专利名称：苹果抗逆相关基因MdSIMYB1的克隆及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种苹果抗逆相关基因MdSIMYBl的克隆及其应用，具体涉及一种苹果抗逆基因MdSIMYBl的克隆、重组，及其转基因苹果、烟草在抗旱、抗盐和抗冷等逆境方面的分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。
背景技术：
苹果作为世界四大果树之一，是温带地区的主要栽培树种。在苹果的生长发育过程中，许多非生物胁迫是影响苹果地理分布和产量提高的主要限制因子，尤其是高盐、干旱和低温等，世界苹果生产国都把选育抗盐、抗旱、抗 寒等优质苹果新品种作为主要育种目标。由于苹果是多年生木本植物，遗传背景复杂、杂和度高、童期长、自交亲和性差等诸多问题给遗传育种带来了很大障碍，常规育种进展缓慢。近年来，苹果基因组的测序(Velasco等，2010)的完成、以及迅速发展的现代生物技术为解决这些问题开辟了新途径，通过基因工程技术有目的提高果树抗盐、抗旱、抗寒能力，成为果树遗传改良的重要研究方向，大量植物抗逆功能基因的分离和鉴定则为基因工程遗传改良提供了目的基因。MYB类家族是指含有MYB结构域的一类转录因子，它是最大的植物转录因子基因家族之一，参与植物次生代谢调控、激素和环境因子的应答，并对细胞分化、细胞周期、器官的形成以及植物叶片的形态建成具有重要的调节作用(Martin等，1997)。目前对MYB的研究主要集中在拟南芥、水稻上等少数模式植物上，而在果树方面研究甚少。由于诸多方面的原因，可耕土地面积越来越少，再加上世界范围内气候的异常变化，导致果树的种植面积和范围受到严重影响。挖掘苹果MYB基因并进行功能研究，为果树抗逆转基因育种提供潜在的有效候选基因，不但具有重要的理论意义，而且具有广泛的应用价值。苹果转基因育种多在苹果砧木上进行，而苹果砧木主要生活在地下，不开花坐果，减少了基因工程在果树应用上的争议。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种苹果抗逆相关基因MdSMYBl的克隆方法及核苷酸序列，同时提供了该基因在获得抗逆，尤其是在抗旱、抗盐、抗低温的转基因烟草和苹果中的应用，并可应用于生产其它具有明显抵抗干旱、盐碱和低温的转基因植物。本发明中提供的核苷酸序列来自苹果。本发明利用同源克隆和RACE技术获得了苹果新型抗逆境相关基因MdSIMYBl，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示，蛋白质氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。具体方法如下从经200mM NaCl盐处理24小时的嘎啦苹果组培苗中提取总RNA，反转录得到cDNA。根据国际基因库中已发布的拟南芥中MYB基因家族的保守氨基酸序列，设计兼并引物，进行常规聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)。将合适大小的PCR产物与PMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，筛选重组子，并进行测序分析确认；然后通过5'和3'末端快速扩增(Rapid-amplification of cDNA ends, RACE)技术分别获得5 ^和V端序列，并拼接成完整的cDNA序列。根据cDNA的V和Y端序列设计特异引物，以经200mM NaCl盐处理24小时的嘎啦苹果组培苗的cDNA为模板进行PCR扩增，得到cDNA全长序列。该基因的全长cDNA为999bp,其中包括711bp的开放阅读框(open readingframe, 0RF)。由此推得，该基因编码237个氨基酸，预测分子量约为26. 93kDa，等电点PI为8.03。将其氨基酸序列在国际基因库中检索，发现与已公布的MYB家族成员AtMYB63 (拟南芥，AK175344. I)、AtMYB72 (拟南芥，NM_104495. I)、AtMYBlO (拟南芥，NM_112118. 2)、VvMYB4 (葡萄，XM_002281466. 2)有较高的同源性，其氨基酸同源性分别为69. 23%,66. 35%、65. 38%,64. 42%。由此表明，经过上述克隆步骤得到了一个苹果中MYB基因，又因该基因与盐胁迫有关，所以将该基因命名为MdSIMYBl。该基因序列如下
序列表(l)SEQ. ID. NO. I 的信息(a)序列特征长度999bp类型核酸拓扑结构线性(b)分析类型cDNA(C)假设否(d)反义否(e)最初来源苹果(Malus domestica)(f)序列描述SEQ. ID. NO. Iatgagcacac tcgctaacag tctgcccgga gcgacaccgt atgtacattg ggtacggagg60 cggcagagaactcactgaat cggagataga ag atg gcgaa aaggactcag cggtgtgaga120 agacggtagc tgtgaagaagggtccatgga gtcctgagga ggatcacaag ttggtagctt180 acattcaaag atatggaatt tggaattggagtcggatgcc taaaccagct ggtctggcta240 ggtccgggaa gagttgtaga cttcgttggg tgaattacttaaggccggat attaagcgtg300 ggaacttcgg caaagacgaa gaggaaacca tacttgagtt gcatcaagcaataggaaacc360 gatggtctgc tattgcagca aggcttcccg gaagaacgga caatgagatt aagaattact420ggcacaccca catgaaaaaa c gcttcaagg cggggattga atcagtacac gaagaagcaa480 aagggtccggtgacaaggaa gccagcaaga acaagttatc tgaagctgga caactctttc540 ttgttgatga agetacgaaggtagcateat taaagtcgga ggcaacttgt tcagcttcat600 cgagcgtata ctttcccgtt tgggaattcgacgatcaaaa aggccagatt gcagagcaaa660 gtgtttgtgc atctgatgtc acatttggtg agcttcaaagtttggattct caagtgtggc720 agcaagagcc tatatttcca tgtgattcct acattaatca tgtcaccagtgattactggg
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说明:透明方框中的ra表示起始密码子，而灰色方框内的M表示终止密码子。(2 ) SEQ. ID. NO. 2 的信息(a)序列特征长度237个氨基酸类型氨基酸拓扑结构线性(b)分析类型蛋白质(c)序列描述SEQ. ID.NO. 2MET Ala Lys Arg ThrGln Arg Cys Glu Lys Thr Val AlaVal Lys151015Lys Gly Pro Trp SerPro Glu Glu Asp His Lys Leu ValAla Tyr202530He Gln Arg Tyr GlyHe Trp Asn Trp Ser Arg MET ProLys Pro354045Ala Gly Leu Ala ArgSer Gly Lys Ser Cys Arg Leu ArgTrp Val505560Asn Tyr Leu Arg ProAsp He Lys Arg Gly Asn Phe GlyLys Asp657075Glu Glu Glu Thr HeLeu Glu Leu His Gln Ala He GlyAsn Arg808590Trp Ser Ala He AlaAla Arg Leu Pro Gly Arg Thr AspAsn Glu95100105He Lys Asn Tyr TrpHis Thr His MET Lys Lys Arg PheLys Ala110115120Gly He Glu Ser ValHis Glu Glu Ala Lys Gly Ser GlyAsp Lys
125130135Glu Ala Ser Lys AsnLys Leu Ser Glu Ala Gly Gln LeuPhe Leu140145150Val Asp Glu Ala ThrLys Val Ala Ser Leu Lys Ser GluAla Thr155160165Cys Ser Ala Ser SerSer Val Tyr Phe Pro Val Trp GluPhe Asp170175180Asp Gln Lys Gly GlnHe Ala Glu Gln Ser Val Cys AlaSer Asp185190195Val Thr Phe Gly GluLeu Gln Ser Leu Asp Ser Gln ValTrp Gln200205210Gln Glu Pro He PhePro Cys Asp Ser Tyr He Asn HisVal Thr215220225Ser Asp Tyr Trp ValSer Leu He Asp Lys Thr Gly
230235本发明提供了苹果逆境抗性相关基因MdSIMYBl在烟草、苹果和其它植物中应用的方法，可提高转基因植物抵抗干旱、低温和盐碱等逆境的能力。步骤为(a)利用如上所述的MdSMYBl基因，将cDNA序列置于CaMV 35S启动子之下，构建植物表达载体。
(b)采用本领域熟知的方法，如农杆菌介导的方法将构建的表达载体导入植物细胞，得到转基因植株。本发明涉及一种植物表达载体，包含核苷酸序列SEQ. ID. NO. 1，用于提高植物抗逆境能力，尤其是抗干旱、低温和盐碱的能力。本发明涉及将上述植物表达载体导入植物细胞中，导入方法是本领域人员熟知的农杆菌介导转化法，得到抗干旱、低温和盐碱的转基因植物。基于草本植物烟草Nc89生长速度快、生活周期短、离体培养再生能力强、遗传转化效率高，而木本植物苹果生活周期长，遗传转化效率低等特点，在下述实例中以烟草Nc89和苹果两种植物为例对本发明进行了详细的说明，但本发明中MdSIMYBl基因及含有该基因的植物表达载体也可以用于生产其它提高抗逆境能力的转基因植物。苹果为多年生木本植物，通过常规育种选育抗性品种周期长。本发明从苹果中分离到了一个R2R3类型的MYB家族基因MdSMYBl，通过在烟草和苹果中转基因功能验证表明它在抵抗外界干旱、低温和高盐中有明显作用。而转基因烟草、苹果抗逆性的提高，提供了一种新的、快速的育种途径，尤其是在转基因苹果砧木中，MdSIMYBl基因的发掘不仅能为苹果抗逆基因工程提供新的基因源，丰富植物抗逆基因工程理论体系，而且对于培育其它植物的抗逆种质材料(包括一年生植物和多年生木本植物)也具有重要的现实意义。本发明采用离体叶片接种法对获得的T3代转基因烟草和苹果进行抗逆能力分析发现，转基因烟草和苹果中MdSIMYBl的过量表达能显著提高其抗干旱、低温和盐碱的能力。植物一生都生活在各种各样的逆境条件中，可将该基因转化苹果、梨、杨树等木本植物，或小麦、玉米等农作物(草本植物)，提闻转基因植株的抗逆境能力，提闻其广量和品质，具有重大的经济效益和社会价值。
四
图I :苹果中MdSIMYBl蛋白结构保守域示意图及不同R2R3类型的MYB家族植物的氨基酸序列的同源性比较。A.苹果的MdSIMYBl蛋白结构保守域示意图；B.不同R2R3类型的MYB家族植物的氨基酸序列的同源性比较。其中，atMYBlO (拟南芥NM_112118. 2)、atMYB63 (拟南芥AK175344. I)、atMYB72 (拟南芥 ΝΜ_104495· I)、VvMYB4 (葡萄 ΧΜ_002281466· 2)，R2、R3 分别表示MYB家族基因的特征结构域。图2 :苹果中MdSMYBl蛋白的进化树分析。其中，atMYBlO(拟南芥 ΝΜ_112118· 2)、atMYB72 (拟南芥 ΝΜ_104495· I)、atMYB63(拟南芥 AK175344. I)、atMYB6 (拟南芥 ΝΜ_117014· 2)、atMYB94(拟南芥 ΝΜ_114628· 3)、atMYB112(拟南芥 ΝΜ_103696· 2)、atMYB13(拟南芥 ΝΜ_100499· I)、VvMYB4 (葡萄XM_002281466. 2)、GmMYB88 (大豆 DQ822902. I)、GmMYB4(大豆 ΝΜ_001254089· I)、0sMYB4(水稻 D88620. I), MdMYB23(苹果 DQ074471. I)、NtLBM4 (烟草 AB028652. I)、NtMYBl (烟草U72762. I), Rr-MYB17 (玫瑰 FR828550. I)。图3 =MdSIMYBl基因在苹果不同组织中的相对表达量，及在不同逆境处理条件下该基因的相对表达量。A. MdSMYBl基因在嘎啦苹果不同组织(根、叶、茎、花、幼果)中的相对表达量；BI B3.分别经 200mM NaCl、4°C低温(chilling)、干旱(dehydration)处理 0h、6h、12h、24h、48h、72h嘎啦苹果组培苗，MdSMYBl基因的相对表达量。其中，根(root)、叶(leave)、莖(stem)、花(flower)、幼果(fruit) ；h 表示小时。图4 :野生型和过量表达MdSMYBl的转基因烟草5周苗经不同逆境处理后的生长情况。A、野生型烟草和转基因烟草株系的半定量RT-PCR检测；B1、正常管理条件下培养5周烟草生长情况；B2.生长量一致的5周烟草苗，经200mM NaCl处理12天，正常浇水管理 8天后的生长情况；B3.生长量一致的5周烟草苗，连续15天不浇水做干旱处理，浇水3天后的生长恢复情况；B4.生长量一致的5周烟草苗，4°C低温处理6天，25°C正常温度培养3天后的生长情况。其中，WT :对照；M1 M8 :过量表达的转基因株系。图5 :培养2周的生长量一致的嘎啦苹果组培苗和转基因组培苗(MdSIMYBl基因过量表达或抑制表达)，经不同逆境处理后的生长情况。
A、野生型苹果和转基因苹果株系(抑制表达或过量表达)的半定量RT-PCR检测；BI.在添加200mM NaCl的MS培养基上生长2周的情况；B2.在添加6%PEG MS培养基上生长2周的情况；B3.在4°C低温条件培养7天，22°C正常温度恢复4天的生长情况。其中，WT :对照；RT1-RT2:抑制表达的转基因株系；T1 T12 :过量表达的转基因株系。图6 :生长2个月且长势一致的嘎啦苹果生根苗和转基因生根苗(MdSMYBl基因过量表达或抑制表达)，经不同逆境处理后的生长情况。A、经200mM NaCl处理3次(3天处理I次)，正常管理至20天的生长恢复情况；B.连续15天不浇水做干旱处理，正常浇水管理6天后生长恢复情况；C. 4°C低温条件培养7天后，22°C正常温度培养10天的生长恢复情况。其中，WT :对照；RT2:抑制表达的转基因株系；T1、T2、T12 :过量表达的转基因株系。五、具体实例方式以下结合具体实例，对本发明进行详细说明。实例I :苹果MdSMYBl基因的克隆。一)利用CTAB法提取总RNA，具体方法如下I)取I. 5g经200mM NaCl盐处理24小时的嘎啦苹果组培苗，放入预冷的研钵，加液氮磨碎，转入预冷的50ml离心管中；2)迅速加入IOml预热到65°C的提取缓冲液(其中PVP和巯基乙醇现用现加)，轻轻混匀，65°C水浴中O. 5小时；提取缓冲液
权利要求
1.一种苹果MdSMYBl基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。
2.根据权利要求I所述的一种苹果MdSIMYBl基因，其特征在于该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
3.如权利要求I所述的一种苹果MdSIMYBl基因在烟草中的应用，能提高转基因烟草抗干旱、抗盐和抗低温能力。
4.如权利要求I所述的苹果MdSIMYBl基因在转基因苹果中的应用，能提高转基因苹果抗干旱、抗盐和抗低温的能力。
全文摘要
本发明涉及一种苹果抗逆相关基因MdSIMYB1的克隆及其应用，具体公开了一种如SEQ.ID.NO:1所示的苹果MdSIMYB1基因的克隆方法及其应用；本发明从苹果中分离到了MdSIMYB1基因，该基因在烟草中过量表达能提高转基因烟草的抗旱、抗盐和抗冷等逆境能力；MdSIMYB1基因在苹果中过量表达能提高转基因苹果株系的抗旱、抗盐和抗冷等逆境能力；而抑制该基因的表达，可导致转基因苹果植株的抗旱、抗盐和抗冷等逆境能力的下降；将MdSIMYB1基因转入苹果提高其表达水平，能提高苹果的抗逆能力。
文档编号C12N15/82GK102719449SQ201210197919
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月15日 优先权日2012年6月15日
发明者曹忠慧, 王荣凯, 由春香, 郝玉金 申请人:山东农业大学