专利名称：一种构建大容量同义密码库及优化基因模板的方法
技术领域：
本发明涉及一种构建大容量同义密码库及优化基因模板的方法。
背景技术：
自然界中，细胞通过转录和翻译工程将储藏在DNA中的遗传信息合成蛋白质。核糖体作为蛋白质合成的执行元件，将mRNA中的信息翻译成多肽链，多肽链再进一步折叠成具有生物活性所需的构象。虽然功能蛋白质形成的相关分子机制目前尚不完全明确，但长期以来科学界普遍认为氨基酸序列中包含所有的指导蛋白质折叠成活性三维构象的信息，也就是常说的蛋白质的一级结构决定其高级结构。细胞使用61种密码子编码20种氨基酸。因此，许多氨基酸可由多个密码子来编码，这些编码同一氨基酸的密码子称为同义密码子。研究发现，同义密码子在生物 界中并非随机分布，不同生物体对同义密码子的使用呈现偏好性，导致异源细胞表达蛋白时常常出现合成效率低或产生大量不溶的聚合物(包涵体)的现象。据统计，约有40%的人类基因不能在E. coli中表达，或者只能低水平表达。优化异源蛋白在表达宿主/载体中的表达活性，是一个亟待解决的问题。现有大量文献报道，根据大肠杆菌的密码偏好性，定点突变改变外源蛋白的核苷酸序列以优化其表达特性。但是，通过定点突变改变外源蛋白某个位点或者某几个位点密码偏好性的方式来优化基因，只能单个构建，基因优化的效率极低，工作量也很大。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种优化基因的方法，还提供一种同义密码突变库的构建方法，即根据表达宿主/载体的密码偏好性，对外源蛋白的核苷酸密码进行高通量同义突变，以适应表达宿主/载体的表达环境。本发明为筛选大容量同义密码库优化基因模板的方法，它是通过优化基因模板，改进蛋白质的理化性质，同时维持原蛋白的氨基酸序列不变。其中，所述理化性质为蛋白质可溶性、功能和/或稳定性。其中，该方法包括如下步骤(a)构建同义密码基因库；(b)表达步骤(a)同义密码基因库；(C)筛选所需性质的目标蛋白；(d)获得基因优化摸板。其中，步骤(a)所述的同义密码基因库是重组基因库。所述同义密码基因库包括指定位点上的同义密码库或全长基因同义密码库。同义密码基因库含有低、中或/和高使用频率的同义密码子。步骤(b)中，同义密码基因库通过蛋白表达系统产生蛋白；所述蛋白表达系统为原核，真核及无细胞系统。
同义密码基因库所编码蛋白质可以是不同形式的蛋白，重组蛋白或多肽。所述表达可以是分子伴侣共表达。步骤(C)中，筛选鉴定所需性质的蛋白方法是高通量筛选，包括但不限于蛋白质展示或者其他富集方法。步骤(C)中，根据蛋白目标蛋白的可溶性、功能、产量和/或稳定性进行筛选。所述可溶性是指在蛋白表达或生理学缓冲液条件下保持可溶的状态。所述功能包括受体与配体结合、分子相互作用、底物特异性、抗原性和酶活性。所述稳定性包括高温稳定性、中温稳定性以及对低pH和/或高pH环境的稳定性。
所述筛选鉴定方法中可以使用报告基因，如绿色荧光蛋白GFP。同义密码突变库的构建方法，包括如下步骤( I)根据异源宿主的密码子偏好性，将目标蛋白的基因序列设计为密码子兼并序列；(2)将步骤(I)的兼并序列，分别按正向和反向截断为长度为12 100bp的基因序列，合成得到相互重叠的正向基因序列与反向基因序列；(3)取步骤(2)所得基因序列，混合，PCR扩增，，得扩增产物；(4)取步骤(2)兼并序列的前端和末端基因序列分别作为上游引物和下游引物，以步骤(3)的扩增产物作为模板，PCR扩增，回收PCR产物，即为同义密码突变库。所述同义密码突变库是指核苷酸序列不同但编码的蛋白的氨基酸序列相同的基因的集合。其中，步骤(2)所述基因序列的长度为12-100bp。其中，步骤(3)中，PCR扩增的条件为
权利要求
1.一种构建大容量同义密码库及优化基因模板的方法，其特征在于它是通过优化模板基因核苷酸密码维持原目标蛋白的氨基酸序列不变，改进蛋白质的理化性质。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述理化性质为蛋白质可溶性、功能和/或稳定性。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于该方法包括如下步骤 (a)构建同义密码基因库； (b)表达步骤(a)同义密码基因库； (C)筛选所需性质的目标蛋白； (d)获得优化后的目的蛋白基因。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(a)所述的同义密码基因库是重组基因库。
5.根据权利要求3和4的方法，其特征在于所述同义密码基因库包括指定位点上的同义密码库或全长基因同义密码库。
6.根据权利要求3-5任意一项所述的方法，其特征在于同义密码基因库含有低、中或/和高使用频率的同义密码子。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(b)中，同义密码基因库通过蛋白表达系统产生蛋白；所述蛋白表达系统为原核，真核及无细胞表达系统。
8.根据权利要求3 7所述的方法，其特征在于同义密码基因库所编码蛋白质可以是不同形式的蛋白，重组蛋白或多肽。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(b)中，所述表达可以是分子伴侣共表达。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(c)中，筛选鉴定所需性质的蛋白方法是高通量筛选，包括但不限于蛋白质展示或者其他富集方法。
11.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(C)中，所述筛选鉴定方法中可以使用报告基因，如GFP。
12.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(c)中，根据目标蛋白的可溶性、功能、产量和/或稳定性进行筛选。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述可溶性是指在蛋白表达或生理学缓冲液条件下保持可溶的状态。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述功能包括受体与配体结合、分子相互作用、底物特异性、抗原性和酶活性。
15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述稳定性包括高温稳定性、中温稳定性以及对低PH和/或高pH环境的稳定性。
16.SEQ ID NO. 42 43所示的核苷酸序列。
17.根据权利要求1-12，该方法作为一个试剂盒。
全文摘要
本发明公开了构建大容量同义密码库及优化基因模板的方法，它是通过优化基因模板,改进蛋白质的理化性质。本发明优化基因的方法可以改进编码目标蛋白的核苷酸密码，并维持目标蛋白的原氨基酸序列不变,进而改进目标蛋白的可溶性、功能、产量和/或稳定性。该方法具有良好的市场应用前景。
文档编号C12N15/13GK102864141SQ20121033870
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月13日 优先权日2012年9月13日
发明者王明蓉, 张雪梅, 葛永红, 何明跃 申请人:成都生物制品研究所有限责任公司