一种中国番茄黄曲叶病毒卫星的组成型表达启动子的制作方法

专利名称：一种中国番茄黄曲叶病毒卫星的组成型表达启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种中国番茄黄曲叶病毒卫星的组成型表达启动子。具体地说，本发明涉及中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的PClORF缺失启动子、全长启动子和串联启动子序列的分离。本发明也涉及含有连接异源基因的中国番茄黄曲叶病毒beta卫星的β ClORF缺失启动子、全长启动子和串联启动子的载体盒的构建。另外，本发明也涉及利用含有中国番茄黄曲叶病毒beta卫星的β ClORF各种 启动子的表达载体进行瞬间表达和稳定表达的方法。
背景技术：
植物基因工程的目的是将外源基因导入受体植物后使其正确而有效地表达，而启动子对外源基因的表达水平影响很大，是基因工程表达载体的重要元件。人们可根据需要选择或人工构建合适的启动子来研究新基因的功能，阐明生物体的生长发育及其他生命周期的过程与机理，目前已有许多不同来源的启动子被用于植物品质改良基因工程、抗病育种基因工程以及植物生物反应器等基因工程领域。这些启动子中一大类是从根瘤农杆菌中分离出来，另一大类为植物本身来源的启动子。相比上述启动子控制的目标基因表达量往往较低，或者与受体植物细胞基因组序列具有一定的同源性的劣势，植物病毒启动子在植物遗传转化中有着不可或缺的优势。已经鉴定的植物病毒启动子，主要包括组成型表达启动子和组织特异性表达启动子。组成型启动子能够驱动外源基因在植物不同组织或器官以及不同的发育阶段持续和稳定的表达，不表现时空特异性，也不受外界因素的诱导。其中花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子在双子叶植物基因表达中被广泛应用，它具有多种顺式作用元件，利用CaMV 35S核心启动子与CaMV 35S启动子的5’端不同区段和烟草花叶病毒(TMV)的5’非转录区(omega序列)相连，发现该启动子可驱动报告基因在双子叶植物烟草和单子叶植物水稻中均高效表达。有研究表明利用CaMV 35S启动子的串联重复序列作为启动子元件能较大幅度地提高启动子活性，而进ー步的研究表明启动子元件或片段的重复虽然能够提高其表达活性，但启动子的表达模式不会改变。因此，通过对启动子进行改造有可能提闻启动子驱动外源基因表达的能力，从而为外源基因闻效表达载体的构建及应用打下良好基础。双生病毒是世界范围内广泛存在的ー类具有孪生颗粒形态的植物单链DNA病毒。beta卫星是与某些单组份双生病毒相伴随的ー类分子，该分子大小约1.3 kb,是其辅助病毒基因组的一半左右。beta卫星分子依赖于其辅助病毒进行DNA复制、移动和包裏。其基因组中除了存在一个富含腺嘌呤的区域(A-rich region)和一个卫星保守区(SCR)タト,还存在ー个大小、位置和氨基酸序列上高度保守的β C10RF，现已证实其与致病性紧密相关，它的缺失并不影响beta卫星的复制，并且已有实验表明beta卫星可以作为病毒诱导的基因沉默载体进行遗传操作。已鉴定来源于中国番茄黄曲叶病毒YlO分离物相伴随的beta卫星分子的启动子为韧皮部特异性表达的启动子，而本研究中来源于中国番茄黄曲叶病毒Y25分离物相伴随的beta卫星分子和上述beta卫星分子同源性达78. 7%，属于同一卫星分子的不同分离物，但是两者在致病表型上却有比较大的差异，推测该beta卫星的启动子在表达类型上也有别于上述beta卫星的启动子，有可能为植物基因表达提供ー些有价值的表达元件，并为两类beta卫星分子不同致病性机理的研究打下良好的分子生物学方面的基础。因此，本发明的开展既可以通过了解决定致病相关蛋白PCl的启动子的活性，有助于了解双生病毒致病性和侵染的机理，并且可以为不同目的的植物基因工程提供合适类型的启动子，为植物基因工程的迅速做出一定贡献。已知PClORF启动子是影响病毒卫星载体表达效率的重要因素，而该启动子的表达类型也决定了其在植物遗传转化中的应用价值，本发明分析了中国番茄黄曲叶病毒Υ25分离物相伴随的beta卫星分子中β ClORF的缺失启动子、全长启动子和串联启动子的表达活性以及全长启动子的表达类型。

发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供ー种中国番茄黄曲叶病毒卫星的组成型表达启动子。
中国番爺黄曲叶病毒卫星的组成型表达启动子所述启动子DNA序列为中国番爺黄曲叶病毒beta卫星分子的PClORF的缺失启动子SEQ ID NO: I、全长启动子SEQ ID NO:2或串联启动子SEQ ID NO:3所示DNA序列。DNA构建体包括权利要求I所示的中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的β ClORF的缺失启动子SEQ ID NO: I、全长启动子SEQ ID NO:2或串联启动子SEQ ID NO:3，以及与之进行可操作连接的有效基因，其中所述有效基因包括杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗细菌基因或抗病毒基因。利用植物细胞表达杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗细菌基因或抗病毒基因的方法包括如下步骤(a)以可表达的方式将杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗细菌基因或抗病毒基因连接到中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的PClORF的缺失启动子SEQ IDNO: I、全长启动子SEQ ID NO:2或串联启动子SEQ ID NO:3所述的启动子DNA序列下游以获得重组DNA片段；(b)将该重组DNA片段插入植物表达载体中；(c)用上述重组表达载体转化植物细胞；(d)培养该植物细胞表达杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗细菌基因或抗病毒基因。利用植物细胞制备蛋白质的方法包括如下步骤(a)以可表达的方式将编码所需蛋白质的DNA连接到中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的PClORF的缺失启动子SEQ ID NO: I、全长启动子SEQ ID NO:2或串联启动子SEQID NO: 3所述的启动子DNA序列下游，获得重组DNA片段；(b)将重组DNA片段插入表达载体中，获得重组表达载体；(C)重组表达载体经农杆菌或基因枪法转化植物细胞，培养转化的植物细胞以表达所需的蛋白质；(d)从培养物中回收所需的蛋白质。表达载体含有中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的β ClORF的缺失启动子SEQID NO: I、全长启动子SEQ ID NO: 2或串联启动子SEQ ID NO: 3所述的启动子DNA序列，其中所述载体是适用于植物细胞的质粒载体、噬菌体或病毒，所述载体能够插入杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗细菌基因或抗病毒基因。本发明与现有技术相比具有的有益效果I)应用本发明中的启动子，在植物抗病基因工程中可以实现有效的抗病目的。组成型启动子与组织特异性启动子相比，它能持续高效地表达目的基因，能有效控制病虫害在整个植株中蔓延，使植物各类组织细胞都得到保护。组织化学染色法结果表明，本发明中的全长启动子在转基因植株根、茎、叶的皮层细胞、叶肉细胞以及维管组织的韧皮部、木质部中都能够表达(如图5)。组成型表达的强启动子，通常会导致外源基因在植株体内的过量表达，从而对植株生长发育产生负面影响。尽管本发明中中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的串联启动子活性明显强于全长启动子以及缺失启动子的活性，但与强组成型表达启动子CaMV 35S启动子相比，串联启动子的活性仅是它的58. 62%，所以该启动子驱动的外源 基因的表达量对植株生长发育产生的影响较小。鉴于文献报道已掲示启动子的串联重复不会改变其表达模式，综合本发明中启动子的组成型表达和非过量表达外源基因的优点，应用于植物抗病基因工程中能够达到经济有效的抗病目的。2)应用本发明中的组成型表达启动子，可以高效表达外源基因，増加外源蛋白的产量。组成型表达的启动子在植物的所有组织中以及生长发育的所有阶段都能启动基因表达，不表现时空特异性；RNA和蛋白质表达量也是相对恒定的。如果要生产某种目的蛋白，应用组成型表达的启动子其蛋白表达量明显高于组织特异性启动子。3)应用本发明中的启动子，可以有效进行植物转基因工程。植物基因工程中使用的植物来源的启动子由于与受体植物基因组具有一定的同源性，往往会在寄主植物体内引起基因沉默现象而造成外源基因失活。这种现象在多基因转化时更为普遍。而本发明中的启动子，由干与植物基因组序列没有同源性，所以能够避免基因沉默现象的发生。此外，大量研究表明，侵染双子叶植物的病毒来源的启动子可有效地应用于单子叶植物的遗传转化。本发明中的启动子来源于侵染双子叶植物的病毒卫星分子，开发该启动子应用于多种作物(包括禾谷类)的基因转化，应用前景将会十分广阔。


图I是中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的PClORF启动子的结构图。以β ClORF的翻译起始位点(ATG)为+1位；其中SCR代表卫星保守区，A-rich代表富含腺嘌呤的区域；图2是启动子表达载体构建图。克隆后的启动子片段分别经限制性内切酶HindIII/BamH I双酶切后插入表达载体pINT121同酶切位点，构建成启动子表达载体；图3是对照表达载体构建图。表达载体PINT121经限制性内切酶BamHI/EcoR I双酶切后产生的⑶S-NOS片段与BamH I/EcoR I双酶切后的pBINPLUS载体片段连接，构建成表达载体pBINGUS，其中pINT121用于阳性对照，pBINGUS用于阴性对照；图4是各启动子的瞬时表达⑶S活性分析。A，各启动子的多次重复⑶S活性；B，各启动子的相对平均GUS活性。A，B中pBINGUS为阴性对照，pINT121为阳性对照，η代表每个启动子的独立实验重复次数。通过统计软件SAS 8. O中的多重比较方法ANOVA中的LSD检验对实验数据进行差异显著性分析(p〈0. 05or P<0. 01)，误差线代表标准差；图5是全长启动子982 (a-g)及阳性对照pINT121 (h)的转基因染色图片。(a)根部横切面；(b)茎横切面；(c和e)根部；(d)叶横切面；(f)叶片背面；(g)整株植物小苗；(h)阳性对照植物小苗。c,皮质；x,木质部；pm,栅栏组织；sm,海绵组织；vb,維管束；svb,次级維管束。
具体实施例方式中国番爺黄曲叶病韋卫星的组成型表达启动子DNA序列为中国番爺黄曲叶病韋beta卫星分子的PClORF的缺失启动子SEQ ID NO: I、全长启动子SEQ IDNO: 2或串联启动子SEQ ID NO:3所示DNA序列。DNA构建体包括权利要求I所示的中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的β ClORF的缺失启动子SEQ ID NO: I、全长启动子SEQ ID NO:2或串联启动子SEQ ID NO:3，以及与之进行可操作连接的有效基因，其中所述有效基因包括杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真 菌基因、抗细菌基因或抗病毒基因。利用植物细胞表达杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗细菌基因或抗病毒基因的方法包括如下步骤(a)以可表达的方式将杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗细菌基因或抗病毒基因连接到中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的PClORF的缺失启动子SEQ IDNO: I、全长启动子SEQ ID NO: 2或串联启动子SEQ ID NO: 3所述的启动子DNA序列下游以获得重组DNA片段；(b)将该重组DNA片段插入植物表达载体中；(c)用上述重组表达载体转化植物细胞；(d)培养该植物细胞表达杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗细菌基因或抗病毒基因。利用植物细胞制备蛋白质的方法包括如下步骤(a)以可表达的方式将编码所需蛋白质的DNA连接到中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的PClORF的缺失启动子SEQ ID NO: I、全长启动子SEQ ID NO:2或串联启动子SEQID NO: 3所述的启动子DNA序列下游，获得重组DNA片段；(b)将重组DNA片段插入表达载体中，获得重组表达载体；(c)重组表达载体经农杆菌或基因枪法转化植物细胞，培养转化的植物细胞以表达所需的蛋白质；(d)从培养物中回收所需的蛋白质。表达载体含有中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的β ClORF的缺失启动子SEQID NO: I、全长启动子SEQ ID NO: 2或串联启动子SEQ ID NO: 3所述的启动子DNA序列，其中所述载体是适用于植物细胞的质粒载体、噬菌体或病毒，所述载体能够插入杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗细菌基因或抗病毒基因。本发明提出的对转化烟草植株的基因表达产物进行检测，以评价启动子的表达强度，并且分析启动子在植物体内表达的组织化学定位，使用了许多对本领域技术人员来说非常熟知的技术，其中包括用于GUS酶活性分析的荧光分光光度法，用于组织化学分析的半薄切片法等技木。本发明描述了能组成型表达的病毒卫星启动子，它是与中国番茄黄曲叶病毒Y25分离物相伴随的beta卫星分子(GenBank登录号AJ421619. 2)的PClORF启动子。本发明中以感染有中国番茄黄曲叶病毒Y25分离物的番茄植物总DNA为模板，克隆并鉴定了中国番茄黄曲叶病毒相伴随的beta卫星分子的PClORF缺失启动子、全长启动子以及串联启动子，序列表显示了各启动子的序列。中 国番茄黄曲叶病毒相伴随的beta卫星的i3C10RF全长启动子的全部天然序列有982个碱基对(启动子的序列为SEQ ID NO: 2)，根据beta卫星分子基因组的结构特征，对全长启动子进行缺失。缺失启动子982 Λ 776的特征是缺失全长启动子中-207至-982的片段(启动子的序列为SEQ ID NO: I)，串联启动子982 X 2的特征是全长启动子串联重复片段(启动子的序列为SEQ ID NO:3)，在启动子的活性分析中发现，这两个突变启动子仍保留了启动子活性(图4)。本发明描述了植物细胞中基因产物表达的方法。将已克隆的启动子与葡萄糖醛酸酶基因(GUS)融合构建植物表达载体，通过农杆菌浸润法使GUS基因在烟草植物细胞中进行瞬间表达；将构建后的植物表达载体通过叶盘法转入烟草细胞中，使GUS基因在烟草细胞中进行稳定表达。本发明还描述了植物细胞中GUS活性的鉴定和检测方法。在植物细胞的瞬间表达体系中，通过荧光光度分析来检测其表达活性。本发明中将全长启动子的表达载体982通过叶盘法转入烟草植株中，GUS组织化学染色后通过蓝色位点的表达部位进ー步鉴定其上游启动子的表达类型。结果表明，PClORF全长启动子982能够驱动⑶S基因在转基因植株根、茎、叶等器官中组成型表达。本发明中的中国番茄黄曲叶病毒beta卫星的β ClORF全长启动子可组成型表达所需要的任何异源基因。异源基因的例子包括杀虫毒素基因，除草剂抗性基因，抗真菌基因，抗细菌基因或抗病毒基因。本发明中将含有中国番茄黄曲叶病毒beta卫星的i3C10RF启动子和异源基因的构建体插入到ー种载体中，用该载体转化植物细胞，优选的载体对于植物而言可以是ー种农杆菌Ti质粒衍生物，该质粒衍生物通过农杆菌介导的双元载体技术导入植物细胞，这种技术是本领域内所熟知的。将已转化植物细胞培养于ー种合适培养基中，并再生出植株。本发明包括来自于中国番茄黄曲叶病毒beta卫星的β ClORF缺失启动子、全长启动子和串联启动子DNA序列以及含有以上序列的DNA构建体。同时，本发明还包括是中国番茄黄曲叶病毒beta卫星的β ClORF启动子的“功能等同物”的DNA序列，以及含有有效连接到异源基因上的这样的DNA序列的构建体。本发明还包括使用如本文所述的PClORF启动子的“功能等同物”赋予处于它们控制下的任何基因的组成型表达。本发明中使用的术语“启动子活性”是指当以该基因的可表达方式将有效基因连接到启动子的下游，并导入到宿主(植物细胞)中，该宿主显示具有在宿主内或宿主外生产该有效基因产物的功能。通常是将容易定性、定量检测的蛋白质编码基因(报告基因)连接至启动子的下游，然后将构建后的基因导入宿主内，检测表达蛋白情况，以此来确定是否存在特定启动子的活性以及其效カ如何。“缺失启动子”是指任何有缺失而仍具有启动子活性的中国番茄黄曲叶病毒beta卫星的PClORF启动子。“串联启动子”是指两个全长启动子串联并具有启动子活性的中国番茄黄曲叶病毒beta卫星的PClORF启动子。“功能等同物”是指在严格杂交条件下与ー个DNA序列互补的任何DNA序列，该序列与该參照物杂交并且有类似于中国番茄黄曲叶病毒beta卫星的β ClORF启动子的活性。采用下面的非限制性实施例对本发明作进ー步描述。实施例I中国番茄黄曲叶病毒beta卫星的β ClORF启动子片段的克隆以及序列测定
基本上按照Sambrook 等所述方法(Molecular Cloning: A LaboratoryManual,しold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory, NY,1989)实施分子技术。以感染中国番茄黄曲叶病毒的番茄植株为材料，用CTAB法提取植物总 DNA[Stewart et al.，BioTechniques, 1993，14:748-749]。预扩增的各启动子片段见图I。以植物总DNA为模板，通过特异性引物扩增中国番茄黄曲叶病毒beta卫星的β C10RF 的各启动子片段。引物 Fl (5’AAGCTTACACCTCTATTAGCCATAATAATC 3’，相应于 SEQID NO: I 中的 1-24 位，引入了 Hind III 位点)和 RL (5，GGATCCGTTTTATGCTGTGGATTATAC3’，相应于SEQ ID NO: I中的206-186位，引入了 BamH I位点)扩增缺失启动子(SEQ IDNO: I) ο 引物 FL (5，AAGCTTATACGTATGCATACGTATTC 3’，相应于 SEQ ID N0:2 中的 1-20位，引入了 Hind III 位点)和 RL (5，GGATCCGTTTTATGCTGTGGATTATAC 3’，相应于 SEQ IDN0:2中的962-982位，引入了 BamH I位点)扩增全长启动子(SEQID N0:2)。引物F2(5，GGATCCATACGTATGCATACGTATTC 3’，相应于 SEQID NO: 3 中的 983-1008 位，引入了 BamHI 位点)和 RL (5，GGATCCGTTTTATGCTGTGGATTATAC 3’，相应于 SEQ ID NO:3 中的 1950-1970位，引入了 BamH I位点)扩增串联启动子(SEQ ID NO:3)中的后半部分序列。扩增后的PCR 产物经 Hind III/BamH I (对于 SEQ ID NO: I 和 SEQ ID N0:2)或 BamH I (对于 SEQIDNO: 3)直接酶切后经QIAGEN凝胶纯化试剂盒回收目的片段，用Sanger双脱氧链终止法测序验证后用于载体构建。实施例2启动子表达载体及⑶S融合表达载体的构建用限制性酶Hind III/BamH I酶切消化双元表达载体pINT121 (该载体的构建见Liu等发表的论文，即Planta，2003，216:824-833)。将酶切后的缺失启动子、全长启动子片段插入对应的同酶切位点，构建为启动子表达载体(图2):缺失启动子为ρβα-982Λ776，全长启动子为pPCl-982。将BamH I酶切SEQ ID NO: 3部分序列插入相应酶切消化过的P β Cト982，即为串联启动子P β Cト982X2。用BamH I和EcoR I双酶切表达载体ρΙΝΤ121，切割下的⑶S-N0S片段插入到表达载体pBINPLUS (该载体的构建见van Engelen等发表的论文，即TransgenicResearch, 1995，4:288-290)的 BamH I/EcoR I 位点中，构建后的载体为 pBINGUS (图 3)，该载体作为阴性对照，载体PINT121作为阳性对照。实施例3农杆菌转化将各启动子构建物通过电击法导入农杆菌宿主细胞參照文献[Mattanovichetal. , Nucleic Acids Research, 1989，17:6747],具体方法如下:28°C, 200rpm条件下培养根癌土壤杆菌16h左右，用I. 5mL离心管取I. 5mL菌液，8000rpm离心30s后去残液，将沉淀用ImL ddH20充分悬浮，再8000rpm离心30s，重复以上步骤3次。去掉残液后将沉淀用200 μ LddH20悬浮，即为电击用农杆菌感受态。取200ng重组质粒至200 μ L感受态，轻打混匀，然后转移至电击杯中，置冰上。装好电击装置，电压为2500V，按住电击按钮，直到啪的一声即电击完毕。室温静止2min后加入800 μ LYEP培养基(10g/L酵母膏，10g/L蛋白胨，5g/L氯化钠)，28°C静置lh，然后28°C 200rpm振荡培养2h。取200 μ L菌液，分别涂布于含有卡那霉素(50 μ g/mL)和利福平(50 μ g/mL)抗生素的固体YEP培养基平板。28°C培养2天后，用特异性引物对其进行PCR鉴定，筛选阳性克隆。实施例4启动子的瞬间表达I)农杆菌的培养及诱导參照文献[Kapila et al. , PlantScience, 1997，122:101-108]将含有各启动子表达载体的农杆菌菌液接种于含相应抗生素的液体YEP培养基中，培养至对数生长期，离心收集菌体，重悬于MMA溶液(IOmmol/L2-(N-吗啉)-こ基磺酸(MES，pH 5. 6)、100 μ mol/Lこ酰丁香酮、10mmol/L氯化镁)，并调整菌液浓度使其0D_=1. 5，室温静置放置3h。 2)瞬间表达參照文献[刘兆明等，生物工程学报，2002，18卷4期411-414; Yanget al. , The Plant Journal, 2000，22:543-551]对植株叶片采取农杆菌浸润法。具体方法选取6-7周龄本氏烟植株中部未完全展开的叶片,取一支ImL的一次性注射器,摘掉针头，用针管靠压カ将500 μ L重悬菌液完全注入每片叶片的脉间细胞中。将农杆菌浸润和农杆菌注射后的植株于25°C恒温室中培养，光照周期为16/8h。60-72h后取样进行⑶S荧光活性分析。实施例5⑶S检测荧光光度測定法參照文献[Jefferson et al. , The EMBOJournal, 1987，6:3901-3907]将采样后的植株叶片经液氮研磨，加入3倍体积的⑶S提取液(50mmol/L 憐酸缓冲液 pH 7. 0,10mmol/I,こニ胺四こ酸ニ钠，0. l%(w/v)TritonX-100,
0.l%(w/v)十二烷基肌氨酸钠，10mmol/L β -巯基こ醇)，离心后取上清10 μ L与4-MUG(4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸)反应，荧光光度仪测定GUS活性。如图4，A为各个启动子构建物多次重复后(重复次数不小于6)测得的GUS活性，B为各启动子构建物的平均表达活性。实验数据通过SAS8. O软件的多次重复比较ANOVA的LSD方法进行分析，以阳性对照ΡΙΝΤ121的35S启动子活性为參照，结果表明缺失启动子982 Δ 776的活性是35S启动子活性的18. 76%，全长启动子982的活性是35S启动子活性的44. 01%,串联启动子982X2的活性是35S启动子活性的58. 62%。而且缺失启动子982 Λ 776，全长启动子982及串联启动子982 X 2与阳性对照PINT121的启动子活性之间均存在极显著性差异(Ρ〈0. OI)，具体数据见表I。表I
权利要求
1.ー种中国番茄黄曲叶病毒卫星的组成型表达启动子，其特征在于所述启动子DNA序列为中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的PCI ORF的缺失启动子SEQ ID NO: I、全长启动子SEQ ID NO: 2或串联启动子SEQ ID NO: 3所示DNA序列。
2.—种DNA构建体，其特征在于包括权利要求I所示的中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的PCI ORF的缺失启动子SEQ ID NO: I、全长启动子SEQ ID NO: 2或串联启动子SEQ ID NO: 3，以及与之进行可操作连接的有效基因，其中所述有效基因包括杀虫剂基因、除
3.ー种利用植物细胞表达杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗细菌基因或抗病毒基因的方法，其特征在于包括如下步骤 (a)以可表达的方式将杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗细菌基因或抗病毒基因连接到中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的PCI ORF的缺失启动子SEQ ID NO:I、全长启动子SEQ ID NO: 2或串联启动子SEQ ID NO: 3所述的启动子DNA序列下游以获 得重组DNA片段； (b)将该重组DNA片段插入植物表达载体中； (c)用上述重组表达载体转化植物细胞； (d)培养该植物细胞表达杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗细菌基因或抗病毒基因。
4.ー种利用植物细胞制备蛋白质的方法，其特征在于包括如下步骤 (a)以可表达的方式将编码所需蛋白质的DNA连接到中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的PCI ORF的缺失启动子SEQ ID NO: I、全长启动子SEQ ID NO: 2或串联启动子SEQID NO: 3所述的启动子DNA序列下游，获得重组DNA片段； (b)将重组DNA片段插入表达载体中，获得重组表达载体； (C)重组表达载体经农杆菌或基因枪法转化植物细胞，培养转化的植物细胞以表达所需的蛋白质； (d)从培养物中回收所需的蛋白质。
5.—种表达载体,其特征在于含有中国番爺黄曲叶病毒beta卫星分子的PCI ORF的缺失启动子SEQ ID NO: I、全长启动子SEQ ID NO: 2或串联启动子SEQ ID NO: 3所述的启动子DNA序列，其中所述载体是适用于植物细胞的质粒载体、噬菌体或病毒，所述载体能够插入杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗细菌基因或抗病毒基因。
全文摘要
本发明公开了一种中国番茄黄曲叶病毒卫星的组成型表达启动子。该启动子来自于中国番茄黄曲叶病毒相伴随的beta卫星分子。分离的启动子是该beta卫星分子的βC1ORF的部分缺失启动子、全长启动子及串联启动子序列。实验表明来自于中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的βC1ORF的启动子为组成型表达的启动子。本发明涉及了中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的βC1ORF的缺失启动子、全长启动子和串联启动子序列以及含有该βC1ORF缺失启动子、全长启动子和串联启动子序列的表达盒。本发明中的启动子可应用于植物抗病毒基因工程及植物转基因工程。
文档编号C12N15/82GK102732521SQ20121019784
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月13日 优先权日2012年6月13日
发明者吴建祥, 周雪平, 张洁, 钱亚娟 申请人:浙江大学