专利名称：水产用复合微生态制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及饲料添加剂技术领域，具体涉及一种水产用复合微生态添加剂及其制备方法。
背景技术：
微生态制剂又称为微生态调节剂等，它是从天然环境中筛选出来的微生物菌体，经培养、繁殖后制成的含有大量有益菌的活菌制剂。目前，国内外常用的微生态制剂按用途可分为两大类一类是肠道微生态改良剂，即通过添加到饲料中以改良养殖动物的胃肠道内微生物群落组成；另一类是水质微生态改良剂，即通过投放到水体中以改良水质，主要有光合细菌、芽孢杆菌、EM菌等，不同种类的微生态制剂其针对性和作用效力不尽相同。养殖水体中的氨氮浓度过高时，对养殖生物有一定的毒害作用，且养殖水体中氨 态氮及硝态氮浓度提高是使鱼虾致病的直接或间接因素。为解决这一问题人们曾先后使用了物理、化学和生物的多种方法。但传统的物理方法费时费力，化学方法虽见效快，但易形成二次污染。新兴的微生物法利用从自然界中获得的有益微生物降低氨氮，不但不会造成二次污染，还可调节养殖水体水质，对养殖水体中的生态平衡起到一定作用。国内外大量研究表明，硝化细菌、光合细菌、芽孢杆菌及诺卡氏菌等均对养殖水体中的氨氮具有较强的去除能力，且光合细菌和硝化细菌已在实践中取得良好效果。但这两种菌在分离和培养方面对营养和环境条件均有较高要求，而芽孢杆菌则易分离、易培养，在降低养殖水体氨氮含量和调节水质方面有更好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多菌种配合的水产用复合微生态制剂及其制备方法。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种水产用复合微生态制剂，包括以下四种组分枯草芽孢杆菌CGMCC No. 4628菌粉、巨大芽孢杆菌菌粉、环状芽孢杆菌菌粉、热带假丝酵母菌粉。其所含各种菌的活菌数为枯草芽孢杆菌2X 109CFU/g I X 10nCFU/g、环状芽孢杆菌2 X 109CFU/g 2 X 10nCFU/g、巨大芽孢杆菌2 X 109CFU/g I X 10nCFU/g、热带假丝酵母 2 X 109CFU/g I X 10nCFU/g。所述枯草芽孢杆菌菌粉、巨大芽孢杆菌菌粉、环状芽孢杆菌菌粉、热带假丝酵母菌粉，各成分的重量配比为
枯草芽孢杆菌菌粉O. 20 O. 50份
巨大芽孢杆菌菌粉O. 20 O. 60份
环状芽孢杆菌菌粉O. 20 O. 50份
热带假丝酵母菌粉 O. 05 O. 30份。
所述的水产用复合微生态制剂的菌粉制备方法为(I)在种子罐内的培养基中，按每毫升培养基接种2 3亿个活性枯草芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和热带假丝酵母四种菌种中的一种，在32 37°C下，培养12-24小时；(2)当种子罐内培养基中每毫升含25 30亿以上活性芽孢时，按每IOOml生产罐培养基中接种80 100亿个活性芽孢的比例，将种子罐内培养物转入生产罐内培养基中深层通气搅拌培养24 48小时，培养基温度稳定在28 32°C，搅拌次数每分钟80 150次；
(3)当生产罐内芽孢生产率达到85-95%时，即将培养液转入高速离心设备收集菌体，收集的菌体为灰白色，菌体与淀粉按照1:3 6的比例混合均匀；经60 80°C干燥和反复研磨，过80目筛制成菌粉，然后按质量百分比菌粉30%、葡萄糖10%、淀粉60%的比例制成含活菌数为lX10n-5X10nCFU/g的菌粉。一种上述的水产用复合微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(I)将枯草芽孢杆菌菌粉、巨大芽孢杆菌菌粉、环状芽孢杆菌菌粉在40 90°C烘干，热带假丝酵母菌粉在30 70°C烘干；(2)将上述原料放入混合机中混合均匀，用纸塑及复合铝箔袋包装，储存温度需小于35°C,储存环境湿度小于60%。所述混合机为混合均匀度变异系数小于5%的双轴浆叶式高效混合机。本发明的有益效果是具有制造工艺简单，菌种易得，成本低的特点，且无毒副作用，无残留。本发明的复合微生态饲料添加剂应用于水产，即可为一种饲料添加剂，能够改善饲料品质，提高饲料中粗蛋白的含量，降低饲料中粗纤维的含量，也兼具改善水产养殖水质作用，是一种新型安全可靠、无污染的纯发酵多功能的新型微生态制剂产品。
图I复合微生态制剂氨氮去除效果图。图2添加复合微生态制剂后水中化学需氧量和氨氮含量变化图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细说明本发明的一种水产用复合微生态制剂，包括以下四种组分枯草芽孢杆菌CGMCCNo. 4628菌粉、巨大芽孢杆菌菌粉、环状芽孢杆菌菌粉、热带假丝酵母菌粉。其所含各种菌的活菌数为枯草芽孢杆菌2X 109CFU/g I X 10nCFU/g、环状芽孢杆菌2 X 109CFU/g 2 X 10nCFU/g、巨大芽孢杆菌2 X 109CFU/g I X 10nCFU/g、热带假丝酵母 2 X 109CFU/g I X 10nCFU/g。所述枯草芽孢杆菌菌粉、巨大芽孢杆菌菌粉、环状芽孢杆菌菌粉、热带假丝酵母菌粉，各成分的重量配比为枯草芽孢杆菌菌粉O. 20 O. 50份
巨大芽孢杆菌菌粉O. 20 O. 60份
环状芽孢杆菌菌粉O. 20 O. 50份
热带假丝酵母菌粉 O. 05 O. 30份。所述的水产用复合微生态制剂的菌粉制备方法为(I)在种子罐内的培养基中，按每毫升培养基接种2 3亿个活性枯草芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和热带假丝酵母四种菌种中的一种，在32 37°C下，培养12-24小时；
(2)当种子罐内培养基中每毫升含25 30亿以上活性芽孢时，按每IOOml生产罐培养基中接种80 100亿个活性芽孢的比例，将种子罐内培养物转入生产罐内培养基中深层通气搅拌培养24 48小时，培养基温度稳定在28 32°C，搅拌次数每分钟80 150次；(3)当生产罐内芽孢生产率达到85-95%时，即将培养液转入高速离心设备收集菌体，收集的菌体为灰白色，菌体与淀粉按照1:3 6的比例混合均匀；经60 80°C干燥和反复研磨，过80目筛制成菌粉，然后按质量百分比菌粉30%、葡萄糖10%、淀粉60%的比例制成含活菌数为IX 10n-5X 10nCFU/g的菌粉。一种上述的水产用复合微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(I)将枯草芽孢杆菌菌粉、巨大芽孢杆菌菌粉、环状芽孢杆菌菌粉在40 90°C烘干，热带假丝酵母菌粉在30 70°C烘干；(2)将上述原料放入混合机中混合均匀，用纸塑及复合铝箔袋包装，储存温度需小于35°C,储存环境湿度小于60%。所述混合机为混合均匀度变异系数小于5%的双轴浆叶式高效混合机。本发明采用的菌种及其特点是I.枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)革兰氏染色阳性、杆状、芽孢中生或偏生、孢囊膨大但不明显，7%氯化钠生长、pH5. 7生长、葡萄糖( + )、阿拉伯糖(± )、淀粉水解、硝酸盐还原试验阳性、大小为O. 7—O. 8X2. O-3. Oum02.环状芽抱杆菌(Bacillus circulans)G同原群，革兰氏染色阳性、杆状、芽孢中生、孢囊不膨大，孢内无羟基丁酸盐颗粒，V-P反应阴性、V-P液的终ΡΗ5. 5，葡萄糖产酸不产气，阿拉伯糖不产酸，大小为O. 9X2. 1-3. Ιμπ ο本发明所用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为申请人从传统发酵豆豉中分离得到，其生物学特征如下菌落表面粗糙，不透明，污白色，菌落圆形，边缘呈锯齿状，革兰氏阳性菌；芽孢形态为椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。本发明的枯草芽孢杆菌显著区别于现有的枯草芽孢杆菌，可以耐受pH2.0，l%胃蛋白酶的人工胃液，可以耐受O. 3%的人工胆盐，可以耐受80°C的制粒温度，可以抑制致病性大肠杆菌K88，K99和金黄色葡萄球菌，具有较强的产纤维素酶的能力，可以降解纤维素。本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)已于2011年3月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 4628。3.巨大芽抱杆菌(Bacillus megatherium)革兰氏染色阳性、杆状、芽孢中生或偏中生，孢囊膨大不明显，V-P反应阴性、接触酶阳性、淀粉水解、葡萄糖产酸、甘露醇(±)、阿拉伯糖和木糖产酸、硝酸盐还原试验阳性、大小为 I. 2-1. 5X2. 0-5. O μ m。4.热带假丝酵母(Candida tropicalis)是最常见的假丝酵母，在葡萄糖-酵母汁-蛋白胨液体培养基中培养，25°C，3天，细胞呈球形或卵球，多端芽殖生长，有竹节式的假菌丝体，并有少量的细长真菌丝，芽殖孢子轮生，有分枝且有短链，可发酵葡萄糖，D-半乳糖以及麦芽糖，大小为4 8 X 6 11 μ m。 环状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、热带假丝酵母(菌种在《中国菌种目录》和《中国典型培养物保藏中心培养物目录》中已公开记载。本发明的复合微生态制剂的制备方法为将枯草芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、热带假丝酵母，分别在斜面、一级液体活化培养后，在种子罐进行混合活化培养，再接入大发酵罐中进行混合发酵培养。所述的四种菌种在种子罐活化培养的工艺中，每种菌以基本相同的接种量接种。(I)将原菌种进行活化处理包括固体斜面培养基的制备，种子培养基的制备，其中的芽孢菌接种入固体斜面LB培养基，酵母接种入固体斜面马铃薯葡萄糖培养基，37°C下恒温培养18-24小时；LB培养基胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L。马铃薯葡萄糖培养基马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、H2O IOOOmL, pH6. 5。(2)种子液制备挑取斜面上活化好的各菌株单菌落分别接种于相应的液体种子培养基，37°C下恒温培养18-24小时；(3)富集培养将各菌株的种子培养液加入到含3L发酵培养基的5L发酵罐中，37 °C下恒温培养18-24小时；(4)将菌种按体积比混合后加入液体培养基，即得。发酵培养基(按每升培养基所含克重g/Ι计算):葡萄糖20 30，尿素3 5，酵母浸出汁粉3 6，蛋白胨12 15，玉米浆4 8，酵母膏12 15，用醋酸调节pH至7. O;并在发酵过程中采用连续流加高浓度的营养补充培养基，其组分为(重量百分比克重g/Ι计算)葡萄糖35 45，酵母膏25 35，ρΗ7· O。本发明的具体发酵工艺过程为I.在种子罐内的培养基中，按每毫升培养基接种2 3亿个活性枯草芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和热带假丝酵母四种菌种中的一种，在32 37°C下，培养12-24小时。2.当种子罐内培养基中每毫升含25 30亿以上活性芽孢时，按每IOOml生产罐培养基中接种80 100亿个活性芽孢的比例，将种子罐内培养物转入生产罐内培养基中深层通气搅拌培养24 48小时，培养基温度稳定在28 32°C，搅拌次数每分钟80 150次。生产罐培养基组成及配制方法首先将净化的自来水放入生产罐中，再按水溶液的重量添加蛋白胨2%、牛肉膏O. 5%、葡萄糖O. 3%、食用盐O. 5%、pH7. O 7. 2、搅拌均匀，120°C高压灭菌40 60分钟，再降温至28-32°C即可使用。3.当生产罐内芽孢生产率达到85-95%时，即将培养液转入高速离心设备收集菌体，收集的菌体为灰白色，菌体按照1:3 6的比例混合于淀粉内(也可将培养基液直接与淀粉混合，而不经离心收集菌体工序)；经60 80°C干燥和反复研磨，过80目筛制成菌粉，然后按菌粉(30%)、葡萄糖(10%)、淀粉(60%)的比例制成含活菌数为lX10n-5X10nCFU/g的菌粉。本发明得到的复合菌剂在低温条件下生物活性高、生长速度快且能在低温条件下处理微污染水源水，效果明显，且 出水硝酸盐与亚硝酸盐类不积累，不产生N2O,安全可靠。复合菌剂及其发酵制剂作为改善水产养殖水质的复合微生态添加剂和饲用微生态添加剂方面的应用。本发明的创新点在于复合菌剂所涉及四个菌种中的两个菌种，即环状芽孢杆菌和热带假丝酵母，在国内是首次运用到改善水产养殖水质的作用方面。而对于巨大芽孢杆菌在解决水体污染的应用效果在本发明中也非常显著。应用巨大芽孢杆菌的培养物于池塘微碱性水体后，可降低水体悬浮颗粒中除水溶性吸附态磷外的无机及有机磷含量的10. 83% 24. 92%,水体中可溶性正磷酸盐的含量可提高140% 260%。巨大芽孢杆菌的适宜用量为I mL/m3，适宜作用时间为3天。研究表明，巨大芽孢杆菌具有一定的解磷功能，可促进水体的磷素循环。本发明的优点在于复合菌剂应用于改善水产养殖水质作用的同时又作为一种饲料添加剂，能够改善饲料品质，提高饲料中粗蛋白的含量，降低饲料中粗纤维的含量，是一种新型安全可靠、无污染的纯发酵多功能的新型微生态制剂产品。本发明所提供的改善水产养殖水质的复合菌剂主要由芽孢杆菌和酵母构成，它们同时具有耐高温的特点，因而具有不需要包被，可直接制粒的优点。本发明的改善水产养殖水质的复合菌剂除了安全、无污染、直接制粒之外，同时具有多种功能且用量少，因此具有大大节约生产成本的优点。本发明的新型改善水产养殖水质复合菌剂的制备方法简单，操作容易，且不含化学药剂，不仅防霉效果好，抑菌力强，而且具有改善饲料品质，适口性强的优点。该复合微生态制剂可用于显著改善水产养殖水质，运行25天时氨氮去除率为运行40天的实验全程中的最大去除率为81%，平均去除率为69%。实施例I :复合微生态饲料添加剂的生产(I)分别取用液体发酵培养分离后在60 80°C温度下烘干的枯草芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，环状芽孢杆菌菌粉及热带假丝酵母菌粉。(2)按重量比例计算，取枯草芽孢杆菌菌粉O. 25Kg，巨大芽孢杆菌菌粉O. 40Kg，环状芽孢杆菌的菌粉O. 25Kg，热带假丝酵母菌粉O. IOKg用混合均匀度变异系数小于5%的双轴浆叶式高效混合机混合均匀，包装用纸塑及复合铝箔袋，储存温度小于35°C，储存环境湿度小于60%。实施例2 :复合微生态饲料添加剂的生产原料同实施例I。原料配比为按重量比例计算，取枯草芽孢杆菌菌粉O. 20Kg,巨大芽孢杆菌菌粉O. 35Kg，环状芽孢杆菌的菌粉O. 20Kg，热带假丝酵母菌粉O. 25Kg.。制法同实施例I制成产品。实施例3 :复合微生态饲料添加剂的生产原料同实施例I。原料配比为按重量比例计算，取枯草芽孢杆菌菌粉O. 30Kg,巨大芽孢杆菌菌粉O. 30Kg,环状芽孢杆菌的菌粉O. 30Kg,热带假丝酵母菌粉O. 10Kg。制法同实施例I制成产品。实施例4 :复合微生态饲料添加剂的生产原料同实施例I。原料配比为按重量比例计算，取枯草芽孢杆菌菌粉O. 30Kg,巨大芽孢杆菌菌粉O. 30Kg,环状芽孢杆菌的菌粉O. 30Kg,热带假丝酵母菌粉O. 10Kg。制法同实施例I制成产品。以下为本发明产品对养殖水质改善效果的实施例。实施例5 :本发明所研制的复合微生态制剂对室内静态水体改良效果实验在室内小水池内进行，试验前每池加入50kg池水，静止三天后开始试验。试验期间水温为20 25°C，每池加入按照实施例I 4所得到的复合微生态制剂，每池加入O. 5g/m3，平行设置试验组和空白对照组，每24小时定时采集水样分析测定，连续分析7天。结果表明7天内使用本复合微生态制剂对室内池水的溶氧、pH无明显的影响，可明显降低池水的氨氮浓度、亚硝酸盐氮、硫化物浓度。氨氮降低了 6. 93% 40. 26%，最大降解峰值出现在第4天；亚硝酸盐氮降低7. 01% 21. 66%，最大降解峰值出现在第3天。实施例6 :本发明所研制的复合微生态制剂对养殖鱼池的水质改良效果按照实施例I 4所得到的复合微生态制剂，用于净化从北京永定河水域采集的鱼类养殖池塘中的养殖水，在20 25°C的条件下经纳氏试剂光度法检测氨氮的含量，结果所示，运行25天时氨氮去除率为运行40天的实验全程中的最大去除率为81%，平均去除率为69% (图I和图2),且出水氨氮浓度为O lmg/L ;且无硝酸盐和亚硝酸盐积累，不产生N2O并出水的化学需氧量COD为O 4mg/L，保持在很低的水平。本发明得到的复合饲料添加剂对养殖水质具有明显的改善作用。
实施例7 :复合微生态制剂与化学复合水质改良剂应用效果对比研究 底层水质改良剂是一种白色颗粒状化学复合剂，主要成份是过氧化钙CaO2。6 口鱼塘分别投人该化学复合剂和按照实施例I 4所得到的复合微生态制剂并设置对照，7天、15天后水质测定结果如表I。由表I看出，本发明所研制的复合微生态制剂以及化学复合剂都具有良好的水质改善作用，对氨氮和亚硝酸盐的消除效果非常明显，但随着时间的推移，微生态制剂对氨氮和亚硝酸盐的消除率上升更加明显，15天后氨氮消除率达50. 29%以上，亚硝酸盐的降解率达18. 81%以上，而化学复合剂对氨氮和亚硝酸盐的消除率则趋于稳定分别达到40%和13. 86%，微生态制剂更有利于持续消除水中有害物质，改善水质环境。表I鱼塘水质监测结果
权利要求
1.一种水产用复合微生态制剂，其特征在于，包括以下四种组分枯草芽孢杆菌CGMCCNo. 4628菌粉、巨大芽孢杆菌菌粉、环状芽孢杆菌菌粉、热带假丝酵母菌粉。
2.根据权利要求I所述的水产用复合微生态制剂，其特征在于，其所含各种菌的活菌数为枯草芽孢杆菌2 X 109CFU/g I X 10nCFU/g、环状芽孢杆菌2 X 109CFU/g 2X 10nCFU/g、巨大芽孢杆菌2X 109CFU/g I X 10nCFU/g、热带假丝酵母2 X 109CFU/g lX10nCFU/g。
3.根据权利要求I或2所述的水产用复合微生态制剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌菌粉、巨大芽孢杆菌菌粉、环状芽孢杆菌菌粉、热带假丝酵母菌粉，各成分的重量配比为枯草芽孢杆菌菌粉O. 20 O. 50份巨大芽孢杆菌菌粉O. 20 O. 60份环状芽孢杆菌菌粉O. 20 O. 50份热带假丝酵母菌粉 O. 05 O. 30份。
4.根据权利要求I所述的水产用复合微生态制剂，其特征在于，所述的菌粉制备方法为 (1)在种子罐内的培养基中，按每毫升培养基接种2 3亿个活性枯草芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和热带假丝酵母四种菌种中的一种，在32 37°C下，培养12-24小时； (2)当种子罐内培养基中每毫升含25 30亿以上活性芽孢时，按每IOOml生产罐培养基中接种80 100亿个活性芽孢的比例，将种子罐内培养物转入生产罐内培养基中深层通气搅拌培养24 48小时，培养基温度稳定在28 32°C，搅拌次数每分钟80 150次； (3)当生产罐内芽孢生产率达到85-95%时，即将培养液转入高速离心设备收集菌体，收集的菌体为灰白色，菌体与淀粉按照1:3 6的比例混合均匀；经60 80°C干燥和反复研磨，过80目筛制成菌粉，然后按质量百分比菌粉30%、葡萄糖10%、淀粉60%的比例制成含活菌数为IX 10n-5X 10nCFU/g的菌粉。
5.—种权利要求1-4任一项所述的水产用复合微生态制剂的制备方法,其特征在于，包括以下步骤 (1)将枯草芽孢杆菌菌粉、巨大芽孢杆菌菌粉、环状芽孢杆菌菌粉在40 90°C烘干，热带假丝酵母菌粉在30 70°C烘干； (2)将上述原料放入混合机中混合均匀，用纸塑及复合铝箔袋包装，储存温度需小于350C，储存环境湿度小于60%。
6.根据权利要求5所述的水产用复合微生态制剂的制备方法，其特征在于，所述混合机为混合均匀度变异系数小于5%的双轴浆叶式高效混合机。
全文摘要
本发明公开了一种水产用复合微生态制剂及其制备方法，所述的添加剂是一种由四种菌及其发酵产物按照一定比例混合而成的复合微生态制剂，由如下重量组分组成枯草芽孢杆菌菌粉0.20～0.50份，巨大芽孢杆菌菌粉0.20～0.60份，环状芽孢杆菌菌粉0.20～0.50份，热带假丝酵母菌粉0.05～0.30份；本复合微生态饲料添加剂具有制造工艺简单，菌种易得，成本低的特点，且无毒副作用，无残留。本发明的复合微生态饲料添加剂应用于水产，即可为一种饲料添加剂，能够改善饲料品质，提高饲料中粗蛋白的含量，降低饲料中粗纤维的含量，也兼具改善水产养殖水质作用，是一种新型安全可靠、无污染的纯发酵多功能的新型微生态制剂产品。
文档编号C12N1/20GK102719380SQ20121019796
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月15日 优先权日2012年6月15日
发明者刘滢, 庞洁, 王安如, 贠桂玲 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 天津昌农科技有限责任公司