基于dna条形码的鉴别赤链蛇的引物及pcr-rflp方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于中药品种鉴定【技术领域】，提出了一种鉴别赤链蛇的聚合酶链反应-限制性酶切图谱分子鉴定方法(PCR-RFLP)。本发明引物序列为：DK1-CO1：5’-CAA?CTA?ACC?ACA?AAG?ACA?TCG?G-3’，DK1-CO2：5’-CTT?CTG?GGT?GGC?CGA?AAA?ATC?A-3’；赤链蛇的特征DNA碱基序列为：5’-GTGCAC-3’；限制性内切酶APaL?I识别并切割该序列。鉴定过程：提取样本DNA；用引物DK1-CO1、DK1-CO2进行PCR扩增；用限制性内切酶APaL?I消化PCR产物；琼脂糖凝胶电泳分析结果；通过与赤链蛇PCR-RFLP特征结果相比较，判断待测样品是否为赤链蛇。本发明还提出用于所述鉴定方法的试剂盒。本发明鉴别准确、快速、可靠，有效地区分赤链蛇与其它蛇类。
【专利说明】基于DNA条形码的鉴别赤链蛇的引物及PCR-RFLP方法和试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于中药品种鉴定【技术领域】，具体涉及一种鉴别赤链蛇的引物及PCR-RFLP方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002]赤链蛇(Dinodon rufozonatum)为游蛇科链蛇属的爬行动物，具有抗炎、镇静催目民、抗惊厥之功效，用于风湿性关节炎、解毒敛疮、全身疼痛、慢性瘘管、溃疡、疥癣等。赤链蛇是一种常见的金钱白花蛇伪品。随着近年金钱白花蛇药材价格的上涨以及资源的逐渐减少，越来越多的赤链蛇被用来充作金钱白花蛇。目前，市场上金钱白花蛇商品的50%为赤链蛇来源的伪品，两者从形态学上的特征进行鉴定较为困难。寻找快速、准确方法鉴别赤链蛇，是金钱白花蛇药材鉴定中的一个重要问题。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种准确鉴别赤链蛇的PCR-RFLP分子鉴定方法，包括赤链蛇的特征DNA碱基序列、一对PCR引物、限制性内切酶酶切位点、鉴定方法及其试剂盒。
[0004]本发明基于DNA条形码。DNA条形码(DNA barcoding)是利用一个或少数几个DNA片段对物种进行识别和鉴定的一项新技术。2003年Herbert等选取线粒体细胞色素C氧化酶亚基I的一段序列在动物界不同分类水平上(门、目、种)进行分析，发现无论在哪个分类水平上该基因都具有良好的识别能力，从而提出建立以一段长度为650bp的COI基因序列为基础的条形码识别方法。随后的研究表明，COI (线粒体细胞色素氧化酶亚基I)基因序列种内变异小，种间变异大，且其DNA序列本身很少存在插入和缺失，对动物物种的识别和鉴定切实可行，被公认为动物界中标准的DNA条形码基因。
[0005]本发明的技术方案如下:首先从各样本中提取总DNA，利用引物DKl-COl及DK1-C02,用PCR方法扩增COI片段，经纯化后，对该片段进行DNA序列测定，将所得序列登录到Genbank系统获得登录号，并建立各样品的DNA序列数据库；在比较数据库DNA序列的基础上，得到赤链蛇的特征DNA碱基序列:5’ -GTGCAC-3’ (位于COI序列第362位至367位)，针对赤链蛇与其他蛇类DNA序列的差异，选择合适的DNA限制性内切酶ApaL I，通过分析聚合酶链反应产物的限制性酶切图谱差异，达到快速、准确鉴别赤链蛇的目的。
[0006]对需要鉴定的赤链蛇样品，提取其DNA，在给定的PCR条件下，用一对引物(DK1-C0UDK1-C02)扩增，供试品能够扩增出一段DNA片段；用限制性内切酶ApaL I对供试品的PCR扩增产物进行酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳检测，赤链蛇会出现分子量为362bp，296bp的两条DNA片段，而其它种类的蛇不出现上述两条带。当供试品经本法进行PCR扩增，并对PCR产物进行限制性内切酶酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳观察DNA片段的大小，便可准确鉴定供试品是否为赤链蛇。
[0007]本发明用于鉴别赤链蛇的PCR扩增引物，其序列为:
[0008]DKl-COl:5，-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3，；
[0009]DK1-C02:5’ -CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’。
[0010]本发明设计的用于鉴别赤链蛇PCR-RFLP分子鉴定方法，步骤如下:
[0011]I)提取待测样品DNA;
[0012]2)扩增DNA片段，PCR反应参数包括:93°C预变性5min，55°C 2min ;93°C变性30s，55°C复性45s，70。。延伸45s, 35个循环;70°C延伸5min。所述引物DKl-COl和DK1-C02，其序列为:
[0013]DKl-COl:5’ -CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’ (SEQ ID N0.1)
[0014]DK1-C02:5’ -CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’ (SEQ ID N0.2)
[0015]3)纯化PCR产物，琼脂糖凝胶电泳分析；
[0016]4)PCR扩增产物中加入限制性内切酶APaL I进行酶切，限制性内切酶APaL I酶切位点为:G'TGCAC ；
[0017]5)琼脂糖凝胶电泳分析；
[0018]6)鉴定结果的判断，若出现362bp和296bp的两条片段，则待测样品为赤链蛇；若不出现上述两条片段，则待测样品不为赤链蛇。
[0019]本发明方法的步骤I)和3)，采用现有技术的试剂盒提取DNA及纯化PCR产物的方法，不需要配制任何试剂，使得操作时间大大缩短。
[0020]本发明还提出了用于鉴定赤链蛇PCR-RFLP方法的试剂盒。所述试剂盒包括:弓丨物DKl-COl (10 μ M);引物DK1-C02 (10 μ Μ) ；2XTaq DNA聚合酶混合缓冲液，其包括:TaqDNA聚合酶(0.1U/ μ L)，四种脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dTTP、dCTP及dGTP各500 μ Μ)，Tris-HCl (20 μ Μ、ρΗ8.3)，KCl (100 μ Μ)，MgCl2 (3 μ Μ)等；ApaL I 酶(1U/ μ L);酶切缓冲液；终止缓冲液；灭菌双蒸水。
[0021]综上所述，本发明解决了鉴定赤链蛇与其它品种蛇的难题，提供了鉴定所需的一对PCR引物、PCR反应条件、赤链蛇特征DNA碱基序列、一种限制性内切酶、鉴定方法及其试剂盒。本发明利用赤链蛇与其它蛇类药材DNA序列的差异，构建了快速、便捷、准确的PCR-RFLP鉴别方法，对于保证金钱白花蛇的药材质量，打击金钱白花蛇伪品的市场行为具有重要的价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为各样本PCR扩增电泳图:1.赤链蛇2.金钱白花蛇3.黄斑渔游蛇4.眼镜蛇5.百花锦蛇6.尖吻蝮蛇；MK.DNA分子量标准:从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、lOObp。
[0023]图2为各样本COI条形码序列PCR产物酶切电泳结果:1.赤链蛇2.金钱白花蛇
3.黄斑渔游蛇4.眼镜蛇5.百花锦蛇6.尖吻蝮蛇；MK.DNA分子量标准:从上到下依次为100bp、7 OObp、500bp、400bp、300bp、200bp、10bp。
【具体实施方式】
[0024]结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
[0025]1、材料
[0026]6份蛇类原动物，主要采自广东省、江西省、广西壮族自治区(表1)。全部样本均由华南濒危动物研究所张亮进行性状鉴定。
[0027]表1 6份蛇类原动物样本
[0028]
【权利要求】
1.用于鉴别赤链蛇的PCR扩增引物，其特征在于，所述引物序列为:
DKl-COl:5，-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3，；
DK1-C02:5’ -CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’。
2.一种鉴定赤链蛇的PCR-RFLP方法，其特征在于，用能够识别赤链蛇特征DNA碱基序列的限制性内切酶APaL I对纯化后的PCR产物进行消化，形成琼脂糖凝胶电泳的特征图谱；赤链蛇特征DNA碱基序列为:5’ -GTGCAC-3’，其位于COI序列第362位至367位；所述鉴定方法包括以下步骤: 1)样品DNA的提取； 2)扩增DNA片段:利用权利要求1所述的引物进行聚合酶链反应，得到聚合酶链反应扩增产物，所述PCR反应参数包括:93°C预变性5min，55°C 2min ;93°C变性30s，55°C复性45s, 70°C延伸 45s, 35 个循环;70°C延伸 5min ； 3)琼脂糖凝胶电泳检测，纯化PCR产物； 4)所述PCR纯化产物中加入限制性内切酶APaLI进行酶切，所述限制性内切酶APaLI的酶切位点为:G~TGCAC ； 5)琼脂糖凝胶电泳分析； 6)鉴定结果的判断:若 在所述电泳产物中检测到分子量为362bp和296bp的两条片段，则待测样品为赤链蛇；若未出现上述两条片段，则待测样本非赤链蛇。
3.一种用于鉴别赤链蛇的PCR-RFLP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:10μΜ引物 DKl-COl ;10y]\^|*DKl-C02 ；2XTaq DNA 聚合酶混合缓冲液，其包括:0.1U/μ L TaqDNA 聚合酶，dATP、dTTP、dCTP 及 dGTP 各 500 μ M, 20 μ M Tris_HCl、pH8.3，100 μ M KC1，3 μ MMgCl2 ;10υ/μ L ApaL I酶；酶切缓冲液；终止缓冲液；灭菌双蒸水。
【文档编号】C12Q1/68GK104164493SQ201410347839
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月21日 优先权日:2014年7月21日
【发明者】晁志, 李晓蕾, 曾伟萍 申请人:南方医科大学