专利名称：一种产复合酶的菌株及其制备断奶仔猪用复合酶的方法
技术领域：
本发明涉及生物领域，特别是一种产复合酶的菌株及其制备断奶仔猪用复合酶的方法。
背景技术：
随着养猪业向集约化、规模化方向发展，仔猪早期断奶已成为养猪生产中普遍采用的重要手段，是国内外养猪生产中普遍关注的先进技术，它能提高母猪的繁殖率，减少疾病由母体向仔猪的传播，并能提高生长期的生产性能和胴体品质。但随之而来的早期断奶综合症给养猪生产带来较大损失，仔猪早期断奶时受心理、环境及营养应激影响，常表现为食欲差、消化功能紊乱、腹湾，由此导致生长迟滞、饲料利用率低等所谓“仔猪早期断奶综合症”，这一问题迄今还没有得到彻底解决。研究者一直在寻找仔猪断奶综合症发生的病因，最近二十来年的研究表明，其引发因素主要是营养应激，日粮因素才是导致仔猪腹泻的主要原因，为满足仔猪生长快、代谢快的生理需求，仔猪日粮一般具备高蛋白、高营养的特点，断奶初期，仔猪消化器官及酶系统发育不完全，内源酶酶活性低，使日粮中营养物质的消化吸收进一步降低，过多的大分子蛋白质、淀粉、木聚糖等物质涌入肠道，引起超敏反应，使肠道受到损伤，最终导致仔猪腹泻。为了有效缓解这种症状，在配制仔猪饲粮时在仔猪饲料中恰当地选择和应用仔猪用复合酶制剂是非常必要的。应用单菌种进行固态发酵产生多种酶系，包括消化酶类蛋白酶、淀粉酶和非淀粉多糖酶类木聚糖酶，减少了单酶复配酶种之间相互拮抗作用，降低了酶饲用成本，在早期断奶仔猪饲料中添加酶制剂，既能改善饲料利用率和提高仔猪生产性能，且无毒、无副作用、无残留，不仅能全面促进饲粮养分的分解消化和吸收利用，而且能有效地消除饲料抗营养因子的有害作用，提高仔猪的生产性能和增进健 康。饲用酶制剂的研究开发和推广使用是生物技术在饲料工业中应用的一个引人瞩目的领域，这使饲料工业高效、环保和可持续发展成为可能。
发明内容
针对上述情况，本发明的目的就是提供一种产复合酶的菌株及其制备断奶仔猪用复合酶的方法，可有效解决断奶仔猪对现有饲料难以消化吸收，引起断奶仔猪的超敏反应，使肠道受到损伤，最终导致仔猪腹泻的问题。本发明的技术方案是，一种产复合酶的菌株，其分类命名为黑曲霉菌(Aspergillus niger) HKSlI,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 6027 ;所述的复合酶为包括蛋白酶、淀粉酶及木聚糖酶的断奶仔猪用复合酶；
利用该菌株制备断奶仔猪用复合酶的方法，包括以下步骤
(O从斜面保藏培养基上取黑曲霉菌菌株接种到一级种子培养基上，在28 32°C下，培养72h 96h，进行菌种活化，得活化的菌株；
(2)将活化的菌株从一级种子培养基上接种到二级种子培养基上，在28 32°C下，培养65h 84h,得二级种子；
(3)将二级种子接种到固体发酵罐中的发酵培养基上，在相对湿度为90%以上，温度为29°C的条件下，发酵培养24 32h，发酵结束后，得包括蛋白酶、淀粉酶及木聚糖酶的复合酶，并对酶活性进行测定；
所述的斜面保藏培养基由以下重量计的=NaNO3 3. 0g, KCL O. 5g，FeSO4 · 7 H2O O. Olg,K2HPO4 I. 0g, MgS047H20 O. 5g，蔗糖 30. O g，琼脂 15. O g，蒸馏水 IOOOmL 制成；所述的一级种子培养基由以下重量计的黄豆1000g、MgS047H20 O. 5g、可溶性淀粉2. 0g、KH2PO4 I. 0g、(NH4) SO4 0. 5g、琼脂15. 0 g，蒸馏水IOOOmL制成；所述的二级种子培养基由以下重量计的麸皮950g，豆柏粉50g，水IOOOmL制成；所述的发酵培养基由以下重量计的麸皮50 70Kg，小麦面粉 5 10Kg，豆柏粉 20 40Kg，玉米芯粉 5 10Kg，MgS047H20 0. 05Kg, K2HPO40. lKg，水 IOOL 制成。 本发明利用微生物菌株发酵，生产复合酶，成本低，原料丰富易得，节能环保，生产的断奶仔猪用复合酶添加到仔猪饲料中，既能改善饲料利用率和提高仔猪生产性能，且无毒、无副作用、无残留，不仅能全面促进饲粮养分的分解消化和吸收利用，而且能有效地消除饲料抗营养因子的有害作用，提高仔猪身体素质，促进健康生长。
图I为实施例I中CGMCC No. 6027菌株在100L固体发酵罐中发酵产酶过程曲线。生物材料样品保藏
一株产包括蛋白酶、淀粉酶及木聚糖酶的复合酶的菌株，该菌株为黑曲霉菌(Aspergillus niger) HKSlI,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 6027，保藏时间为2012年4月23日。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明的具体实施方式
作详细说明。本发明的技术方案是，一种产复合酶的菌株，其分类命名为黑曲霉菌(Aspergillus niger) HKSlI,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 6027 ;所述的复合酶为包括蛋白酶、淀粉酶及木聚糖酶的断奶仔猪用复合酶；
利用该菌株制备断奶仔猪用复合酶的方法，包括以下步骤
(O从斜面保藏培养基上取黑曲霉菌菌株接种到一级种子培养基上，在28 32°C下，培养72h 96h，进行菌种活化，得活化的菌株；(2)将活化的菌株从一级种子培养基上接种到二级种子培养基上，在28 32°C下，培养65h 84h，得二级种子；(3)将二级种子接种到固体发酵罐中的发酵培养基上，在相对湿度为90%以上，温度为29°C的条件下，及时开通无菌空气调节系统和全雾化补水系统，实现温度自控和保持湿度，发酵培养24 32h，发酵结束后，得包括蛋白酶、淀粉酶及木聚糖酶的复合酶，并对酶活性进行测定；
所述的斜面保藏培养基由以下重量计的=NaNO3 3. 0g, KCL O. 5g，FeSO4 · 7 H2O O. Olg,K2HPO4 I. 0g, MgS047H20 0. 5g，蔗糖 30. O g，琼脂 15. O g，蒸馏水 IOOOmL 制成；所述的一级种子培养基由以下重量计的黄豆1000g、MgS047H20 0. 5g、可溶性淀粉2. 0g、KH2PO4 I. 0g、(NH4) SO4 O. 5g、琼脂15. 0 g，蒸馏水IOOOmL制成；所述的二级种子培养基由以下重量计的麸皮950g，豆柏粉50g，水IOOOmL制成；所述的发酵培养基由以下重量计的麸皮50 70Kg,小麦面粉 5 IOKg,豆柏粉 20 40Kg,玉米芯粉 5 IOKg, MgS047H20 O. 05Kg, K2HPO4O. lKg，水 IOOL 制成。以麸皮和小麦面粉质量比以9:1复配作为培养基碳源时发酵产蛋白酶的活力较闻。以豆柏粉作为氮源时发酵产蛋白酶的活力较高。以麸皮和小麦面粉作为碳源、豆柏粉作为氮源、玉米芯粉作为疏松填充料(酶载体)，添加适量无机盐MgS047H20，K2HPO4组成的培养基时，发酵产蛋白酶的活力较高。本发明所述产复合酶的菌株在制备断奶仔猪用复合酶中，可由以下实施例实现。
实施例I
黑曲霉菌株CGMCC No. 6027在100L固体发酵罐中发酵产酶，从斜面保藏培养基斜面上接一环CGMCC No. 6027菌种入一级种子培养基斜面上，进行菌种活化，在28 32°C，培养时间为72h 96h后，从一级种子培养基斜面上接三环一级种子菌种入二级种子培养基(二级种子培养基60g/1000mL三角瓶)，在28 32°C，培养时间为65h 84h后，以发酵培养基重量O. 2%的接种量接入到100L固体发酵罐中的发酵培养基上。100L固体发酵罐中发酵培养基为50Kg，温度为29°C，相对湿度为90%以上，发酵时间24 32h。及时开通无菌空气调节系统和全雾化补水系统，实现温度自控和保持湿度。发酵设备为镇江东方生物工程设备技术有限责任公司SF-100A固态发酵罐。发酵结束时，蛋白酶酶活力最高值为3800 μ/g，淀粉酶酶活力最高值为121 μ /g,木聚糖酶酶活力最高值为6300 μ /g。所述的发酵培养基由以下重量计的麸皮54Kg，小麦面粉6 Kg,豆柏粉35 Kg,玉米芯粉 5 Kg, MgSOJH2O O. 05Kg, K2HPO4 O. lKg，水 100L 制成。实施例2
黑曲霉菌株CGMCC No. 6027在100L固体发酵罐中发酵产酶，从斜面保藏培养基斜面上接一环CGMCC No. 6027菌种入一级种子培养基斜面上，进行菌种活化，在28 32°C，培养时间为72h 96h后，从一级种子培养基斜面上接三环一级种子菌种入二级种子培养基(二级种子培养基60g/1000mL三角瓶)，在28 32°C，培养时间为65h 84h后，以发酵培养基重量O. 2%的接种量接入到100L固体发酵罐中的发酵培养基上。100L固体发酵罐中发酵培养基为50Kg，温度为29°C，相对湿度为90%以上，发酵时间24 32h。及时开通无菌空气调节系统和全雾化补水系统，实现温度自控和保持湿度。发酵设备为镇江东方生物工程设备技术有限责任公司SF-100A固态发酵罐。发酵结束时，蛋白酶酶活力最高值为3700 μ/g，淀粉酶酶活力最高值为110 μ /g，木聚糖酶酶活力最高值为6270 μ /g。所述的发酵培养基由以下重量计的麸皮50Kg，小麦面粉10Kg，豆柏粉40Kg，玉米芯粉 IOKg, MgS047H20 O. 05Kg, K2HPO4 O. lKg，水 100L 制成。实施例3
黑曲霉菌株CGMCC No. 6027在100L固体发酵罐中发酵产酶，从斜面保藏培养基斜面上接一环CGMCC No. 6027菌种入一级种子培养基斜面上，进行菌种活化，在28 32°C，培养时间为72h 96h后，从一级种子培养基斜面上接三环一级种子菌种入二级种子培养基(二级种子培养基60g/1000mL三角瓶)，在28 32°C，培养时间为65h 84h后，以发酵培养基重量O. 2%的接种量接入到IOOL固体发酵罐中的发酵培养基上。100L固体发酵罐中发酵培养基为50Kg，温度为29°C，相对湿度为90%以上，发酵时间24 32h。及时开通无菌空气调节系统和全雾化补水系统，实现温度自控和保持湿度。发酵设备为镇江东方生物工程设备技术有限责任公司SF-100A固态发酵罐。发酵结束时，蛋白酶酶活力最高值为3750 μ/g，淀粉酶酶活力最高值为117 μ /g，木聚糖酶酶活力最高值为6180 μ /g。所述的发酵培养基由以下重量计的麸皮70Kg，小麦面粉5Kg，豆柏粉20Kg，玉米芯粉 5Kg, MgS047H20 O. 05Kg, K2HPO4 O. lKg，水 100L 制成。本发明方法简单，生产周期短，成本低，原料丰富易得，节能环保，易于生产，应用效果好，并经试验取得了满意的效果，有关试验资料如下
采用以下分析方法对所得复合酶的活性进行测定 A.酸性蛋白酶分析方法福林-酚试剂法测定。A. I 试剂
A.I. I福林试剂
于2000mL磨口回流装置中，加入钨酸钠(Na2W042H20) 100. Og,钥酸钠(Na2Mo042H20)25. Og,蒸馏水700mL，85%磷酸50mL，浓盐酸IOOmL,文火回流10小时，取出冷凝器，加入硫酸锂(LiSO4) 50. Og,蒸馏水50mL混匀，加入几滴溴水，再煮沸5分钟，以驱逐残溴及除去颜色，溶液呈黄色而非绿色。若仍有绿色，需再加几滴溴液再煮沸除去。冷却后，定容至IOOOmL,细菌漏斗(NO. 4 5)过滤，置于棕色瓶中保存，此溶液使用时，加2倍蒸馏水稀释，即成已稀释的福林试剂。A. I. 2 0. 4mol Na2CO3 溶液称取无水 Na2C0342. 4g,定容至 1000mL。A. 1.3 0. 4mol三氯乙酸(TCA)溶液称取三氯乙酸65. 4g，定容至1000mL。A. I. 4 0. 05mol ρΗ2· 5 乳酸-乳酸钠缓冲液
a液称取80% — 90%的乳酸10. 6g，加蒸馏水稀释定容至1000mL。b液称取70%乳酸钠16g，加水稀释定容至1000mL。取a液16mL和b液ImL混合稀释I倍即成。A. I. 5 2%酪蛋白溶液
称取干酪素2. 000g,精确至0. 002g,加入浓乳酸10mL，在水浴中加热使溶解(必要时，用小火加热煮沸)。然后用PH2. 5乳酸-乳酸钠缓冲液定容至IOOmL即成。配制后，放入冰箱内保存。A. I. 5 100ug/mL 酪氨酸溶液
精确称取在105°C烘箱中烘至恒重的酪氨酸0. lOOOg，逐步加入6mL IN盐酸使溶解，用0. 2N盐酸定容至IOOmL,其浓度为1000 μ g/mL。再吸取此溶液10mL，以0. 2N盐酸定容至IOOmL,即成100 μ g/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后应及时使用或放入冰箱保存，以免繁殖细菌而变质。A.2标准曲线绘制
按表I配制各种不同浓度的酪氨酸溶液 表I配制不同浓度的酪氨酸浓度
权利要求
1.一种产复合酶的菌株,其特征在于,其分类命名为黑曲霉菌(As/76 r^77A/5· niger)HKSlI,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.6027。
2.根据权利要求I所述的产复合酶的菌株，其特征在于，所述的复合酶为包括蛋白酶、淀粉酶及木聚糖酶的断奶仔猪用复合酶。
3.权利要求I所述的产复合酶的菌株制备断奶仔猪用复合酶的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)从斜面保藏培养基上取权利要求I所述的菌株接种到一级种子培养基上，在28 32°C下，培养72h 96h，进行菌种活化，得活化的菌株； (2)将活化的菌株从一级种子培养基上接种到二级种子培养基上，在28 32°C下，培养65h 84h,得二级种子； (3)将二级种子接种到固体发酵罐中的发酵培养基上，在相对湿度为90%以上，温度为29°C的条件下，发酵培养24 32h，发酵结束后，得包括蛋白酶、淀粉酶及木聚糖酶的复合酶，并对酶活性进行测定； 所述的斜面保藏培养基由以下重量计的=NaNO3 3. 0g, KCL O. 5g，FeSO4 · 7 H2O O. Olg,K2HPO4 I. 0g, MgSO4·7Η20 O. 5g，蔗糖 30. O g，琼脂 15. O g，蒸馏水 IOOOmL 制成； 所述的一级种子培养基由以下重量计的黄豆1000g、MgSO4·7Η20 O. 5g、可溶性淀粉2.0g、KH2PO4 I. 0g、(NH4) SO4 0. 5g、琼脂 15. 0 g,蒸馏水 IOOOmL 制成； 所述的二级种子培养基由以下重量计的麸皮950g，豆柏粉50g，水IOOOmL制成； 所述的发酵培养基由以下重量计的麸皮50 70Kg，小麦面粉5 10Kg，豆柏粉20 40Kg，玉米芯粉 5 10Kg, MgSO4.7H20 0. 05Kg, K2HPO4 0. lKg，水 100L 制成。
4.根据权利要求3所述的产复合酶的菌株制备断奶仔猪用复合酶的方法，其特征在于，所述的发酵培养基由以下重量计的麸皮54Kg，小麦面粉6 Kg,豆柏粉35 Kg,玉米芯粉 5 Kg, MgSO4·7Η20 0. 05Kg, K2HPO4 0. lKg，水 100L 制成。
5.根据权利要求3所述的产复合酶的菌株制备断奶仔猪用复合酶的方法，其特征在于，所述的发酵培养基由以下重量计的麸皮50Kg，小麦面粉10Kg，豆柏粉40Kg，玉米芯粉10Kg, MgSO4·7Η20 0. 05Kg, K2HPO4 0. lKg，水 100L 制成。
6.根据权利要求3所述的产复合酶的菌株制备断奶仔猪用复合酶的方法，其特征在于，所述的发酵培养基由以下重量计的麸皮70Kg，小麦面粉5Kg，豆柏粉20Kg，玉米芯粉5Kg, MgSO4·7Η20 0. 05Kg, K2HPO4 0. lKg，水 100L 制成。
全文摘要
本发明涉及一种产复合酶的菌株及其制备断奶仔猪用复合酶的方法，可有效解决断奶仔猪对现有饲料难以消化吸收，引起超敏反应的问题。本发明菌株为黑曲霉菌(Aspergillusniger)HKS11，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.6027；所产的复合酶包括蛋白酶、淀粉酶及木聚糖酶。利用该菌株制备复合酶的方法包括菌种活化，二级种子的获得，固体发酵罐中发酵培养。本发明制备成本低，原料丰富易得，节能环保，生产的断奶仔猪用复合酶添加到仔猪饲料中，能改善饲料利用率并提高仔猪生产性能，促进健康生长。
文档编号C12R1/685GK102732433SQ20121019820
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月15日 优先权日2012年6月15日
发明者丁芳, 刘德海, 权淑静, 胡宜亮, 解复红, 贾彬, 陈国参, 马焕 申请人:河南省科学院生物研究所有限责任公司