专利名称：一种优化的硫化物醌氧化还原酶基因及其表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种优化的硫化物醌氧化还原酶基因及其表达载体。
背景技术：
畜牧业规模化养猪产生的废气对周围环境造成了较大的污染，而H2S是产生恶臭气味的重要因素之一，可使畜禽生产性能下降，造成幼仔中毒死亡，给农业生产和人民生活都造成较大的影响。随着转基因技术的发展，培育减排H2S的环境友好型转基因猪便成为可能，它可以从根本上缓解养殖场产生的环境问题。生活在潮湿恶臭环境中的光合细菌荚膜红细菌capsulatus)中产生一种膜结合蛋白_硫化物醌氧化还原酶(Sulfide-quinone reductase, SQR),可以利用H2S作为氢供体为光合细菌提供能量。 虽然荚膜红细菌可以产生SQR蛋白，但因该细菌生长条件较难控制，将其进行工业化生产仍然受到限制，所以如何制备适于工业化生产的重组细菌成为目前研究的课题。外源蛋白的表达水平与多种因素有关，如启动子和终止子的强弱、质粒拷贝数、蛋白稳定性、翻译效率，表达系统和宿主的兼容性等。其中，宿主密码子偏好性是影响外源蛋白表达的重要因素之一。无论在原核表达系统还是真核表达系统，稀有密码子过多会严重影响蛋白的表达，导致表达水平急剧下降；而偏离规范的密码子，即不同的生物能把同种密码子识别为不同的氨基酸，将直接导致了基因不能进行异源表达或者只表达出无活性的蛋白质。目前，克服制约瓶颈现象解决的主要策略是在不改变所编码蛋白的氨基酸序列基础上，通过序列定点突变或全基因合成手段，从基因本身更改特有的稀有密码子从而实现功能蛋白的异源表达。而对于SQR蛋白的基因优化目前还属于空白。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种优化的硫化物醌氧化还
原酶基因。本发明的另一目的是提供上述优化的硫化物醌氧化还原酶基因的表达载体。本发明通过以下技术方案实现上述目的
一种优化的硫化物醌氧化还原酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。本研究对sqr基因进行优化的时候兼顾以下几个方面尽量使用偏好密码子，以提高mRNA的翻译效率；降低GC含量，调整基因AT含量，防止提前终止；去除sqr基因中影响mRNA有效翻译和稳定性的二级结构；除去使mRNA不稳定和降解的序列和结构。实验表明优化后的基因在CHO细胞系中转录水平和翻译水平均高于其原始基因序列。优化后的sqr基因片段核苷酸序列与原序列比对相似性为81%，427个氨基酸中有228个氨基酸的密码子得到优化，优化率达到54%。一种硫化物醌氧化还原酶的表达载体,该表达载体是由优化的硫化物醌氧化还原酶基因插入到表达载体(也称出发载体)的多克隆位点构建而成。所述出发载体优选原核表达载体为大肠杆菌表达载体pRSET A、或真核表达载体pcDNA3. I。一种转基因细胞系，是由上述硫化物醌氧化还原酶的表达载体转染到宿主细胞构建而成。本发明的优化的硫化物醌氧化还原酶基因在制备转基因动物中的应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
本研究对光合细菌(荚膜红细菌)中的硫化物醌还原酶(sqr)基因进行了优化，使其在表达量上高出正常菌株，从培育环境友好型动物新品种的角度出发，为转基因猪的制备探路，以期从转基因全新的角度降低养殖场中硫化氢气体的排放，从根本上解决养猪产业中的环境污染问题。
图I.荚膜红细菌sqr2基因PCR扩增结果，其中1、2为sqr2基因；M :DNA分子量标准。图2 . sqr基因的信号肽预测。图3. sqr基因优化前后的CAI值及密码子频率分布。图4. sqr基因优化前后mRNA 二级结构。图5.重组质粒pRSET A-sqr的菌液PCR鉴定，I 阴性对照；2飞=PCR扩增重组质粒pRSET A-sqr ；M DNA分子量标准。图6.不同诱导时间的pRSETA-sqr融合蛋白表达。0 :IPTG诱导空载体pRSETA的表达；M :分子量标准蛋白Marker ;1 7 :IPTG分别诱导0、2、4、5、6、7、8h时pRSETA-sqr的表达。图7. SQR原核表达产物的Western-blot验证，M :分子量标准蛋白Marker ；1 pRSETA 载体；2 pRSETA-sqr2 融合蛋白。图8. 15min内不同浓度的decyl_UQ反应情况(A)和双倒数法求SQR酶的Km值(B)。图9.真核表达载体 pcDNA3. I-SQR(A)与 pcDNA3. 1-SQR2 (B)的构建。M DL5000marker ； I :重组载体；2 :重组载体的Xho I和Kpn I双酶切结果。图10. CHO细胞的总RNA抽提。图11. sqr与sqr2的mRNA相对表达。图 12. pcDNA3. 1-sqr 与 pcDNA3. I_sqr2 融合蛋白表达，SQR pcDNA3. 1-sqr 融合蛋白；SQR2: pcDNA3. I_sqr2融合蛋白；B pcDNA3. IB空载体；L :未进行转染的CHO细胞。图13. sqr2转基因小鼠总RNA抽提结果。图14. sqr2基因在转基因小鼠不同组织的表达情况，1_13分别为心、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、肠道、肌肉、腮腺、颌下腺、舌下腺、水、阳性质粒。图15. Western blot验证SQR蛋白在转基因小鼠各组织的表达情况，a (_)、c(-):转基因阴性小鼠；b (+)、d(+):转基因阳性小鼠。图16. Western blot验证SQR蛋白在转基因小鼠各组织的表达情况的灰度值分析。图17.小鼠代谢收集的气体图谱代谢产生的气体(A)，粪便发酵产生的气体(B)。
图18.小鼠代谢和粪便发酵产生的气体中H2S含量分析，其中A图为小鼠代谢产生气体中H2S含量，(NaHS-(+):饲喂日常饲料的转基因阳性鼠；NaHS-(-):饲喂日常饲料的转基因阴性鼠；NaHS+(+):饲喂添加0. 56 u mol/kg NaHS饲料的转基因阳性鼠；NaHS+(-):饲喂添加0. 56 u mol/kg NaHS饲料的转基因阴性鼠。B图为粪便发酵产生的气体中H2S含量，其中，(NaHS-(+):饲喂日常饲料的转基因阳性鼠；NaHS-(-):饲喂日常饲料的转基因阴性鼠；NaHS+(+):饲喂添加0. 56 u mol/kg NaHS饲料的转基因阳性鼠；NaHS+(-):饲喂添加0. 56 u mol/kg NaHS饲料的转基因阴性鼠。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步解释本发明，但实施例不对本发明构成任何限制，实施例中如无特殊说明，均为本领域常规实验技术。实施例中所用生物材料来源如下
荚膜红细菌{Rhodobacter capsulatus ):购于广东省微生物研究所。pMD18-T vector、pMD20_T vector、大肠杆菌表达载体pRSET A、大肠杆菌感受态细胞BL21 (DE3)、DH5a感受态细胞均购自Takara公司。真核表达载体pcDNA3. I购自广州英伟创津公司。实验所用的Fvb和ICR小鼠购自广州赛业公司。实施例I
一、荚膜红细菌sqr基因的克隆 购买的荚膜红细菌进行复苏扩大培养。参照GenBank 上荚膜红细菌 DSM155(Accession No. X97478. 2)的 sqr 基因序列，利用primer5. O、Genetool等软件设ii^一对引物SI
F :5’ GAGCTGGCCGGTCTGAACTTC 3’(SEQ ID NO:2);
R:5’ CGCGCCTGTCCTTCGCCTCCGTGACA 3’ (SEQ ID NO:3)。利用上述引物，以提取的荚膜红细菌基因组DNA为模板，常规PCR扩增sqr基因。扩增产物电泳检测结果如图1，可见一条约1550bp的条带。按Omega公司PCR产物纯化回收试剂盒说明书来进行PCR产物的回收和提纯，经测序，片段长度为1547bp，其中包括1284bp的sqr基因全长⑶S。二、sqr基因的信号肽预测及密码子优化
将克隆所得的sqr基因通过网上数据库SignalP 4. 0 Sever信号肽预测(http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)和DNAStar序列分析软件对基因产物进行信号妝的预测。为使sqr基因在小鼠体内得到更高水平的表达从而更好的发挥功能，根据sqr在小鼠中表达的密码子使用偏好性，使用GenScript稀有密码子分析软件对克隆所得的sqr基因进行优化设计，提高密码子适应指数CAI值。同时，在sqr基因5'端分别添加猪腮腺蛋白基因的信号肽。SignalP 4.0预测结果中，C-Score预测待测氨基酸序列可能的切割位点，而且信号肽切割位点的C值最大。S-Score与C-Score结合起来更能准确预测切割位点。切割处的Y-Score对应的S值在曲线的波峰(谷)；C值峰值大。S-Mean是S值的平均数，而D-Mean是S-Mean和Y-Max的简单平均数，是预测待测蛋白氨基酸序列为分泌型蛋白或非分泌型蛋白的标准。SignalP4. 0预测结果显示(图2):从荚膜红细菌中扩增得到的SQR没有信号肽，非分泌型蛋白。故在对其进行优化时，5'端添加了猪腮腺蛋白的信号肽。sqr基因中携带稀有密码子，会降低在小鼠体内的转录水平和翻译效率。根据小鼠对密码子的偏爱性，将sqr基因进行了优化，得到的新序列定为sqr2(SEQ ID NO: I)。序列比对结果显示与sqr序列的相似性为81%，氨基酸序列未变。427个氨基酸中有228个氨基酸的密码子发生优化，优化率达到54%。为提高sqr基因在小鼠体内的表达水平，预测sqr2的CAI值由0. 79提高到0. 81(图3)，经过密码子偏好性改造，GC含量得到了优化，sqr基因的GC含量(GC%)由原来的64. 23%降为54. 95%，去除了一些重复序列，打破了一些茎环结构(图4)，避免其影响与核糖体结合的mRNA的稳定性，延长了 mRNA的半衰期。sqr2全长基因序列为直接化学合成。
三、sqr2在大肠杆菌中的表达 I. pRSET- sqr2表达载体构建
以荚膜红细菌基因组DNA为模板，以S2为引物，常规PCR扩增sqr2基因。F: 5，CCGCTCGAGATGGCTCATATCGTGGTTCTG 3，(SEQ ID NO:4，下划线部分为ZAo I酶切位点)；
R: 5’AACTCCAGTTACCCCTTCTTCACGGCCTTCAG3，(SEQ ID NO: 5，下划线部分为I 酶切
位点)。PCR 反应程序为94°C预变性 3 min，I 个循环；94°C 30 s，61°C 30s,72°C 90s, 29个循环；72°C后延伸8 min。PCR产物回收，与pMD18_T simple载体克隆连接构建成克隆载体T_sqr2进行克隆扩增，培养后选择经鉴定正确的阳性T_sqr2菌抽提质粒(按Omega Plasmid Kit试剂盒操作)。将质粒pRSET A与T_sqr2用通o I和I限制性内切酶进行双酶切。酶切产物连接，构建成原核表达载体pRSET-sqr2，转化BL21 (DE3)感受态细胞，用Amp+抗生素平板进行筛选，随机挑选10个单菌落用特异性引物利进行PCR鉴定，在约1300bp处均出现一条亮带，与预期大小相符(图5，其中泳道I为阴性对照)。2.重组质粒在大肠杆菌中的表达
将重组表达质粒pRSETA-sqr2和空质粒pRSET A转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细菌，涂板、挑囷；
2)在含Amp的LB培养基中371振荡培养过夜后，取空载体的菌液和重组菌分别按1:100体积比接入含氨苄青霉素的3 mL和30 mL LB培养基中，220 r/min、37 °C振荡培养;
3)测0D600值为0.4 0. 6时，分别取出3 mL重组菌液/管，共7管(包含空载体pRSETA菌液)，并均加入0.4 mmol/L的IPTG 37 °C继续培养l_8h，分别在诱导2、4、5、6、7、8h时各取I管。另外取I mL未经IPTG诱导的菌液对照；
4)将表达后的菌液按6500r/min离心3. 5 min，弃上清，加入80 u LI X电泳上样缓冲液悬浮菌体，于各EP管中混匀，混匀后100°C煮沸5 min,短暂离心，吸取上清8 y L点样，进行12% SDS-PAGE电泳；5)电泳结果见图6，不同诱导时间的全菌体经12% SDS-PAGE后染色，与空载体对照菌和未诱导菌相比，均在相对分子量约为50kD处出现新的蛋白带，说明SQR融合蛋白在大肠杆菌中表达，随诱导时间的延长，融合蛋白相对含量呈递增趋势，诱导6h表达产量达最高值，诱导时间再延长，表达产量不再增加。由此可见，用IPTG作为诱导物时，最佳诱导时间为4 h。将pRSET A-sqr2表达的融合蛋白命名为pRSET A-SQR06)将0.4 mmol /T, IPTG诱导表达6 h得到的SQR融合蛋白进行Werstern-blot检测，His标签抗体能特异与SQR融合蛋白上的His标签结合，在大约50 KDa处检测到重组菌液中SQR的表达(图7)。3. SQR蛋白的酶活分析
测定0D275 nm处添加不同泛醌浓度时SQR催化decylubiquinone (decyl-UQ)的反应情况，绘制标准曲线，随后测定在不同底物浓度下分析SQR蛋白酶的活性，发现该酶在Na2S的存在下有一定的消化decyl-UQ的能力(图8)。根据双倒数法计算出该酶的Km 4 (图8)。 实施例2 sqr基因优化前后在CHO细胞系中的表达
真核表达载体pcDNA3. I_sqr/sqr2的构建设计含有通01和治粘性末端的序列引物S3，序列如下
F: 5' -CCGCTCGAGATGTTTCAACTTTGGAAACTTGTTTTCTTGTGCGGTCTGCTCATTGGGACCTCAGCGTCTATGGCTCATATCGTG -3' (SEQ ID NO:6，ZAo I);
R: 5' - CGGGGTACCGACCCCTTCTTCACGGCCTT -3' (SEQ ID , Kpn I)。分别以sqr和Sqr2基因序列为模板，S3为引物，进行常规PCR扩增。扩增产物经克隆载体克隆后分别与质粒pcDNA3. I进行双酶切，酶切产物用连接酶连接，构建成新的表达载体 pcDNA3. 1-sqr 和 pcDNA3. I_sqr2。对构建的真核表达重组载体pcDNA3. l_sqr和pcDNA3. I_sqr2进行测序，并用XhoI和Kpn I双酶切检测(图9，图中2泳道)，在5000bp和1300bp附近均有检测到表达载体和sqr/sqr2基因的目的条带，证明真核表达载体构建成功。四、sqr与sqr2基因mRNA的表达水平比较
所得的pcDNA3. 1-sqr和pcDNA3. I_sqr2无内毒素抽提之后用脂质体转染CHO细胞系，同时用空载体pcDNA3. I以及未转染的CHO细胞作对照。试剂盒提取转染48 h后各组CHO细胞的总RNA，经1%的琼脂糖凝胶电泳，结果见图10，图中清晰可见28S与18S条带和一条微弱的5S条带，这是由于用试剂盒抽提一般都会将5S破坏，因此5S条带非常模糊。一般地，只要28S和18S 2条带清晰，完整无拖带，且28S带的亮度是18S带的两倍，表明总RNA无降解。本实验所提取的RNA完全符合这要求，并且总RNA经Eppendorf核酸蛋白浓度测定仪测定,260 nm的吸收值与280 nm的吸收值比值均在I. 8 - 2.0之间，表明无蛋白质和其它杂质污染，提取的总RNA质量完好，可以继续进行下游的反转录及实时定量检测。通过Realtime-PCR检测sqr、sqr2基因在CHO细胞中的表达，以GAPDH为内参作为对照，结果如图11所示，实验组细胞目的基因sqr2的mRNA表达水平是sqr的9倍之多，这表明pcDNA3. 1-sqr和pcDNA3. I_sqr2质粒成功的转染CHO细胞后，sqr2的mRNA表达水平极显著的高于sqr的表达水平(/ < 0. 001)。
Western blot检测sqr基因优化前后蛋白表达水平比较对瞬时转染48h的CHO细胞进行蛋白抽提，以小鼠内参GAPDH做内参，通过His标签抗体检测pcDNA3. l_sqr与pcDNA3. I_sqr2融合蛋白在CHO细胞中的表达情况，Western blot结果表明(图12)，转染两个表达载体的CHO细胞的培养基中均未检测到SQR的表达，而在CHO细胞内有SQR蛋白的表达，55KD处有目的条带出现，且转染了 pcDNA3. I_sqr2的CHO细胞中SQR蛋白的表达高于转染pcDNA3. 1-sqr的细胞组，进一步说明优化后的sqr2基因比sqr基因更适于在仓鼠卵巢细胞CHO中表达。实施例3显微注射法制备sqr2转基因小鼠
将优化后的基因sqr2插入到转基因载体的多克隆位点构建成转基因表达载体，进行显微注射小鼠(由广州赛业公司完成)，一共注射了 350枚受精卵，第一次注射200个，存活 155个，移植6只代孕鼠，出生9只小鼠(部分死亡)。第二次注射150个卵，存活110个，移植4只代孕鼠，出生17只小鼠。首建者转基因小鼠在6周龄左右与非转基因小鼠进行第一次交配，获得F1代小鼠，断奶后又再次交配，小鼠传代情况见表I所示。对出生的后代小鼠进行PCR检测，根据阳性转基因小鼠的数量可以计算遗传率。结果表明pPSP- sqr2转基因小鼠中15、35号不能将导入的外源基因遗传给后代，其余的14、16、33、34、36号Ftl小鼠都能遗传给后代，其中14、16号遗传概率最高,36号遗传概率较高,33、34号遗传率较低。表I转基因小鼠的传代
权利要求
1.一种优化的硫化物醌氧化还原酶基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.一种硫化物醌氧化还原酶的表达载体，其特征在于由权利要求I所述优化的硫化物醌氧化还原酶基因插入到表达载体的多克隆位点构建而成。
3.根据权利要求2所述硫化物醌氧化还原酶的表达载体，其特征在于所述原核表达载体为大肠杆菌表达载体pRSET A或真核表达载体pcDNA3. I。
4.一种转基因细胞系，其特征在于由权利要求2所述硫化物醌氧化还原酶的表达载体转染到宿主细胞构建而成。
5.权利要求I所述优化的硫化物醌氧化还原酶基因在制备转基因动物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种优化的硫化物醌氧化还原酶基因及其表达载体，属于基因工程技术领域。该优化的硫化物醌氧化还原酶基因(sqr)核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。优化后的sqr基因片段核苷酸序列与原序列比对相似性为81%，427个氨基酸中有228个氨基酸的密码子得到优化，优化率达到54%。本发明从培育环境友好型动物新品种的角度出发，为转基因动物的制备探路，以期从转基因全新的角度降低动物养殖场中硫化氢气体的排放，从根本上解决养殖产业中的环境污染问题。
文档编号C12N15/63GK102719454SQ20121019761
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月15日 优先权日2012年6月15日
发明者张哲 , 张豪, 李加琪, 贺艳芬 申请人:华南农业大学