基于dna条形码的鉴别金钱白花蛇的引物及pcr-rflp方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于中药品种鉴定【技术领域】，提出一种鉴别金钱白花蛇及其伪品的聚合酶链反应-限制性酶切图谱分子鉴定方法，用限制性内切酶Spe?I和BstE?II分别识别并切割金钱白花蛇的特征DNA碱基序列，将金钱白花蛇DNA条形码COI片段酶切成三条片段。本发明鉴定过程：样品DNA提取；引物DK1-CO1、DK1-CO2进行PCR扩增；纯化PCR产物；限制性内切酶Spe?I和BstE?II消化PCR产物；琼脂糖凝胶电泳分析结果；通过与金钱白花蛇PCR-RFLP特征结果比较，判断供试品是否为金钱白花蛇。本发明还提出用于所述鉴别方法的试剂盒。本发明方法准确、快速、可靠，可广泛应用于中药材鉴定。
【专利说明】基于DNA条形码的鉴别金钱白花蛇的引物及PCR-RFLP方法和试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及中药的品种鉴定【技术领域】，具体涉及一种鉴别金钱白花蛇及其伪品的引物及PCR-RFLP方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002]金钱白花蛇为眼镜蛇科动物银环蛇(Bungarus multicinctus)的幼蛇干燥体。气微腥，味微咸。具有祛风、通络、止痉的功效。用于风湿顽痹、麻木拘挛、中风口眼斜、半身不遂、抽搐、破伤风、麻风、疥癣等。金钱白花蛇市场称作小白花蛇，是一味常用名贵中药材，但随着生态环境的恶化及金钱白花蛇产量较低，导致其药材资源急剧减少。由于疗效显著、药源紧张，金钱白花蛇价格节节攀升，并使得金钱白花蛇市场充斥各种伪品，常见伪品有赤链蛇、金环蛇、铅色水蛇等。并难以根据形态学上的特征进行单一鉴别，使得品种的鉴定越来越困难。因此寻找快速、准确的方法鉴别金钱白花蛇是药材鉴定中的一个重要问题。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种准确鉴别金钱白花蛇的PCR-RFLP分子鉴定方法，包括金钱白花蛇的特征DNA碱基序列、一对PCR引物、限制性内切酶酶切位点、鉴定方法及其试剂盒。
[0004]本发明基于DNA 条形码。DNA条形码(DNA barcoding)是利用一个或少数几个DNA片段对物种进行识别和鉴定的一项新技术。2003年Herbert等选取线粒体细胞色素C氧化酶亚基I的一段序列在动物界不同分类水平上(门、目、种)进行分析，发现无论在哪个分类水平上该基因都具有良好的识别能力，从而提出建立以一段长度为650bp的COI基因序列为基础的条形码识别方法。随后的研究表明，COI (线粒体细胞色素氧化酶亚基I)基因序列种内变异小，种间变异大，且其DNA序列本身很少存在插入和缺失，对动物物种的识别和鉴定切实可行，被公认为动物界中标准的DNA条形码基因。
[0005]本发明的技术方案如下:首先从各样本中提取总DNA，利用引物DKl-COl及DK1-C02，用PCR方法扩增COI片段，经纯化后，对该片段进行DNA序列测定，将所得序列登录到Genbank系统获得登录号，并建立各样品的DNA序列数据库；在比较数据库DNA序列的基础上，得到金钱白花蛇的特征DNA碱基序列:5’ -ACTAGT-3’ (位于COI序列第121位至126位)，该序列可被限制性内切酶Spe I识别并切割；然而该特征DNA序列并非金钱白花蛇所特有，在乌梢蛇的COI序列中也存在该特征序列，为了有效区分金钱白花蛇与乌梢蛇，本发明增加选定金钱白花蛇的另一特征DNA序列5’ -GGTAACC-3’ (位于COI序列第353位至359位)，在乌梢蛇的相同位点出现的是5’ -GGAAACC-3’，仅有金钱白花蛇的特征序列可被限制性内切酶BstE II识别并切割；序列5’ -ACTAGT-3’与序列5’ -GGTAACC-3’共同组成金钱白花蛇的特征DNA序列，利用能够识别并切割金钱白花蛇特征DNA序列的限制性内切酶Spe I和BstE II共同对纯化后的PCR产物进行消化，产生琼脂糖凝胶电泳的特征图谱，通过分析上述双酶切图谱差异，达到快速、准确鉴别金钱白花蛇的目的。
[0006]对需要鉴定的金钱白花蛇样品，提取其DNA，在给定的PCR条件下，用一对引物(DK1-C0UDK1-C02)扩增，供试品能够扩增出一段DNA片段；用限制性内切酶Spe I及BstEII对供试品的PCR扩增产物进行双酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳检测，金钱白花蛇会出现分子量为121bp、232bp和305bp的三条DNA片段，而其它种类的蛇不出现上述三条片段或少于三条片段。当供试品经本法进行PCR扩增，并对PCR产物进行限制性内切酶双酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳观察DNA片段的大小，便可准确鉴定供试品是否为金钱白花蛇。
[0007]本发明提出的用于鉴别金钱白花蛇PCR-RFLP方法的PCR扩增引物，其引物序列为:
[0008]DKl-COl:5，-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3，；
[0009]DK1-C02:5’ -CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’。
[0010]本发明用于鉴别金钱白花蛇PCR-RFLP分子鉴定方法，利用能够分别识别金钱白花蛇特征DNA碱基序列5，-ACTAGT-3，和5，-GGTAACC-3，的限制性内切酶Spe I和BstEII，对纯化后的PCR产物进行消化，产生琼脂糖凝胶电泳的特征图谱；具体步骤如下:
[0011]I)提取待测样品DNA ；
[0012]2)扩增DNA片段，PCR反应参数包括:93°C预变性5min，55°C 2min ;93°C变性30s，55°C复性45s，70。。延伸45s, 35个循环;70°C延伸5min。所述引物DKl-COl和DK1-C02，其序列为:
[0013]DKl-COl:5’ -CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’ (SEQ ID N0.1)
[0014]DK1-C02:5’ -CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’ (SEQ ID N0.2)
[0015]3)纯化PCR产物，琼脂糖凝胶电泳分析；
[0016]4)纯化产物中加入限制性内切酶Spe I和BstE II进行双酶切，限制性内切酶SpeI酶切位点为:A~CTAGT ;限制性内切酶BstE II的酶切位点为:G~GTNACC ；
[0017]5)琼脂糖凝胶电泳分析；
[0018]6)鉴定结果的判断，若在所述电泳产物中检测到分子量为121bp、232bp和305bp的三个条带，则判断待测样品为金钱白花蛇；若在所述电泳产物中未出现上述三条片段或少于三条片段，则判断待测样品非金钱白花蛇。
[0019]本发明方法中，步骤I)和3)中，采用现有技术的试剂盒提取DNA及纯化PCR产物的方法，不需要配制任何试剂，使得操作时间大大缩短。
[0020]本发明还提出了一种用于金钱白花蛇PCR-RFLP鉴定的试剂盒，所述试剂盒包括:引物DKl-COl(1yM);引物DK1-C02 (10 μ M) ；2XTaq DNA聚合酶混合缓冲液，其包括:TaqDNA聚合酶(0.1U/ μ L)，四种脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dTTP、dCTP及dGTP各500 μ Μ)，Tris-HCl (20 μ Μ、ρΗ8.3)，KCl (100 μ Μ)，MgCl2 (3 μ Μ)等；Spe I 酶(1U/ μ L) ；BstE II 酶(?ου/μ L);酶切缓冲液；终止缓冲液；灭菌双蒸水。
[0021]综上所述，本发明解决了鉴定金钱白花蛇与其它品种蛇的难题，提供了鉴定所需的一对PCR引物、PCR反应条件、金钱白花蛇特征DNA碱基序列、两种限制性内切酶，鉴定方法及其试剂盒，构建了快速、便捷、准确鉴别金钱白花蛇的PCR-RFLP方法，对于保证金钱白花蛇的药材质量，打击金钱白花蛇伪品的市场行为具有重要的价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为金钱白花蛇及其混伪品扩增COI条形码序列PCR产物电泳结果:1.银环蛇
2.银环蛇3.银环蛇4.银环蛇5.金环蛇6.眼镜蛇7.赤链蛇8.赤链蛇9.百花锦蛇10.铅色水蛇11.赤链华游蛇12.尖吻蝮蛇13.黄链蛇14.乌梢蛇15.黄斑渔游蛇16.阴性对照(其它反应条件不变，以水替代模板DNA) ;MK.DNA分子量标准:从上到下依次为lOOObp、7OObp、500bp、400bp、300bp、200bp、10bp。
[0023]图2为金钱白花蛇及其混伪品COI条形码序列PCR产物酶切电泳结果:1.银环蛇
2.银环蛇3.银环蛇4.银环蛇5.金环蛇6.眼镜蛇7.赤链蛇8.赤链蛇9.百花锦蛇10.铅色水蛇11.赤链华游蛇12.尖吻蝮蛇13.黄链蛇14.乌梢蛇15.黄斑渔游蛇16.阴性对照(其它反应条件不变，以水替代模板DNA) ；MK.DNA分子量标准:从上到下依次为lOOObp、7 OObp、500bp、400bp、300bp、200bp、10bp。
[0024]图3为11份市售金钱白花蛇扩增COI条形码序列PCR产物电泳结果:D1_D11为市售药材I号到11号，12.阴性对照(其它反应条件不变，以水替代模板DNA) ；MK.DNA分子量标准:从上到下依次为 100bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、10bp。
[0025]图4为11份市售金钱白花蛇COI条形码序列PCR产物酶切电泳结果:D1_D11为市售药材I号到11号；MK.DNA分子量标准:从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
【具体实施方式】
[0026]结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
[0027]1、材料
[0028]15份金钱白花蛇及其混伪品原动物，主要采自广东省、江西省、湖南省、广西壮族自治区(表1)。商品金钱白花蛇购自广东省广州市各大药房及清平市场(表2)。全部样本均由华南濒危动物研究张亮所进行性状鉴定。
[0029]表1金钱白花蛇及其混伪品原动物样本
[0030]
【权利要求】
1.用于鉴别金钱白花蛇PCR-RFLP方法的PCR扩增引物，其特征在于，所述引物序列为:
DKl-COl:5，-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3，；
DK1-C02:5’ -CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’。
2.一种鉴别金钱白花蛇的PCR-RFLP方法，其特征在于，利用能够分别识别金钱白花蛇特征DNA碱基序列5’ -ACTAGT-3’和5’ -GGTAACC-3’的限制性内切酶Spe I和BstE II，对纯化后的PCR产物进行消化，产生琼脂糖凝胶电泳的特征图谱；所述鉴定方法包括如下步骤: 1)样品DNA的提取； 2)扩增DNA片段:利用权利要求1所述的引物进行聚合酶链反应，得到聚合酶链反应扩增产物，所述PCR反应参数包括:93°C预变性5min，55°C 2min ;93°C变性30s，55°C复性45s, 70°C延伸 45s, 35 个循环;70°C延伸 5min ； 3)琼脂糖凝胶电泳检测，纯化PCR产物； 4)在所述PCR纯化产物中加入限制性内切酶SpeI和BstE II进行双酶切，所述限制性内切酶Spe I的酶切位点为A'CTAGT ;所述限制性内切酶BstE II的酶切位点为G'GTNACC ； 5)琼脂糖凝胶电泳分 析； 6)鉴定结果的判断:如果在所述电泳产物中检测到分子量为121bp、232bp和305bp的三条片段，则待测样品为金钱白花蛇；如果不出现上述三条片段或少于上述三条片段，则待测样本不为金钱白花蛇。
3.一种用于金钱白花蛇PCR-RFLP鉴定的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:10μΜ引物DKl-COl ;10μΜ引物DK1-C02 ；2XTaq DNA聚合酶混合缓冲液，其包括:0.1U/μ L TaqDNA 聚合酶，dATP、dTTP、dCTP 及 dGTP 各 500 μ M, 20 μ MTris-HCl, ρΗ8.3，100 μ M KC1，3 μ MMgCl2 ； 1U/μ L Spe I酶；1U/μ L BstE II酶；酶切缓冲液；终止缓冲液；灭菌双蒸水。
【文档编号】C12Q1/68GK104164492SQ201410347830
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月21日 优先权日:2014年7月21日
【发明者】晁志, 李晓蕾, 曾伟萍 申请人:南方医科大学