玉米抗白粉病基因快速鉴定的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明是借助于玉米测序全基因组序列，利用植物比较基因组学、遗传学、生物信 息学和候选基因策略等方法快速鉴定玉米白粉病基因，主要涉及到玉米全基因组序列的下 载，候选基因的鉴定，基因的比对，聚类等手段，进而鉴定出白粉病基因，属于植物生物技术 科学领域。
【背景技术】
[0002] 白粉病是一种世界性的植物病害，大部分植物均会感染此病。它发生在植物叶、嫩 茎、花柄及花蕾、花瓣等部位。初期为黄绿色不规则小斑，边缘不明显。不久病斑不断扩大， 表面生出白粉斑，最后该处长出无数黑点染病部位变成灰色，连片覆盖在其表面，边缘不清 晰，呈污白色或淡灰白色。受害严重时叶片皱缩变小，嫩梢扭曲畸形，从而影响植株生长发 育。
[0003] 近年来，由于杂交玉米大面积种植，以及连茬的增加，白粉病在我国一些夏秋玉米 种植地区发病严重，损失严重。目前在生产中，喷洒杀菌剂和推广抗病品种是主要的防治方 法，但长期使用药物会导致环境污染和病菌生理小种变异，因此推广抗病品种是最安全有 效的方法。而白粉病抗病基因的鉴定、定位和克隆，是培育抗病品种的重要基础。
[0004] MLO是植物特有的一类抗病基因，其编码一个7次跨膜的蛋白，可以直接引起抗病 反应，显性基因的表达产物可能是细胞程序化死亡和防御反应的负调控因子，当它处于隐 性时即可表现广谱的抗病性，具有极大的应用前景。目前，国外在玉米中已鉴定了 9个MLO 家族成员，但国内有关玉米白粉病菌种分化以及其抗性遗传规律的研究资料较少，目前尚 无文献报道，这严重阻碍了玉米白粉病研究的步伐。
[0005] 目前，克隆基因的基本策略一般分为两种，即正向遗传学途径和反向遗传学途径。 正向遗传学是以目标基因所表现的性状或基因表达产物为出发点，通过表型突变或鉴定产 物特征最终确定目标基因；反向遗传学则是以基因为出发点，通过基因功能验证的相关方 法最终确定目标基因。根据不同的克隆策略和实验技术可具体分为如下几种：定位克隆又 称图位克隆、序列克隆、功能克隆、表型克隆等。但通常情况下，通过上述技术获得的目标序 列都比较短，一般不容易直接得到基因全长序列。伴随着基因定位和植物基因组测序以及 生物信息学的发展，如何快速利用已经获得的测序结果筛选得到目标基因成为了目前研究 的热点。最近玉米基因组测序的完成为我们快速挖掘玉米白粉病基因提供了条件。本专利 介绍了以玉米全基因组序列为前提，结合遗传学、基因组学和生物信息学等知识，快速挖掘 白粉病基因的方法。
【发明内容】
[0006] 技术问题
[0007] 本发明的目的是提供一种通过结合植物比较基因组学、植物遗传学、基因组学和 生物信息学等知识，快速挖掘玉米抗白粉病基因。其结果一方面可用于玉米白粉病基因紧 密连锁分子标记的开发，进行分子标记辅助选择育种，另一方面也为其他作物白粉病基因 鉴定提供参考依据。
[0008] 技术方案
[0009] 主要原理：第一个植物抗白粉病基因（MLO)是从大麦中克隆的，研究发现此基因 是一类特殊的抗病基因，不同于先前克隆的大多数NBS(nucleotide-binding site)类型抗 病基因；随后，研究者相继从番茄、拟南芥、豌豆、辣椒、百脉根等植物中克隆了白粉病基因， 研究发现这些基因编码的都是MLO型抗病基因。随后，众多研究者通过多次试验证实MLO 型抗病基因已经成为植物特有的一类抗白粉病基因。进一步发现，植物MLO类型基因是一 个基因家族；而且对来源于不同物种的MLO基因家族进行系统发育关系分析发现，不同物 种中抗白粉病基因总是聚类一起，成为一类，这一类MLO基因都具有抗白粉病基因序列的 典型特征。玉米基因组测序的完成为挖掘白粉病基因提供了一条便利途径。因此，可以借 助于已经测序的玉米全基因组中MLO基因家族和已经克隆的MLO白粉病基因的系统发育关 系以及对于维持白粉病基因 MLO重要功能的氨基酸保守性来鉴定玉米白粉病基因。
[0010] 主要步骤如下：
[0011] 1)玉米全基因组序列的下载及其MLO型基因的采集
[0012] 首先从玉米测序基因组数据库（http ://www. phytozome. net/search. php)下 载玉米全基因组序列；使用"DNAT00LS"软件对获得的玉米全基因组氨基酸序列数据建 立数据库，然后用Pfam数掘库（蛋白家族数据库，http ://pfam. janelia. org/search/ sequence)中的隐马尔可夫模型（HMM)对MLO结构域的氨基酸序列与已建立的玉米全基因 组氨基酸序列数据库进行Blastp (E-value = 0. 001)序列比对，初步筛选出候选基因序列。 其次，利用已经公布的MLO型基因序列，对玉米基因组数据库进行BLAST比对，获得候选基 因序列。
[0013] 2)玉米MLO型基因家族的鉴定
[0014] 将上述结果中得到的同源核苷酸序列的候选基因，通过Pfam(E-valUe = 1.0)进 行分析，去除无'ML0'结构域的基因序列（图1)。再将候选抗病基因序列通过MEGA3. 1软 件提供的ClustalW工具（多序列比对程序）进行多序列比对，去除重复序列。
[0015] 3)通过植物MLO型基因的系统发育关系鉴定候选的玉米MLO型白粉病基因
[0016] 由于先前的研究已经证明，双子叶植物MLO型白粉病基因位于植物MLO基因系统 发育树同一区组，因此在系统发育关系研究中，我们把拟南芥的MLO型基因家族和一些其 他作物的MLO型抗白粉病基因和玉米MLO型基因一起聚类分析，以获得候选的玉米抗白粉 病基因（图2)。
[0017] 4)玉米白粉病基因与已知的植物MLO白粉病基因的比对
[0018] 利用Bi〇XM2. 6软件将玉米候选的MLO型白粉病基因和拟南芥、番茄、豌豆、大麦的 MLO白粉病基因的氨基酸序列转换成Fasta格式的文件，将这些文件导入Bi〇Edit7. 0软件， 运用此软件中Clustal软件进行多序列比对，揭示候选白粉病基因重要氨基酸残基及区域 的保守性。从而进一步鉴定玉米候选的白粉病基因（图3)。
[0019] 本发明的积极效果：
[0020] 1)缩短了玉米白粉病基因挖掘周期，有利于白粉病基因的快速鉴定。采用常规方 法（图位克隆、转座子标签等）挖掘抗白粉病基因不仅耗时耗力、效率低，且难以成功。本 发明基于植物比较基因组学、遗传学、生物信息学方法快速挖掘玉米白粉病基因，不仅可以 缩短时间，还可以提高白粉病基因鉴定效率。
[0021] 2)玉米（Zea mays)是全世界粮食作物之一。由于玉米遗传基础狭窄，种质资源多 样性低，因此通过常规的分子标记（RAPD、ISSR、SSR、AFLP等）鉴定玉米白粉病基因比较困 难。通过鉴定的白粉病基因开发相应的共分离功能性标记（SNP、SCAR等），可以快速的用 于抗病基因的分子标记辅助选择，进行多抗性育种材料的创制，可以缩短育种年限，提高育 种效率。
[0022] 3)为阐述玉米抗白粉病分子机制奠定了基础。玉米抗白粉病基因的鉴定，通过转 基因技术、RNAi、病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS)技术等研究 抗白粉病的分子机制提供了基因资源，有利于快速阐述玉米抗白粉病的作用机理。
【附图说明】
[0023] 图1玉米MLO基因的鉴定；
[0024] 本图显示的是15个MLO型基因鉴定结果，每一个基因都含有一个'ML0'保守结构 域。
[0025] 图2植物MLO基因家族的系统发育关系分析及其玉米MLO型白粉病基因的鉴定；
[0026] 拟南芥是植物科学研究的模式植物，在构建系统发育树中，拟南芥的15个MLO型 基因（其中3个基因是白粉病基因：AtML002, AtML006和AtML012)、番茄抗白粉病基因 (SMLO)、大麦白粉病基因（HvMLO和HvML002)和豌豆的白粉病基因（PsMLO)被选择用来和 玉米MLO型基因聚类分析。共鉴定出1个玉米MLO型白粉病基因。图中斜体标记的基因就 是玉米白粉病基因。
[0027] 图3玉米MLO型白粉病基因的比对分析；
[0028] 1个玉米白粉病基因与大麦（HvMLO)、番茄（SlMLO)、豌豆（PsMLO)、拟南芥白粉病 基因（AtML002, AtML006和AtML012)进行比对，鉴定白粉菌侵染有重要作用的氨基酸残基 和区域的保守型。图中TM1-TM7表示玉米MLO型白粉病基因的7个转模区域；黑色圆点表 示白粉菌侵染重要的氨基酸残基；CaMBD表示钙调蛋白结合区；I和II表示对白粉菌侵染 重要的氨基酸区域。
【具体实施方式】
[0029] 抗病基因的鉴定在作物抗病遗传理论研究和抗病品种选育中具有重要的作用。本 方法可以快速鉴定出玉米白粉病基因。具体实施过程如下：
[0030] 1)玉米MLO型基因的采集
[0031] 为了获得玉米全部的MLO型基因家族成员，我们首先以拟南芥的MLO型基因，番 茄、豌豆、辣椒、蔷薇、辣椒、百脉根的抗白粉病MLO基因序列构建HMM模型，从玉米基因组序 列中检索MLO型基因；其次以不同作物中已经发表的MLO基因序列作为靶序列（来自DFCI 数据库：TC171015, TC267529, DFCI :TC327983, TC289653, TC312087, TC132500, TC133436， TC317623, TC317025, TC315947, TC325903, TC315944, TC315912, TC322759, TC322059, TC330654, TC282713, TC293173, TC281861, TC283253, TC283383, TC285032, TC290021, TC302716, TC283487, TC282866, TC283441，TC281428, TC285118, TC285090 ;来自 GenBank 数 据库：AY967408, AF384145, AF384144, AY029312-AY029315, AY029317-AY029319, Z95352， AF369563-AF369565, AF369567, AF369569-AF36