒引物组双顺反子病毒正向引物DicF和反向引物DicR;
(8)H液阳性对照，内装锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的阳性模板。在上述试剂盒中
所述的RT反应液包括Buffer、dNTP、DEPC_H20、随机引物、RNA酶抑制剂、二硫苏糖醇 DTT、反转录酶M-MLV RT。所述的RT-PCR反应液包括含mg2+的Buffer、dNTP、锯缘青蟹呼肠孤病毒引物组呼肠孤病毒正向引物ReoF、反向引物ReoR、锯缘青蟹双顺反子病毒引物组双顺反子病毒正向引物DicF、反向引物DicR和Taq酶。其中呼肠孤病毒引物组和双顺反子病毒引物组的摩尔比优选为1-5:1。在实际操作中，该试剂盒还可以包括盒子、泡沫板等，其中泡沫板的大小与盒子的底板的大小相同，可以装在盒子中，泡沫板上有不少于用于封装反应试剂小管数量的小孔， 用于封装反应试剂的小管对应置于相应的小孔中。本发明的最后一个目的是通过如下技术方案来实现的
利用上述试剂盒检测锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的二重RT-PCR方法，含以下步骤
(1)取待检样品置于A液中，冰浴勻浆后室温静置，得勻浆液；
(2)在上述勻浆液中加入B液，混勻后静置；
(3)离心，取上清液，加入等体积C液，静置后离心；
(4)弃上清液，用D液洗涤后，离心，得洗涤液；
(5)将洗涤液吹干，加入E液溶解，得到锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的RNA提取液；
(6)将锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的RNA提取液温育后，冷却；
(7)取冷却后RNA提取液，加入F液中，孵育并失活后，得到RT-PCR反应模板；
(8)取RT-PCR反应模板和阳性对照H液加入到G液中，混勻后离心，置于PCR仪器中；
(9)在PCR仪器中进行扩增反应；
(10)反应结束后加溴酚蓝混勻，经0.8%琼脂糖凝胶电泳20-30分钟后于紫外仪上观察，若在与阳性对照相同的位置同时出现两条明亮的反应条带，则为两种病毒阳性，说明待测样品含两种病毒，其中呼肠孤病毒和双顺反子病毒带的位置分别为304 bp和404bp ；若只在304 bp处出现一条带，则为呼肠孤病毒阳性；若只在404bp处出现一条带，则为双顺反子病毒阳性；否则为阴性。在上述步骤中
步骤(1)中待检样品与A液的质量体积比为0. 05-0. Ig 0. 5-lmL ；步骤O)中勻浆液与B液的体积比为1-10 :1 ；步骤⑶中上清液与C液的体积比为1 :1。步骤(3)和步骤中离心时的温度为3_5°C，离心机的转速为7000-120001·/ min，离心时间为5-15min ；步骤(8)中离心时离心机的转速为500_1500r/min，离心时间为 5-15s，步骤(6)中温育时的温度为65°C，时间为5-lOmin。步骤(7)中RNA提取液与F液的体积比为1:3-5，步骤(7)中孵育时的温度为 35-38°C,孵育时间为lh，然后95°C孵育失活5-lOmin。步骤(9)中扩增反应按下列条件进行首先95°C 5min，再94°C 30s,55°C 30s, 72°C Imin 共 30 个循环，再 72°C IOmin, 10°C 保存。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明根据从患病锯缘青蟹中分离到的呼肠孤病毒和双顺反子病毒的RNA序列，设计了两对引物，建立了反转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)体系，并在此基础上进行了优化，建立了两种病毒同时定性检测方法，此方法简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于锯缘青蟹养殖过程中不同时期的病毒跟踪检测，也可用于环境监测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。
图ι是具体实施例3中检测的感染锯缘青蟹呼肠孤病毒(Reo)和双顺反子病毒(Die) 的锯缘青蟹鳃组织样品的PCR检测结果；其中M =DNA分子量标准；N 阴性对照；P 阳性对照；Lane 1 检测样品(Reo和Dic阳性)；Lane 2 检测样品(Reo阳性)；Lane 3 检测样品 (Die阳性)；
图2是实施例3中PCR扩增条件。
具体实施例方式实施例1
本实施例提供的用于检测锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的引物组，包括锯缘青蟹呼肠孤病毒引物组和双顺反子病毒引物组，其中锯缘青蟹呼肠孤病毒引物组包括呼肠孤病毒正向引物ReoF和反向引物ReoR，锯缘青蟹双顺反子病毒引物组包括双顺反子病毒正向引物DicF和反向引物DicR，各个引物具体如下 ReoF 5- ACTCATAGAGCAGTCATGGG-3 ReoR 5- ATATCGTCAGAATGTCGTTC-3 DicF 5- GGATACTATGGATGATGTTTC-3 DicR 5- ACAAAATACCAGATAAAGCAA-3。实施例2
本实施例提供的含有上述引物组的锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒检测试剂盒， 该试剂盒由以下各部分构成(10样份)(1).RNA提取液(A液)，2管，5mL管，内装Trizol液，用作裂解液；
(2).B液，1管，内装氯仿(也可自备)，共2 mL，用于萃取RNA;
(3).C液，1管，内装异丙醇(也可自备)，共5mL，用于沉淀RNA ；
(4).D液，1管，内装体积百分含量为70%的乙醇(也可自备)，共10mL，用于洗涤RNA ；
(5).E液，1管，ImL/管，内装DEPC (焦碳酸二乙酯)水，用于溶解RNA ；
(6).RT反应液(F液)，1管，0. ImL/管，内装RT反应液，RT反应液包括缓冲液Buffer、 三磷酸脱氧核糖核苷dNTP、DEPC-H20、随机引物(含6个核苷酸)、RNA酶抑制剂、反转录酶 M-MLV (RT)；
(7).PCR反应液(G液)，1管，0. 211117管，内装2乂的PCR反应液，包括Buffer(含mg2+)、 dNTP、锯缘青蟹呼肠孤病毒引物组呼肠孤病毒正向引物ReoF、反向引物ReoR、锯缘青蟹双顺反子病毒引物组双顺反子病毒正向引物DicF、反向引物DicR、ddH20和Taq酶；
(8).阳性对照(H液)，1管，20μ L/管，内装锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的阳性模板。 该试剂盒中的两种病毒的两对引物的DNA序列如下 呼肠孤病毒引物
正向引物 ReoF 为5- ACTCATAGAGCAGTCATGGG-3， 反向引物 ReoR 为5- ATATCGTCAGAATGTCGTTC-3 ； 双顺反子病毒引物
正向引物 DicF 为5- GGATACTATGGATGATGTTTC-3, 反向引物 DicR 为5- ACAAAATACCAGATAAAGCAA-3 RT反应液体系(IOyL体系)如下 5XBuffer2μ L
dNTP1 μ L
DEPC-H2O3· 3 μ L
随机引物IyL
RNA酶抑制剂0. 2 μ L
反转录酶 M-MLV (RT)0. 5 μ L
RT-PCR反应液体系(20 μ L体系)如下
IOXBuffer C^mg2+)2μ LdNTP0. 2μ L正向引物F0. 2μ L反向引物R0. 2μ L(MH2O15. 2μ LiTaq 酶0. 2 μ Lo其中正向引物F指呼肠孤病毒和双顺反子病毒正向引物，反应引物R指呼肠孤病毒和双顺反子病毒反向引物R，两种病毒的摩尔比最好为1 1，其它比例也可以。本发明的试剂盒里还可以包括一个泡沫板以及盒体，该泡沫板的设计可以为其大小与本发明试剂盒的底面相同，泡沫板上有不少于试剂盒中所装试剂小管数量的小孔， 这样试剂盒中所用试剂分装成的小管可以分别对应放置于这些小孔中，从而使得试剂都能处于小管的下部，方便取用和吸取，也可以使取用时残留在管壁上的液体自动回到管底，节约试剂。具体在本实施例中，长方体盒子的尺寸可以为8. 5 X 5. 8 X 6. 2cm3,泡沫板的大小与长方体盒子的底面相同，高2. 2 cm，有四排孔，第一排四个孔，孔径1.3 cm，第二排五个孔，孔径1.0 cm，第三、四排分别六个孔，孔径0.6 cm。上述各小管分别对应放置于泡沫板的孔内，装于长方体盒子中。实施例3
本实施例提供的锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的二重RT-PCR检测方法采用实施例1中的引物组和实施例2中的试剂盒，具体包括以下步骤
(1).取分别可能感染呼肠孤病毒、双顺反子病毒或者同时感染两种病毒以及未被这两种病毒感染的患病锯缘青蟹各1只，用无菌操作方法，分别取各蟹的鳃组织0. Ig加ImL A 液，于勻浆器中冰浴勻浆，室温静置3 5min，其中各蟹的鳃组织的用量可以为0. 05-0. Ig的范围内均可，A液用量在0. 5-lmL范围内均可；
(2).在上述勻浆液中加入200μ L B液，上下颠倒混勻，静置5min，其中B液用量在 100-200 μ L范围内均可；
(3).4 °C下，12000r/min离心5_15min，其中离心在温度为3-5 °C，转速为 1000(Tl2000r/min，时间为5_15min范围内均可，其它适宜条件也可以；
(4).取400μ L上清，加入等体积C液，轻轻晃动，静置5-15min，其中上清为 200-400 μ L范围内均可；
(5).4 °C下，12000r/min离心10_20min，其中离心在温度为3-5 °C，转速为 1000(Tl2000r/min，时间为5-15min范围内均可，为优选范围，其它适宜条件也可以；
(6).弃上清，用ImL预冷的D液洗涤2次，4°C下7500r/min离心5_10min；
(7).空气干燥或在超净工作台上吹干，加50yLE液溶解(若不能完全溶解可于 55-60°C放置IOmin)，得到的RNA提取液可于_20°C或_70°C保存；
(8).将RNA提取液在65°C预热5-10min；
(9).取2μL预热的RNA提取液，加入到8yL F液中，37°C下孵育Ih ；然后95°C孵育 5-10min使失活，得到PCR反应模板；
(10).分别取2μ LPCR反应模板和阳性对照H液各加入到18 μ LG液中，混勻后IOOOr/ min离心10秒，置于PCR仪上；
(11).按图2中的条件扩增 (12).反应结束后取5-10 μ L (扩增产物)加1_3 μ L溴酚蓝混勻，经0. 8% (质量/体积比g/mL)琼脂糖凝胶电泳20-30分钟(5V/cm)后于紫外仪上观察，其中在304bp 处出现明亮的反应条带(阳性对照相应位置)，为锯缘青蟹呼肠孤病毒阳性；在404bp处出现明亮的反应条带(阳性对照相应位置)，为锯缘青蟹双顺反子病毒阳性；在304和404bp处出现两条明亮的反应条带(阳性对照相应位置)，这两种病毒均阳性；未在304和/或404bp 处出现明亮反应条带的，为阴性(见图1)。以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。
权利要求
1.一种用于检测锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的引物组，其特征是包括锯缘青蟹呼肠孤病毒引物组和锯缘青蟹双顺反子病毒引物组，其中锯缘青蟹呼肠孤病毒引物组包括呼肠孤病毒正向引物ReoF和反向引物ReoR，锯缘青蟹双顺反子病毒引物组包括双顺反子病毒正向引物DicF和反向引物DicR，各引物具体如下ReoF 5- ACTCATAGAGCAGTCATGGG-3ReoR 5- ATATCGTCAGAATGTCGTTC-3DicF 5- GGATACTATGGATGATGTTTC-3DicR 5- ACAAAATACCAGATAAAGCAA-3。
2.一种含有权利要求1所述引物组的锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒检测试剂盒，其特征是含有以下部件(1)A液用于RNA裂解，为Trizol液；(2)B液用于RNA萃取，为氯仿；(3)C液用于沉淀RNA，为异丙醇；(4)D液用于洗涤RNA，为体积百分含量为70%的乙醇；(5)E液用于溶解RNA，为内装DEPC水；(6)F液RT反应液;(7)G液=RT-PCR反应液，含有权利要求1中所述的锯缘青蟹呼肠孤病毒引物组呼肠孤病毒正向引物ReoF和反向引物ReoR以及锯缘青蟹双顺反子病毒引物组双顺反子病毒正向引物DicF和反向引物DicR ；(8)H液阳性对照，内装锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的阳性模板。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征是所述的RT反应液包括Buffer、dNTP、 DEPC-H2O、随机引物、RNA酶抑制剂、二硫苏糖醇DTT、反转录酶M-MLV RT。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征是所述的RT-PCR反应液包括含mg2+的 Buffer、dNTP、锯缘青蟹呼肠孤病毒引物组呼肠孤病毒正向引物ReoF、反向引物ReoR、锯缘青蟹双顺反子病毒引物组双顺反子病毒正向引物DicF、反向引物DicR和Taq酶。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征是其中呼肠孤病毒引物组和双顺反子病毒引物组的摩尔比为1-5:1。
6.一种利用权利要求2-5任一项试剂盒检测锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的二重RT-PCR方法，其特征是含以下步骤(1)取待检样品置于A液中，冰浴勻浆后室温静置，得勻浆液；(2)在上述勻浆液中加入B液，混勻后静置；(3)离心，取上清液，加入等体积C液，静置后离心；(4)弃上清液，用D液洗涤后，离心，得洗涤液；(5)将洗涤液吹干，加入E液溶解，得到锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的RNA提取液；(6)将锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的RNA提取液温育后，冷却；(7)取冷却后RNA提取液，加入F液中，孵育并失活后，得到RT-PCR反应模板；(8)取RT-PCR反应模板和阳性对照H液加入到G液中，混勻后离心，置于PCR仪器中；(9)在PCR仪器中进行扩增反应；(10)反应结束后加溴酚蓝混勻，经0. 8%琼脂糖凝胶电泳20-30分钟后于紫外仪上观察，若在与阳性对照相同的位置同时出现两条明亮的反应条带，则为两种病毒阳性，说明待测样品含两种病毒，其中呼肠孤病毒和双顺反子病毒带的位置分别为304 bp和404bp ；若只在304 bp处出现一条带，则为呼肠孤病毒阳性；若只在404bp处出现一条带，则为双顺反子病毒阳性；否则为阴性。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征是步骤(1)中待检样品与A液的质量体积比为0. 05-0. Ig 0. 5-lmL ；步骤(2)中勻浆液与B液的体积比为1-10 1 ；步骤(3)中上清液与C液的体积比为1 :1。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征是步骤C3)和步骤中离心时的温度为 3-5°C，离心机的转速为7000-12000r/min，离心时间为5_15min ；步骤(8)中离心时离心机的转速为500-1500r/min，离心时间为5_15s，步骤(6)中温育时的温度为65°C，时间为 5-10mino
9.根据权利要求6所述的方法，其特征是步骤(7)中RNA提取液与F液的体积比为 1:3-5，步骤(7)中孵育时的温度为35-38°C，孵育时间为lh，然后95°C孵育失活5-lOmin。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征是步骤(9)中扩增反应按下列条件进行首先 95°C 5min，再 94°C 30s, 55°C 30s, 72°C Imin 共 30 个循环，再 72°C IOmin, 10°C 保存。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒的引物组，包括呼肠孤病毒正向引物ReoF、呼肠孤病毒反向引物ReoR，双顺反子病毒正向引物DicF和双顺反子病毒反向引物DicR，各引物具体如下ReoF5-ACTCATAGAGCAGTCATGGG-3ReoR5-ATATCGTCAGAATGTCGTTC-3DicF5-GGATACTATGGATGATGTTTC-3DicR5-ACAAAATACCAGATAAAGCAA-3。还公开了含有上述引物组的试剂盒及检测方法，该引物组、试剂盒和检测方法检测时间短、特异性强，检测灵敏度高，可同时检测锯缘青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒。
文档编号C12N15/11GK102443655SQ201110320470
公开日2012年5月9日 申请日期2011年10月20日 优先权日2011年10月20日
发明者冯娟, 吴开畅, 张迪, 苏友禄, 郭志勋 申请人:中国水产科学研究院南海水产研究所