专利名称：一种提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶热稳定性的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高P -I, 3-1，4-葡聚糖酶热稳定性的方法，尤其是一种利用HNO2修饰P -I, 3-1，4-葡聚糖酶的化学修饰方法。
背景技术：
^ -葡聚糖是构成禾本科植物细胞壁的一种非淀粉性多糖，在大麦、黑麦、高梁、大米和小麦的胚乳细胞壁中含量尤其高。谷物3 -葡聚糖都是由高达上千个3-D-葡萄糖残基通过3-1，3或3-1，4糖苷键排列成线状的葡聚糖，其种类随两种键的比例和混合链接片段的长度不同而变化。^ -葡聚糖的分子特点决定了其可以很大的分子量溶解于水中，其浓度越大，溶液的粘度也就越大，这给啤酒酿造工业和饲料工业都带来了很大问题。在啤酒酿造工业中， 因所用的主要原料麦芽中含有大量3 -葡聚糖，往往会造成麦汁粘度过大致使过滤困难，延长糖化醪过滤时间，降低浸出物含量，而且容易使成品啤酒产生早期雾浊从而影响保质期。^ -I, 3-1，4-葡聚糖酶是一类具有严格底物专一性的葡聚糖水解酶，其只切断^ -葡聚糖中3-0-吡喃葡萄糖取代基的P -I, 4-糖苷键(P -I, 3-1，4-键型)，产物主要是二糖3_0_0 -纤维二糖-D-卩比喃匍萄糖(G4G3G)和四糖3-0-0 -纤维二糖-D-卩比喃匍萄糖(G4G4G3G)。在糖化过程中加入高活性耐热P _1，3_1，4-葡聚糖酶能够有效解决上述的酿造过程中过滤速度慢、清酒过滤酒损高、纯生啤酒过滤膜堵塞以及成品啤酒冷雾浊的一系列问题，在工业上具有重要应用价值。在啤酒酿造糖化过程中,添加￠-1, 3-1，4-葡聚糖酶可以将3 -葡聚糖降解为低聚糖和葡萄糖，有效降低麦汁粘度，大大提高过滤速度，增加生产效率，提高啤酒非生物稳定性。^ -I, 3-1，4-葡聚糖酶具有重要的工业应用价值，因此国内外研究者对其进行了大量研究。目前￠-1, 3-1，4-葡聚糖酶在啤酒糖化过程中使用已有一定应用，但是目前市场上国外的几家酶制剂公司如诺维信、DMS研发生产的￠-葡聚糖酶制剂价格昂贵，而目前国内也有部分酶制剂公司生产3 -葡聚糖酶制剂，但其水平远不及国外酶制剂公司，且^ -葡聚糖酶制剂的生产菌种及工艺都是商业机密，国内研发速率缓慢，因此国内市场在很大程度上依然依赖进口。而且，野生菌来源的￠-1, 3-1，4-葡聚糖酶的活性及热稳定性均不能达到工业应用要求，不适宜大量应用于工业生产。酶的化学修饰可以在无需蛋白三维结构信息的情况下引入所需基团，扩大酶的应用范围，并且化学修饰具有简单、快速、经济的优点，但是在修饰过程中可能会破坏酶分子的结构，降低酶的活性。所以就非常有必要研究酶化学修饰的条件，包括化学修饰剂、反应温度和反应时间等，从而保持或尽量减少酶的活性的损失。
图I被修饰的酶与未被修饰酶的最适温度曲线。
□:修饰酶的最适温度曲线；▲天然酶的最适温度曲线图2被修饰的酶与未被修饰酶的最适pH曲线。□:修饰酶的最适pH曲线；▲:天然酶的最适pH曲线图3被修饰的酶与未被修饰酶的T50值测定曲线□:修饰酶的最适pH曲线；▲:天然酶的最适pH曲线图4被修饰的酶与未被修饰酶的
t (1/2，60。。) 值测定曲线
□:修饰酶的最适pH曲线；▲:天然酶的最适pH曲线
具体实施例方式I、^ -I, 3-1，4-葡聚糖酶的制备根据NCBI数据库中淀粉液化芽孢杆菌P -I, 3-1，4-葡聚糖酶基因序列(M15674)。通过全基因合成，将目的基因bgl连接到质粒pET28a(+)中并将质粒导入大肠杆菌BL2KDE3)中，挑选验证后进行发酵培养。培养基各组分和培养条件如下(g/L):蛋白胨10，氯化钠10，酵母提取物5，终浓度50 u g/mL的卡那霉素。在37° C恒温培养至0D_等于I. 0后加入终浓度为IOmmol的IPTG和0. 0336mmol的a -乳糖共同诱导，在24°C下培养24h，对发酵液进行离心，然后将上清液通过IOkDa蛋白超滤管浓缩，最后得到IOOy g/mL-200 y g/mL的3-1，3-1，4-葡聚糖酶液。2、化学修饰剂亚硝酸(HNO2)溶液的制备。具体过程和步骤如下称取13. 8gNaN02，溶于少量的水中，最后用容量瓶定容至1L，即可得到0. 2MNaN02溶液；用量筒量取18mL浓盐酸，溶于少量的水中，最后用容量瓶定容至1L，即可的到0. 2MHC1溶液；将NaNO2溶液和HCl溶液在有盖子的棕色玻璃容器中等体积混合，用振荡器或搅拌器使之混合均匀，反应后生成浓度为0. IM HNO2溶液。将反应后生成的0. IMHNO2溶液放在4°C冰箱中，待用。3、^ -I, 3-1，4-葡聚糖酶的化学修饰将170ul0. IM pH6的磷酸缓冲液加入到150 y LP -1，3-1, 4_葡聚糖酶酶液中，然后加入新鲜制备的0. IMHNO2至终浓度为IO-IOOmM,将混合好的溶液放在40°C的恒温水浴锅中，反应15-120min。其中，所述0 -I, 3-1，4-葡聚糖酶酶液浓度最佳为100 u g/mL-200 u g/mL, HNO2的最佳浓度为10-30mM，最佳反应时间为30min。4、^ -I, 3-1，4-葡聚糖酶酶活的测定酶活定义取单位体积酶液于40°C和pH 6. 5条件下，每分钟水解P -葡聚糖生成相当于Iymol的葡萄糖还原物质的量为I个酶活力单位，以U/mL表示。改良AZO方法将发酵液离心后取上清并适当稀释，取0. ImL加入0. 4mL经40°C预热的蓝色葡聚糖底物(使用前和0. 02mol/L的pH6. 5的磷酸缓冲液等体积混合)，在40°C精确反应IOmin,然后每个反应样品中加入3. OmL沉淀液,混勻后10，000r/min离心5min,取上清液，使用Icm的玻璃比色杯准确测定其在590nm处的吸光值，以0. ImL的去离子水代替离心发酵液上清做空白对照。每个样品做3个平行样。酶活计算公式如下^ -葡聚糖酶酶活(U/mL)=稀释倍数 X (0D590+0. 0558) / (0. 0012 X 180)5、修饰酶的酶学性质研究
A.最适温度的测定测定范围从30°C到65°C，分别测定不同温度下的酶活。将酶活最高的作为100%，然后计算其它温度下的相对酶活，结果如图I。B.最适pH的测定测定范围从pH4. 5到pH8，，分别测定不同pH条件下的酶活，将酶活最高的作为100%，然后计算其它pH下的相对酶活，结果如图2。C.温度稳定性的测定得到的0-1，3-1，4_葡聚糖酶酶液分别在251 8(TC的水浴中保温lOmin，立即冰浴20min，测定酶活力。记酶溶液不经过钝化处理时的酶活力为100%，以不同温度对相应的残余酶活力百分比作图，求出酶活力丧失50%时的温度，即该酶的半失活温度！*。定义￠-1, 3-1，4-葡聚糖酶特定温度下酶活丢失一半的时间为其半衰期，记为t(1/2,rc)，结果见图3-4。通过本方法制备的@ -I, 3-1，4-葡聚糖酶，其T5tl值与t(1/2，6crc)分别提高了 4. 76% 和62. 1%，热稳定性明显提高，最适温度和最适pH变化不大，更适合工业应用，本发明所述的化学修饰剂价格便宜，用量少，成本低。
权利要求
1.一种提高￠-1, 3-1，4-葡聚糖酶热稳定性的方法，其特征在于通过亚硝酸HNO2对& -I, 3-1，4-葡聚糖酶进行化学修饰。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述P-I, 3-1，4-葡聚糖酶的浓度为100 V- g/mL-200 u g/mL,所述亚硝酸的浓度为10_30mM。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于修饰工艺为40°C恒温处理15-120min。
全文摘要
本发明提供了一种提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶热稳定性的方法，属于酶工程领域。通过HNO2对β-1,3-1,4-葡聚糖酶进行修饰，β-1,3-1,4-葡聚糖酶的热稳定性得到大幅度提高，在啤酒行业麦汁糖化过程中应用前景广阔。该酶生产方法简便，成本较低，具有广阔的工业应用前景。
文档编号C12N9/24GK102719416SQ20121019769
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月15日 优先权日2012年6月15日
发明者刘春凤, 李崎, 李永仙, 王金晶, 郑飞云, 钮成拓 申请人:江南大学