专利名称：一种d-苯乳酸的酶催化合成方法
技术领域：
本发明涉及一种D-苯乳酸的合成方法，特别涉及一种酶催化合成D-苯乳酸的方法。
背景技术：
苯乳酸(Phenyllactic acid, PLA),即2_轻基_3_苯基丙酸,也称3_苯基乳酸，是首次在干酪中被发现的同时抑制细菌和真菌的一种新型天然抑菌物质。苯乳酸能够抑制多种食源性致病菌，如致病性大肠杆菌(Escherichia coli 0157:H7)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)等；特别 是对引起食物腐败的真菌包括产毒素的真菌有广谱的抑制作用，其抑菌活性强于常见的化学防腐剂，已成为乳酸菌抗真菌能力的有效标志之一(Int J Food Microbiol 40 :177-183 ；JFood Prot61 :1281-1285 ;AppI Environ Microbiol 66:4084-4090)。与 Nisin、纳他霉素等生物防腐剂相比，苯乳酸具有较广的抑菌谱，能同时抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌。在20PPm添加量条件下，对真菌和细菌均达到很好的抑制效果。另外，苯乳酸还具有溶解性好、易于在食品体系中扩散；稳定性高、具有宽广的PH范围和热稳定性。同时，苯乳酸是一种天然抑菌物质，对人和动物细胞无毒；可以由乳酸菌生物合成，而乳酸菌是公认为安全(GRAS)的微生物，广泛用于食品加工、保藏，具有优良的食品安全性。因此，苯乳酸在高效广谱食品生物抑菌防腐剂中具有极大的市场空间。苯乳酸具有D-苯乳酸与L-苯乳酸两种构型，有报道称D-苯乳酸的抑菌能力稍高于L-苯乳酸(Appl Environ Microbiol 64:800-803)。生物合成D-苯乳酸包括乳酸菌发酵或酶催化等方法，由于乳酸菌发酵合成D-苯乳酸过程中，发酵产物尤其复杂，有机酸繁多，不利于D-苯乳酸的分离精制，而酶法合成D-苯乳酸没有副产物，因此酶法合成具有一定的优势。酶法合成D-苯乳酸，通常是利用D-乳酸脱氢酶催化底物苯丙酮酸加氢还原合成D-苯乳酸。该加氢还原过程需要还原型辅酶NADH，该辅酶价格昂贵，而且在催化反应过程中随着苯丙酮酸的加氢还原，该辅酶被氧化为氧化型辅酶NAD ;当还原型辅酶被耗尽，该酶催化反应会由于没有电子供体而终止。因此，若在D-苯乳酸酶法合成过程中，及时利用另一种催化反应使氧化型辅酶NAD不断循环还原成还原型辅酶NADH，则会使D-苯乳酸生物合成效率有效提高，这是D-苯乳酸酶法合成技术至今未涉足，但又是重要研究趋势的一种高效技术。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种改进的D-苯乳酸的酶催化合成方法，该方法合成效率高，成本低。为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案一种D-苯乳酸的酶催化合成方法，其使苯丙酮酸在D-乳酸脱氢酶催化下以及还原型辅酶NADH存在下发生加氢还原反应生成D-苯乳酸，反应起始时的反应体系中，苯丙酮酸的浓度为I lOOOmmol/L，D-乳酸脱氢酶的酶活性浓度为O. I 100U/L，还原性辅酶NADH的浓度为O. 01 100mmol/L，特别是，在加氢还原反应的反应体系中还加入有甲酸脱氢酶和甲酸钠，反应起始时，甲酸脱氢酶的酶活性浓度为O. I 100U/L，甲酸钠的浓度为I 1000mmol/L，加氢还原反应的温度为20°C 70°C、反应体系的pH为3. O 9. 0，反应时间为O. 5 IOh0根据本发明的一个优选方面，所述加氢还原反应的温度为30°C 60°C，更优选为40°C 50°C。所述反应体系的pH优选为3 7，更优选为5 6。在该温度和pH条件下，所述反应时间优选为O. 5 2小时。更优选为O. 75 I. 5小时。根据本发明的又一优选方面，反应起始时的反应体系中，苯丙酮酸的浓度为I IOOmmoI/L, D-乳酸脱氢酶酶活性浓度为I 100U/L，还原性辅酶NADH的浓度为O. I 10mmol/L,甲酸脱氢酶的酶活性浓度为I 100U/L，甲酸钠的浓度为I lOOmmol/L。更优 选地，苯丙酮酸的浓度为I 50mmol/L，D-乳酸脱氢酶酶活性浓度为I 50U/L，还原性辅 酶NADH的浓度为O. I 2mmol/L，甲酸脱氢酶的酶活性浓度为I 50U/L，甲酸钠的浓度为I SOmmoI /I,η根据本发明的一个具体方面，所述D-乳酸脱氢酶的基因来源于戊糖片球菌ATCC 25745 (基因文库编号为GeneID =4417836)，甲酸脱氢酶的基因来源于Ogataeaparapo lymorpha DL-I (基因文库编号为 GI :320581066)。由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果本发明将甲酸/甲酸脱氢酶体系首次应用于D-乳酸脱氢酶催化苯丙酮酸合成苯乳酸的酶催化体系中，对酶催化体系中的还原型辅酶NADH进行再生，实现了 D-乳酸脱氢酶催化苯丙酮酸高效合成D-苯乳酸，大幅度提高了 D-苯乳酸的产量。
具体实施例方式本发明提供了一种辅酶再生技术高效生产D-苯乳酸的方法，产量为单酶生产D-苯乳酸的5倍以上。本发明采取的技术方案是将戊糖片球菌乳酸脱氢酶和Ogataeaparapo lymorpha甲酸脱氢酶置于统一反应体系中，不断向其中添加辅酶再生底物甲酸钠，使氧化型NAD不断循环还原为还原型辅酶NADH，从而实现D-苯乳酸的高效生产，其特点是I、反应过程中催化苯丙酮酸生成D-苯乳酸的酶为D-乳酸脱氢酶，其基因来源于戊糖片球菌ATCC 25745(基因文库编号为GeneID :4417836);用于NADH辅酶再生的酶为甲酸脱氢酶，其基因来源于Ogataea parapo lymorpha DL-1 (基因文库编号为GI :320581066)；2、本发明使用的D-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶可通过基因工程菌过量表达获得，其制备过程可简述为以戍糖片球菌ATCC 25745、Ogataea parapo lymorpha DL-1基因组为模板，通过PCR获得D-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶目的基因，利用基因克隆方法构建至表达质粒pET-22b (+)中，分别获得含有D-乳酸脱氢酶、甲酸脱氢酶基因的重组质粒，并将重组质粒转化导入到大肠杆菌中构建重组工程菌，经过IPTG诱导表达出D-乳酸脱氢酶及甲酸脱氢酶，并将两种酶经过粗分或精制，随即用于D-苯乳酸的酶反应合成；3、在酶反应体系中添加苯丙酮酸作为合成D-苯乳酸的底物，甲酸钠为辅酶再生的辅助底物从而促进反应过程中NADH的再生，添加D-乳酸脱氢酶的酶活性浓度为O. I 100U/L，甲酸脱氢酶的酶活性浓度为O. I 100U/L ;苯丙酮酸的浓度为I lOOOmmol/L，甲酸钠的浓度为I 1000mmol/L，同时辅酶NADH的浓度为O. 01 100mmol/L ；4、双酶联用实现辅酶再生，合成D-苯乳酸过程的温度为20°C 70°C，pH为3. O
9.0，反应时间为I IOh ;5、反应过程在反应罐中，将D-乳酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、底物苯丙酮酸、甲酸钠、pH缓冲液按照上述添加量添加到反应罐中，搅拌均匀后向其中添加辅酶NADH，反应至一定时间，终止反应即可。6、检测D-苯乳酸的方法反应液经离心，再经微孔滤膜过滤(0. 22 μ m)，滤液上HPLC 分析。HPLC 条件① AgilentllOO 色谱柱Z0RBAX 300SB C18 (5 μ m、4. 6X 250mm) ；(2)流动相(A)0. 05%三氟乙酸/甲醇和(B)O. 05%三氟乙酸/水梯度洗脱程序0、18、20、 21、24分钟时的洗脱液A/B体积比组成分别为10 90,100 OUOO OUO 90,10 90;
④检测器紫外检测器波长210nm ;⑤柱温30°C ;⑥流速lmL/min 进样量10μ L ;⑧苯乳酸标样浓度0. 5mg/mL。以下结合具体的实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明不限于以下实施例。实施例I戍糖片球菌D-乳酸脱氢酶与Ogataea parapo lymorpha甲酸脱氢酶的获得戍糖片球菌D-乳酸脱氢酶与Ogataea parapolymorpha甲酸脱氢酶的基因在NCBI基因文库中的编码分别是GeneID =4417836和GI :320581066，其基因序列为已知，可通过设计PCR引物，分别以戍糖片球菌ATCC 25745、Ogataea parapolymorpha DL-1基因组为模板，通过PCR获得D-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶目的基因。通过基因克隆方法分别将这两个目的基因构建至表达质粒pET-22b (+)中，从而分别获得含有D-乳酸脱氢酶、甲酸脱氢酶基因的重组质粒；随后将这两种重组质粒转化导入到大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组工程菌。上述BL21(DE3)重组菌在LB培养基中37°C培养至600nm光吸收值为0. 6时，添加诱导剂IPTG至终浓度0. 5mmol/L,随后30°C诱导培养5h，即可获得目的基因过量表达的菌体。随后，通过超声或高压破碎、离心、层析等常规方法获得戊糖片球菌D-乳酸脱氢酶与Ogataea parapolymorpha甲酸脱氢酶的粗酶或纯酶,用于D-苯乳酸生物合成的辅酶再生体系。实施例2各种温度条件下辅酶再生法合成D-苯乳酸在IL酶反应罐中，添加10U/L戊糖片球菌D-乳酸脱氢酶、10U/L0gataeaparapolymorpha 甲酸脱氧酶、10mmol/L 苯丙丽酸、10mmol/L 甲酸纳和 0. 2mmol/L NADH,反应缓冲液为lOOmmol/L磷酸缓冲液(pH 6. 0)，反应体系温度分别为20、30、40、45、50、55、60,65和70°C，反应Ih后检测合成的D-苯乳酸产量，实验结果参见表I。表I不同反应温度条件下D-苯乳酸合成产量
权利要求
1.一种D-苯乳酸的酶催化合成方法，其使苯丙酮酸在D-乳酸脱氢酶催化下以及还原型辅酶NADH存在下发生加氢还原反应生成D-苯乳酸，反应起始时的反应体系中，苯丙酮酸的浓度为flOOO mmol/L，D-乳酸脱氢酶的酶活性浓度为O. f 100 U/L，还原性辅酶NADH的浓度为O. OflOO mmol/L，其特征在于在所述加氢还原反应的反应体系中还加入有甲酸脱氢酶和甲酸钠，反应起始时，甲酸脱氢酶的酶活性浓度为0. Γ100 U/L，甲酸钠的浓度为Γ1000 mmol/L，所述加氢还原反应的温度为20°C 70°C、反应体系的pH为3. (T9. O,反应时间为0. 5 10 h0
2.根据权利要求I所述的D-苯乳酸的酶催化合成方法，其特征在于所述加氢还原反应的温度为30°C 60°C。
3.根据权利要求2所述的D-苯乳酸的酶催化合成方法，其特征在于所述加氢还原反应的温度为40°C 50°C。
4.根据权利要求I或2或3所述的D-苯乳酸的酶催化合成方法，其特征在于所述反应体系的pH为Γ7。
5.根据权利要求4所述的D-苯乳酸的酶催化合成方法，其特征在于所述反应体系的pH为5 6。
6.根据权利要求5所述的D-苯乳酸的酶催化合成方法，其特征在于所述反应时间为0. 5^2小时。
7.根据权利要求6所述的D-苯乳酸的酶催化合成方法，其特征在于所述反应时间为0. 75 I. 5小时。
8.根据权利要求I所述的D-苯乳酸的酶催化合成方法，其特征在于反应起始时的反应体系中，苯丙酮酸的浓度为广100臟01/1，0-乳酸脱氢酶酶活性浓度为广100 U/L，还原性辅酶NADH的浓度为0. ri0mmol/L,甲酸脱氢酶的酶活性浓度为f 100 U/L，甲酸钠的浓度为 1 10Ommol /I, η
9.根据权利要求8所述的D-苯乳酸的酶催化合成方法，其特征在于苯丙酮酸的浓度为广50 mmol/L，D-乳酸脱氢酶的酶活性浓度为f 50 U/L，还原性辅酶NADH的浓度为0. r2mmol/L,甲酸脱氢酶的酶活性浓度为f 50 U/L，甲酸钠的浓度为f 50mmol/L。
10.根据权利要求Γ3及8、中任一项权利要求所述的D-苯乳酸的酶催化合成方法，其特征在于所述D-乳酸脱氢酶的基因来源于戊糖片球菌ATCC 25745，所述甲酸脱氢酶的基因来源于 Ogataea parapolymorpha DL-1。
全文摘要
本发明涉及一种D-苯乳酸的酶催化合成方法，其使苯丙酮酸在D-乳酸脱氢酶催化下以及还原型辅酶NADH存在下发生加氢还原反应生成D-苯乳酸，反应起始时的反应体系中，苯丙酮酸的浓度为1~1000mmol/L，D-乳酸脱氢酶的酶活性浓度为0.1~100U/L，还原性辅酶NADH的浓度为0.01~100mmol/L，特别是，在加氢还原反应的反应体系中还加入有甲酸脱氢酶和甲酸钠，反应起始时，甲酸脱氢酶的酶活性浓度为0.1~100U/L，甲酸钠的浓度为1~1000mmol/L，加氢还原反应的温度为20℃~70℃、反应体系的pH为3.0~9.0，反应时间为0.5~10h。本发明合成效率高，成本低。
文档编号C12P7/42GK102876737SQ201210338378
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月13日 优先权日2012年9月13日
发明者刘炯, 沐万孟, 江波, 郁书怀, 季万兰, 丁美琴, 刘知远, 韩晓明 申请人:江苏梁丰食品集团有限公司