专利名称：一种缺失型α地中海贫血-2基因及其检测试剂盒和检测方法
技术领域：
本发明涉及一种新的致病基因及其检测试剂盒，特别涉及一种缺失型α地中海贫血-2基因及其检测试剂盒。
背景技术：
地中海贫血(“地贫”)是一常见的常染色体隐性遗传病，是世界上最常见的人类单基因遗传性血液病之一，被世界卫生组织列为危害人类健康的6种常见病之一。该疾病是由于珠蛋白基因或其相关调控序列的缺失或点突变，导致珠蛋白肽链合成障碍，使得组成珠蛋白的α链和β链合成失去平衡而导致的溶血性贫血病。根据受累珠蛋白链的不同， 分为α地中海贫血与β地中海贫血。人的α类珠蛋白基因位于16ρ13. 3，长约401Λ，整个α类珠蛋白基因簇共由7个基因组成，包括4个可编码基因和3个假基因端粒-ξ-ψ ξ 1-Ψ α2_Ψ α 1-α2-α 1-θ-着丝粒。珠蛋白族基因表达受着严格的时空调控，其中ξ-珠蛋白基因在胚胎期表达，α2、α 和θ珠蛋白基因在胎儿和成人期表达。在我国大于80%的α地中海贫血是由于编码α -珠蛋白的α基因(α 2和/或 α 1)的大片段缺失引起，而这其中最为常见的又为」ΕΑ，- α 3 7与-α 4 2 3种类型，但却不仅限于此，一些新的缺失如--11·1、-- 、-^2·7、-^2·4、- 7·6也相继被发现。这些发现我国的α-地中海贫血基因谱特别广。这也提醒我们在地贫的基因筛查时需特别谨慎。目前对于α-地贫的诊断主要依靠基因检测，即检测到α-地贫基因而确诊。检测方法有多重Gap-PCR、多重连接酶依赖的探针扩增技术(MLPA)、实时荧光定量PCR、斑点杂交、直接基因测序等方法。要进行地贫的全面基因筛查，需要找到尽可能多的致病基因。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的α-地中海贫血2基因。本发明所采取的技术方案是
缺失型α地中海贫血-2基因-α 2_8，其序列如SEQ ID NO :1所示。一种检测试剂盒，含有可识别上述基因的试剂。优选的，检测试剂盒含有可特异性识别上述基因或其产物的试剂。缺失型α地中海贫血-2基因-α 28的检测方法，包括如下步骤
(1)提取待测患者外周血的基因组DNA；
(2)以基因组DNA为模板进行PCR，得到PCR产物；
(3)对PCR产物作琼脂糖凝胶电泳分析检测出扩增产物；
(4)对检测出阳性PCR产物进行直接基因测序，对测序结果与参考序列NG_000006.1进行比对,确定断裂位点(NG_000006. 1: g. 32486-35380 del 2895)。
优选的，PCR反应中的引物序列为PrimerF: GGACCTCCTGGTGCTTCTGCTTCCT (SEQ ID NO 2) ；Primer R :CTCCCTGTCTGCCACCCTCTTCT (SEQ ID NO :3)，PCR 产物直接测序的引物序列为SEQ_2R: GGGCCACCATGCCCGGCTGATT (SEQ ID NO :4)。本发明的有益效果是
本发明首次在人类基因组中分离并鉴定得到的α-地贫基因。该致病基因缺失了整个 α 2基因，可导致α -珠蛋白表达产物量降低。本发明的新基因为更为全面的进行地贫筛选创造了条件。使用本发明的检测试剂盒，可以检测出这一新型基因缺陷。
图1泳道2是样本患者的多重Gap-PCR检测中国人常见的3种缺失型α-地中海贫血基因结果，其中长度为ISOObp的条带是α-珠蛋白正常基因的扩增产物，长度为 2000bp、1600bp、1300bp的条带分别是-α 3_7、_ α 4_2、一SEA缺失型扩增产物；
图2是样本患者的MLPA检测结果，其中a 图中蓝色示正常α珠蛋白基因MLPA检测原始结果，红色示患者α珠蛋白基因MLPA检测原始结果。b 示将a中的患者MLPA结果量化后的结果，其中比值0. 73-1. 3则无相应基因序列缺失，比值0. 4-0. 7则存在相应序列的杂合缺失。比值为0. 0则存在相应序列的纯合缺失(其中探针9所检测序列即a中箭头所示片段缺失乃是由于在连接位点的SNP导致的假阳性)。c 示各探针在α珠蛋白基因上的相对位置(其中探针13，16同时可检测α 2与α 1基因序列)图中红色粗线条示新缺失片段的区域；
图3是样本患者的Gap-PCR产物测序结果图，a 示断裂位点附近序列；b 示正常 α-珠蛋白基因(α α)与新缺失型α-地贫基因-α28。
具体实施例方式样本来源
29岁疑似地贫女性患者外周血，患者既往无输血史，发育正常，无黄疸及肝脾肿大。贫血筛查示RBC (红细胞计数)5. 55X1012/1，Hb (血红蛋白)92g/l，MCV (红细胞平均体积) 54fl,MCH (平均血红蛋白含量)16. 5pg。血红蛋白电泳结果示HbA含量96. 96%，HbA2含量 1. 89%, HbH含量1. 15%。符合轻型HbH病表现。多重Gap-PCR 检测
采用亚能生物技术有限公司生产的α -地中海贫血基因诊断试剂盒进行多重Gap-PCR 检测，该诊断试剂盒可同时检测中国人群中常见的一SEA，- α 3_7与-α 4_2三种α -地贫基因。 按照说明书进行检测，其检测结果如图1所示，图中，其中长度为ISOObp的条带是α -珠蛋白正常基因的扩增产物，长度为200(^ 、160此？、130(^ 的条带分别是-(13_7、-(14_2、--皿缺失型扩增产物。结果显示该个体基因型为一SEA纯合子(一SEA/--SEA)，即缺失了 4个α基因，与患者表型不符。提示该个体可能携带本试剂盒不能检测到的α-地贫基因。MLPA 检测
用荷兰MRC-Holland公司的&ilsa MLPA P140-B3 HBA试剂盒进行检测。该试剂盒
权利要求
1.缺失型α地中海贫血-2基因-α2_8，其序列如SEQ ID Ν0:1所示。
2.一种检测试剂盒，含有可识别权利要求1所述基因的试剂。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒含有可特异性识别权利要求1所述基因或其产物的试剂。
4.权利要求1缺失型α地中海贫血-2基因-α 2 8的检测方法，包括如下步骤(1)提取待测患者外周血的基因组DNA；(2)以基因组DNA为模板进行PCR，得到PCR产物；(3)对PCR产物作琼脂糖凝胶电泳分析检测出扩增产物；(4)对检测出阳性PCR产物进行直接基因测序，对测序结果与参考序列NG_000006.1进行比对,确定断裂位点(NG_000006. 1: g. 32486-35380 del 2895)。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于PCR反应中的引物序列为=PrimerF: GGACCTCCTGGTGCTTCTGCTTCCT (SEQ ID NO :2);Primer R :CTCCCTGTCTGCCACCCTCTTCT (SEQ ID NO :3)，PCR 产物直接测序的引物序列为SEQJR: GGGCCACCATGCCCGGCTGATT (SEQ ID NO :4)。
全文摘要
本发明公开了缺失型α地中海贫血-2基因-α2.8，其序列如SEQIDNO1所示。检测试剂盒，含有可识别上述基因试剂。本发明首次在人类基因组中分离并鉴定得到的α-地贫基因。该致病基因缺失了整个α2基因，可导致α-珠蛋白表达产物量降低。本发明的新基因为更为全面的进行地贫筛选创造了条件。使用本发明的检测试剂盒，可以检测出这一新型基因缺陷。
文档编号C12N15/12GK102344925SQ20111032054
公开日2012年2月8日 申请日期2011年10月20日 优先权日2011年10月20日
发明者喻长顺, 曾征宇, 梁耀铭, 欧阳小峰, 胡朝晖, 莫宗平, 莫桂玲, 詹益鑫 申请人:昆明金域医学检验所有限公司