一种复合微生态制剂、添加剂、预混料及配合料的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种复合微生态制剂，主要涉及含地衣芽孢杆菌和干酪乳杆菌的复合 微生态制剂添加剂、预混料及配合料及其在猪日粮中的应用，属于微生态制剂技术领域。
【背景技术】
[0002] 目前，对动物疾病的预防和治疗药物基本仍采用抗生素，但由于长期、大量使用抗 生素，致病菌耐药性增强、菌群失调、免疫力下降、疾病复发率高、药物残留等种种弊端日益 严重，同时也严重危害动物机体及人类健康。在此形势下，改变养殖观念、预防重于治疗，并 开发应用无毒、无药残的新型绿色饲料添加剂是必然趋势。
[0003] 微生态制剂是目前常用和研究较多的一种绿色、安全的饲料添加剂，此类制剂是 用动物有益菌经工业化高密度发酵生产得到的，包含有很多的有益微生物及其代谢产物构 成的活菌制剂，可以直接饲喂动物。微生态制剂通过维持肠道内微生态平衡而发挥作用，具 有防病、增强机体免疫力、促进生长、增加体重等多种功能，且无污染，无残留，不产生抗药 性，是一种绿色、安全的饲料添加剂。
[0004] 市场上的微生态产品种类繁多，质量参差不齐，主要存在以下几个问题：（1)活菌 含量低，而研究表明，如果一种菌在盲肠内容物中的浓度少于l〇7cfu/g，则该菌产生的酶及 其代谢产物不足以影响宿主，难以满足治疗需要；（2)水分含量偏高，这样使得微生态制剂 的保质期大大缩短，也是影响微生态制剂质量不好的重要原因之一；（3)不耐抗生素；(4) 对胃酸和胆盐不稳定，致使只有少数菌株进入肠道后仍具有活性，达不到发挥作用所需的 活菌数量。由于微生态制剂存在的这些质量问题，从而影响了其在动物饲喂中的应用效果， 限制了微生态制剂的广泛应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种活菌含量高、水分含量低、具有耐胃酸、耐肠液、耐胆 盐、耐高温等抗逆性能和产酸、产酶及抑制病原菌等益生功能的含地衣芽孢杆菌和干酪乳 杆菌益生菌的复合微生态制剂。
[0006] 首先，本发明提供一种地衣芽孢杆菌OfeciWiA? 新菌株，其保藏 号为 CGMCC No. 8147。
[0007] 其次，本发明提供一种干酿乳杆菌casei)新菌株，其保藏号为 CGMCC No. 8149〇
[0008] 本发明还提供一种复合微生态制剂，该制剂包含地衣芽孢杆菌CGMCC No. 8147菌 粉和干酪乳杆菌CGMCC No. 8149菌粉。
[0009] 其中，制剂中总活菌数为3~6X10S ncfu/g。
[0010] 其中，地衣芽孢杆菌CGMCC No. 8147菌粉、干酪乳杆菌CGMCC No. 8149菌粉的重量 配比为 1 :〇. 8~1. 2。
[0011] 本发明的复合微生态制剂还可进一步包含载体，载体为石粉、葡萄糖、麸皮、玉米 芯粉、米糖柏中的任一种或几种。
[0012] 在本发明具体实施方案中，本发明的复合微生态制剂包含地衣芽孢杆菌菌粉、干 酪乳杆菌菌粉，载体为石粉，上述各成分的重量配比为1 :〇. 8~1. 2 :6~8,即可制成猪通用型 复合微生态制剂，总活菌数3~6 X 109cfu/g ; 复合微生态制剂包含：地衣芽孢杆菌菌粉、干酪乳杆菌菌粉和葡萄糖，上述各成分的重 量配比为：1 :〇. 8~1. 2 :6~8,即制成仔猪专用型复合微生态制剂，总活菌数3~6X 109cfu/g ; 复合微生态制剂包含：地衣芽孢杆菌菌粉、干酪乳杆菌菌粉和麸皮，上述各成分的重量 配比为：1 :〇. 8~1. 2 :6~8,即制成母猪专用型复合微生态制剂，总活菌数3~6X 109cfu/g ; 复合微生态制剂包含：地衣芽孢杆菌菌粉、干酪乳杆菌菌粉和玉米芯粉，上述各成 分的重量配比为1 :〇. 8~1. 2 :6~8,即制成种公猪专用型复合微生态制剂，总活菌数可达 3~6X109cfu/g〇
[0013] 复合微生态制剂包含：地衣芽孢杆菌菌粉、干酪乳杆菌菌粉和米糠柏，上述各成 分的重量配比为1 :〇. 8~1. 2 :6~8,即制成育肥猪专用型复合微生态制剂，总活菌数可达 3~6X109cfu/g〇
[0014] 本发明还提供含有所述微生态制剂的饲料添加剂。
[0015] 其中，所述的添加剂还可含有本领域常规使用的饲料添加剂类型，如现有已经添 加到饲料中的中草药添加剂、多糖，如香菇多糖、灵芝多糖等。
[0016] 本发明还提供了包含该复合微生态制剂的预混料，其中，预混料中所述复合 微生态制剂添加的质量比为0.5-10%。，配合料中所述复合微生态制剂添加的质量比为 0· 2~0· 4%0〇
[0017] 本发明的另一目的在于提供该复合微生态制剂在猪日粮中应用。
[0018] 其中，所述的地衣芽孢杆菌、干酪乳杆菌具有良好的耐胃酸、耐肠液、耐胆盐(芽孢 杆菌耐高温）等抗逆性能和产酸、产酶、抑制病原菌等益生功能，为申请人从健康动物肠道 中分离、选育得到，并于2013年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保 藏编号分别为：CGMCC No.8147、CGMCC No.8149。
[0019] 本发明所选育的地衣芽孢杆菌CGMCC No. 8147在人工模拟胃液（pH2. 0~4. 0)中处 理3h，存活率在12. 5%以上；在人工模拟肠液中处理3h，存活率在68. 0% ;在猪胆盐溶液(浓 度0. 3~3g/kg)处理24h，存活率为5. 5%以上；85~100°C处理3min，存活率为0. 3%以上；对 头孢吡肟、多粘菌素 B、林可霉素3种抗生素有耐药性；可以产生一定量的蛋白酶、脂肪酶、 淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶。
[0020] 本发明所选育的干酪乳杆菌CGMCC No. 8149在人工模拟胃液（pH2. 0~4. 0)中处理 3h，存活率在43. 1%以上；在人工模拟肠液中处理3h，存活率在63. 5% ;在猪胆盐溶液(浓度 0. 3~3g/kg)处理24h，存活率为8. 6%以上；对头孢吡肟、庆大霉素、大观霉素、链霉素、多粘 菌素 B、环丙沙星、万古霉素7种抗生素有耐药性；对大肠杆菌K88、K99均有很好的抑制作 用，抑菌圈直径分别为16. 13mm、14. 09mm。
[0021] 本发明中所选育的地衣芽孢杆菌菌粉、干酪乳杆菌菌粉在制备中采用液体深层高 密度发酵技术和喷雾干燥或者冷冻干燥一系列的后处理加工工艺技术制成菌粉，制剂中的 活菌含量高、水分含量低，具有耐胃液、耐肠液、耐胆盐、耐高温等抗逆性能和产酸、产酶及 抑制病原菌等益生功能。
[0022] 本发明的复合微生态制剂可应用于仔猪、母猪、育肥猪，能提高饲料利用效率，改 善肠道微生态区系，促进猪生长，提高其免疫力和抗病力，替代抗生素，从而改善猪肉品质。
【具体实施方式】
[0023] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0024] 实施例1优良菌种的的分离、筛选、选育及鉴定 1) 增菌培养：将健康猪的新鲜肠道内容物样品接种于LB液体培养基中，在37°C恒温摇 床中过夜培养； 2) 地衣芽孢杆菌的分离纯化：对步骤1)取富集液倍比稀释，蘸取稀释液在LB培养基平 板上划线分离，置37°C培养24h，待菌落长出后挑单菌落涂片，用复红美蓝染色，显微镜观 察，能发现有芽孢产生的，再取一环分离菌使分散于无菌生理盐水中，85°C水浴15min后， 涂布于LB培养基中37°C培养24h，从中挑取各个具有特征形态的菌落，再划线培养和分离， 直至为纯菌落为止，革兰氏染色镜检，将分离的疑似纯菌落接种试管斜面中增殖，然后保存 于4°C冰箱中，待用； 菌落形态：菌落表面粗糙，不光泽，淡黄色，不透明，边缘不整齐，大小l~3mm ;细胞为杆 菌，芽孢中生，椭圆形，不膨大，直径0. 5~1. Oum，大多数成短链或成对，革兰氏染色阳性。
[0025] 经鉴定，分离出的菌株为地衣芽孢杆菌，并于2013年9月11日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No. 8147。
[0026] 3)干酪乳杆菌的分离纯化：对步骤1)增菌培养基倍比稀释、取少量富集液于 PH3. 0MRS培养液液中，至于摇床37°C培养8h ;取少量富集液于0. 3%猪胆盐MRS培养液中， 至于摇床37°C培养12h，稀释涂CaC03MRS平板，从中挑取产酸能力强的菌株，再划线培养和 分离，直至为纯菌落为止，革兰氏染色镜检，将分离的疑似纯菌落接种试管斜面中增殖，然 后保存于4 C冰箱中，待用； 菌落形态：菌落为软而湿润，乳酪色、有光泽、平坦或稍凸起、边缘整齐；细胞为球形或 卵形，直径5~10 μ m，繁殖方式芽殖，革兰氏染色阳性。
[0027] 经鉴定，分离出的菌株为干酪