专利名称：大豆检疫性病毒病害多重实时荧光pcr检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种同时检测烟草环斑病毒、南方菜豆花叶病毒、番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒四种中一种或多种大豆病毒病害的简单、快速、特异、灵敏的实时荧光PCR检测 方法及其试剂盒。适合于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。
背景技术：
大豆(Glycine max)是我国重要的油料作物和粮食作物，也是世界上食用油和植 物蛋白的主要来源，在我国国民经济中占有重要地位。目前我国大豆产量居世界第四位，但 仍然不能满足国内植物油及饲料蛋白加工的需要。随着我国进口大豆的数量逐年递增，各 种危害大豆生产的病害传入的风险也逐渐增大。其中本发明涉及的四种大豆病毒病害是目 前严重影响大豆生产及贸易的病毒病害，具有重要的检疫重要性和经济重要性。烟草环斑病毒(Tobacco Ringspot Virus,简称TRSV)是豇豆花叶病毒科 (Comoviridae)，线虫传多面体病毒属(N印ovirus)的成员。其寄主范围很广，能够侵染包 括豆类、瓜类、薯类、花卉和果树等在内的54科300余种植物，并引起重大经济损失。TRSV 可经汁液摩擦接种、介体及种子传播。其症状变化多样，常有隐症现象等，给常规诊断带来 困难，甚至出现漏检。该病毒分布于美国、加拿大、巴西、阿根廷等的30多个国家，中国仅山 东、宁夏和陕西有发生报道。南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,简称ArMV)是豇豆花叶病毒科 (Comoviridae)，线虫传多面体病毒属(^povirus)成员。ArMV寄主范围广泛，可侵染174 属215种植物，自然侵染并危害多种瓜类、豆类、花卉和果树，引起花叶、黄化褪绿、矮化、皱 缩甚至坏死等症状。可以通过种子及鳞球、块茎及苗木等无性繁殖材料远距离传播。目主 要分布在美国、加拿大、澳大利亚、荷兰、比利时、新西兰、南非、日本等20多个国家，中国尚 未有发生的报道。番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,简称ToRSV)是豇豆花叶病毒科 (Comoviridae)，线虫传多面体病毒属(^povirus)的成员。1936年Price等首次报道在美 国新泽西州发现ToRSV。该病毒寄主范围广泛，能侵染105个属157种单、双子叶植物，常见 的自然寄主有番茄、烟草、大豆、葡萄、苹果等具有重要经济价值的作物和果树，造成严重的 经济损失。ToRSV在不同寄主上表现症状不同，但一般都引起植株矮化、叶片斑点、果实畸 形。ToRSV有多种传播方式，在田间通过介体剑线虫等昆虫和嫁接传播，而远距离传播主要 是靠种子、苗木调运。目前在美国、巴西、加拿大、澳大利亚等30多个国家有分布，中国尚无 发生报道。南芥菜花叶病毒(Southern bean mosaic virus,简称SBMV)属于南芥菜花叶病毒 属成员，侵染能力强，适应性广。1942年Zawmey和Harter首先报道。该病毒自然状况下可 引起菜豆、大豆、豇豆和黑绿豆的花叶、斑驳病害，导致花、果、种子数量下降，产量降低。该 病毒传播途径多样，汁液和种子均能传毒。主要包括SBMV-B和SBMV-C两个株系，前者能侵 染菜豆的大多数品种，后者只能侵染豇豆。该病毒一直引起世界各国的高度重视。分布在美国、巴西、墨西哥、法国、印度等国家，中国仅贵州有分布。目前对上述四种病毒都存在多种检测方法，但各个病毒采用不同的体系，不利于 高通量检测工作的进行。并且在对同一种病毒检测中，不同的检测体系之间存在的误差严 重影响检测的准确性和可靠性。此外，在国内外大豆上重要病毒病害检测中还没有实现了 多种病毒的同时检测。随着我国对进口大豆需求的增加，各种大豆病害传入的风险也不断 增加，对我国的大豆生产构成巨大的潜在威胁。因此，在口岸检疫部门采用简单、快速、特 异、灵敏的检测方法对其中具有严重影响的病害进行检测，对保护我国大豆生产，防止其重 要检疫性病原的传入具有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于提出快速、可靠、灵敏度 高、特异性强和价格便宜的检测烟草环 斑病毒、南方菜豆花叶病毒、番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒四种大豆病毒重要病害的引 物、寡核苷酸探针、试剂盒及多重实时荧光PCR检测方法。为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案本发明提供了一种用于大豆病毒病害实时荧光PCR检测的引物和寡核苷酸探针， 至少包括选自表1两组以上病毒的一对引物和对应的寡核苷酸探针。表1多重实时荧光PCR检测各种大豆病毒病害对应各组的引物和寡核苷酸探针一 览表
引物和寡核
苷酸探针序列探针说明名称
TRSY-ZFP 5 ’ - AACTGCCTACCAAGGTTTTCAT -3'烟草环斑病毒
TRSV-ZRP 5，- TCCCC ATAGTTGA ACTGCC A -3'特异性检测引 上表中探针5’和3’端标记的MAR、URA、JUP、SAT为荧光自淬灭基团，即其5’和3’ 标记的是同一基团，通过寡核酸连接进行荧光谐振能量传递。在扩增反应中，由于扩增酶的 5’外切酶作用将与模板匹配的探针切割，使两个基团分开；在一定激发光条件下，荧光基团 发出自身波长的光子。不同的荧光信号标记类型其需要的激发光条件不同，能够被收集到 的荧光信号也有所不同，从而实现多重检测。本发明又提供了一种用于大豆病毒病害实时荧光PCR检测的试剂盒，至少包括根 据表1所述的两组以上的病毒的一对引物和对应的寡核苷酸探针。本发明再提供了一种大豆病毒病害实时荧光PCR检测方法采用的技术方案，包括 如下步骤步骤一设计检测选自烟草环斑病毒、南方菜豆花叶病毒、番茄环斑病毒、南芥菜 花叶病毒中两种以上病毒的引物和寡核苷酸探针；步骤二 将步骤一中设计的两种以上病毒的引物和寡核苷酸探针同时进行实时荧 光PCR反应，并优化出合适的反应体系和反应条件；步骤三根据荧光信号类型判定检测样品的病毒。采用上述技术方案，本发明突出的技术进步在于(1)设计出了同时检测大豆上 四种重要病毒病害的多重实时荧光PCR快速检测的引物、寡核苷酸探针和试剂盒，克服了 现有的分子检测方法操作复杂或检测灵敏度不高、或特异性不强、或重复性不好等缺点。 (2)本发明的多重实时荧光PCR检测方法能同时检测大豆上的四种重要病毒病害，在国内外大豆检疫性病毒病害的检测中尚属先例。(3)本发明适合大豆上四种重要病毒病害的多 重检测。(4)由于本发明检测快速、特异性强，特别适用于口岸检疫等时效性要求特别强的 场合使用。综上所述，采用本发明，能对实际检疫和田间调查过程中所发现的病组织进行烟 草环斑病毒、南方菜豆花叶病毒、番茄环斑病毒以及南芥菜花叶病毒四种病毒进行分子生 物学鉴定或检测，其意义重大。
图1四重实时荧光PCR特异性检测结果。1为烟草环斑病毒TRSV组特异扩增结果；2为南方菜豆花叶病毒SBMV组特异扩增 结果；3为番茄环斑病毒ToRSV组特异扩增结果；8为南芥菜花叶病毒ArMV组特异扩增结果
具体实施例方式下面通过具体的实施例并对本发明作进一步详细的描述。实例1大豆上四种重要病毒病害多重实时荧光PCR检测及试剂盒一种用于大豆上四种重要病毒病害检测的多重实时荧光PCR检测的引物、寡核苷 酸探针及试剂盒，用于大豆上四种重要病毒病害的特异性检测。先对烟草环斑病毒、南方菜豆花叶病毒、番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒四种病毒 其近似种属的外壳蛋白(Coat Protein简称CP)基因序列进行测序、比对分析，分别找出四 种病毒不同于其它病原菌及近似种的独有的碱基位点。设计出的用于大豆病毒病害实时荧 光PCR检测的引物具有如下的核酸序列 设计出的用于大豆病毒病害实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针具有如下的核酸序列 应用上述引物和寡核苷酸探针可制成用于大豆上四种重要病毒病害多重实时荧 光PCR检测的试剂盒。实施例2利用四重实时荧光PCR检测方法对从寄主中提取的四种病毒RNA进行检 测所用引物和寡核苷酸探针是实施例1中的引物和寡核苷酸探针。反转录PCR扩增(RT-PCR)体系总体积为10 μ L，各成分为RT buffer 5yL(T0Y0B0 公司)，5 μ M 引物对 0. 5 μ L，Enzyme mix 0· 5 μ L。反应条件37°C温浴15min。四重实时荧光PCR检测反应见表2。其检测反应条件见表3。表2四重实时荧光PCR检测反应体系(20ul)
ddH20补至20 μ 1体积
表3检测反应条件 以四种病毒RT-PCR产物为阳性对照，以其它近似种属病毒RT-PCR产物为阴性对 照，并设置水空白对照。按照表1提供的探针标记信息对实时荧光PCR进行相应荧光收集设置。实时荧光PCR检测结果为定量PCR仪检测到阳性对照报告荧光有明显信号增长， 阴性对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号增长，而检测样品的报告荧光信号有明显增 长，则根据检测样品的荧光信号类型判定检测样品属于哪种病毒(见图1)。采用本发明的方法能同时检测大豆上的四种病毒病害比以前的检测方法更加快 速、准确，且易于推广应用。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。
权利要求
一种对大豆病毒病害实时荧光PCR检测的方法，包括如下步骤步骤一设计检测选自烟草环斑病毒、南方菜豆花叶病毒、番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒中两种以上病毒的引物和寡核苷酸探针；步骤二将步骤一中设计的两种以上病毒的引物和寡核苷酸探针同时进行实时荧光PCR反应；步骤三根据荧光信号类型判定检测样品的病毒。
2.根据权利要求1所述的对大豆病毒病害实时荧光PCR检测的方法，其特征在于所 述烟草环斑病毒的一对引物是TRSV-ZFP :5’ -AACTGCCTACCAAGGTTTTCAT-3’ SEQ ID NO 1 TRSV-ZRP :5’ -TCCCCATAGTTGAACTGCCA-3’ SEQ ID NO :2， 所述南方菜豆花叶病毒的一对引物是 SBMV-1F :5’ -TGGTCCTTCGACGCAGTCT-3’ SEQ ID NO 3 SBMV-1R :5，-TGGCTTTCTCGTTGATTTCC-3，SEQ ID NO :4， 所述番茄环斑病毒的一对引物是ToRSV-2-FP :5’ -TTGGCAAAGGAGTGGAGGAA-3’ SEQ ID NO 5 ToRSV-2-RP :5’ -TCCACAGGTATACGGGCTTCA-3’ SEQ ID NO :6， 所述南芥菜花叶病毒的一对引物是 ARMV-1-FP1 :5’ -AGGCCACTGGCATGGATG-3’ SEQ ID NO 7 ARMV-1-RP1 :5’ -CGCATCCCATGTTTTGCA-3’ SEQ ID NO :8。
3.根据权利要求1或2所述对大豆病毒病害实时荧光PCR检测的方法，其特征在于 所述烟草环斑病毒的寡核苷酸探针是TRSV-ZP :5’ -MAR-AGATGCAGATGTGCATGA-MAR-3‘ SEQ IDN0 :9， 所述南方菜豆花叶病毒的寡核苷酸探针是 SBMV-1Q :5’ -URA-AGTCTGCAAGAAGGCGCA-URA-3‘ SEQ IDN0 :10， 所述番茄环斑病毒的寡核苷酸探针是ToRSV-2-Q 5' -JUP-CAGCCACTGCTTGGT-JUP-3，SEQ ID NO: 11，所述南芥菜花叶病毒的寡核苷酸探针是ARMV-1-1Q :5’ -SAT-CGTCCCGTGTCTGTGCT-SAT-3，SEQ IDN0 :12。
4.根据权利要求1所述对大豆病毒病害实时荧光PCR检测的方法，其特征在于所述 检测烟草环斑病毒、南方菜豆花叶病毒、番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒四种病毒的引物和 寡核苷酸探针为所述烟草环斑病毒的一对引物是TRSV-ZFP :5’ -AACTGCCTACCAAGGTTTTCAT-3’ SEQ ID NO 1 TRSV-ZRP :5’ -TCCCCATAGTTGAACTGCCA-3’ SEQ ID NO :2， 所述南方菜豆花叶病毒的一对引物是 SBMV-1F :5’ -TGGTCCTTCGACGCAGTCT-3’ SEQ ID NO 3 SBMV-1R :5，-TGGCTTTCTCGTTGATTTCC-3，SEQ ID NO :4， 所述番茄环斑病毒的一对引物是ToRSV-2-FP :5’ -TTGGCAAAGGAGTGGAGGAA-3’ SEQ ID NO 5ToRSV-2-RP :5’ -TCCACAGGTATACGGGCTTCA-3’ SEQ ID NO :6，所述南芥菜花叶病毒的一对引物是ARMV-1-FP1 :5’ -AGGCCACTGGCATGGATG-3’ SEQ ID NO 7ARMV-1-RP1 :5’ -CGCATCCCATGTTTTGCA-3’ SEQ ID NO 8所述烟草环斑病毒的寡核苷酸探针是TRSV-ZP :5’ -MAR-AGATGCAGATGTGCATGA-MAR-3‘ SEQ IDN0 :9，所述南方菜豆花叶病毒的寡核苷酸探针是SBMV-1Q 5' -URA-AGTCTGCAAGAAGGCGCA-URA-3' SEQ IDN0 :10，所述番茄环斑病毒的寡核苷酸探针是ToRSV-2-Q 5' -JUP-CAGCCACTGCTTGGT-JUP-3，SEQ ID NO: 11，所述南芥菜花叶病毒的寡核苷酸探针是ARMV-1-1Q :5’ -SAT-CGTCCCGTGTCTGTGCT-SAT-3，SEQ IDN0 :12。
5.根据权利要求4所述的大豆病毒病害实时荧光PCR检测方法，其步骤二中所述反应 体系为实时荧光反应混合液2XPCR 11^为10111^，511|1的11 乂组引物和寡核苷酸10父为 0. 25111，51^的581^组引物和寡核苷酸肌乂为2111，51^的1101 乂组引物和寡核苷酸10父 为2 iil，5 ii M ArMV组引物和寡核苷酸MIX为2 y 1，待检样品RT-PCR产物为1 y 1，加双蒸 水将总体系补至20 u 1体积。
6.一种用于大豆病毒病害实时荧光PCR检测的引物，至少包括选自如下两对以上病毒 的引物一对用于检测烟草环斑病毒的引物TRSV-ZFP :5’ -AACTGCCTACCAAGGTTTTCAT-3’ SEQ ID NO 1TRSV-ZRP :5’ -TCCCCATAGTTGAACTGCCA-3’ SEQ ID NO :2，一对用于检测南方菜豆花叶病毒的引物是SBMV-1F :5’ -TGGTCCTTCGACGCAGTCT-3’ SEQ ID NO 3SBMV-1R :5，-TGGCTTTCTCGTTGATTTCC-3，SEQ ID NO :4，一对用于检测番茄环斑病毒的引物是ToRSV-2-FP :5’ -TTGGCAAAGGAGTGGAGGAA-3’ SEQ ID NO 5ToRSV-2-RP :5’ -TCCACAGGTATACGGGCTTCA-3’ SEQ ID NO :6，一对用于检测南芥菜花叶病毒的寡核苷酸探针是ARMV-1-FP1 :5’ -AGGCCACTGGCATGGATG-3’ SEQ ID NO 7ARMV-1-RP1 :5’ -CGCATCCCATGTTTTGCA-3’ SEQ ID NO :8。
7.一种用于大豆病毒病害实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，至少包括选自如下寡核 苷酸探针中的两条以上一条用于检测烟草环斑病毒的寡核苷酸探针TRSV-ZP :5’ -MAR-AGATGCAGATGTGCATGA-MAR-3‘ SEQ IDN0 :9，一条用于检测南方菜豆花叶病毒的寡核苷酸探针是SBMV-1Q 5' -URA-AGTCTGCAAGAAGGCGCA-URA-3' SEQ IDN0 :10，一条用于检测番茄环斑病毒的寡核苷酸探针是ToRSV-2-Q :5，-JUP-CAGCCACTGCTTGGT-JUP-3，SEQ ID NO :11，一条用于检测南芥菜花叶病毒的寡核苷酸探针是 ARMV-1-1Q :5’ -SAT-CGTCCCGTGTCTGTGCT-SAT-3’ SEQ IDN0 :12。
8.一种用于大豆病毒病害实时荧光PCR检测的引物和寡核苷酸探针，至少包括选自如 下两组以上病毒的一对引物和对应的寡核苷酸探针第一组一对用于检测烟草环斑病毒的引物TRSV-ZFP :5’ -AACTGCCTACCAAGGTTTTCAT-3’ SEQ ID NO 1TRSV-ZRP :5’ -TCCCCATAGTTGAACTGCCA-3’ SEQ ID NO :2，一条用于检测烟草环斑病毒的寡核苷酸探针TRSV-ZP :5’ -MAR-AGATGCAGATGTGCATGA-MAR-3‘ SEQ IDN0 :9，第二组一对用于检测南方菜豆花叶病毒的引物 SBMV-1F :5’ -TGGTCCTTCGACGCAGTCT-3’ SEQ ID NO 3 SBMV-1R 5' -TGGCTTTCTCGTTGATTTCC-3，SEQ ID NO :4， 一条用于检测南方菜豆花叶病毒的寡核苷酸探针 SBMV-1Q :5’ -URA-AGTCTGCAAGAAGGCGCA-URA-3‘ SEQ IDN0 :10， 第三组一对用于检测番茄环斑病毒的引物ToRSV-2-FP :5’ -TTGGCAAAGGAGTGGAGGAA-3’ SEQ ID NO 5ToRSV-2-RP :5’ -TCCACAGGTATACGGGCTTCA-3’ SEQ ID NO :6，一条用于检测番茄环斑病毒的寡核苷酸探针ToRSV-2-Q 5' -JUP-CAGCCACTGCTTGGT-JUP-3，SEQ ID NO: 11，第四组一对用于检测南芥菜花叶病毒的引物ARMV-1-FP1 :5’ -AGGCCACTGGCATGGATG-3’ SEQ ID NO 7ARMV-1-RP1 :5’ -CGCATCCCATGTTTTGCA-3’ SEQ ID NO :8，一条用于检测南芥菜花叶病毒的寡核苷酸探针ARMV-1-1Q :5’ -SAT-CGTCCCGTGTCTGTGCT-SAT-3，SEQ IDN0 :12。
9.一种用于大豆病毒病害实时荧光PCR检测的试剂盒，至少包括根据权利要求8所述 的两组以上的病毒的一对引物和对应的寡核苷酸探针。
10.一种用于大豆病毒病害实时荧光PCR检测的试剂盒，包括根据权利要求7所述的四 组病毒的一对引物和对应的寡核苷酸探针。
全文摘要
本发明涉及一种同时检测烟草环斑病毒、南方菜豆花叶病毒、番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒四种中一种或多种大豆病毒病害的简单、快速、特异、灵敏的实时荧光PCR检测方法及其试剂盒。所述实时荧光PCR检测方法使用SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8中的引物序列和SEQID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12中的寡核苷酸探针。本发明的实时荧光PCR检测方法及其试剂盒适合于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。
文档编号C12N15/11GK101857904SQ20091010653
公开日2010年10月13日 申请日期2009年4月10日 优先权日2009年4月10日
发明者王颖, 程颖慧, 章桂明, 陈枝楠 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心