专利名称：一种猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表达及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及兽药领域，具体涉及一种猪II型细环病毒TTSUV2-0RF1截短蛋白的酵母表达及应用。
背景技术：
输血传播病毒(Transufson Transmitted Viurs, TTV)是一类无囊膜，二十面体，单股负链环状DNA病毒，电镜观察病毒颗粒直径约为30-32nm。TTV首次由日本学者从一例未知病原的非甲-非戊型输血后肝炎病人的血清中发现，随后人们在非灵长类以及猪、牛、羊、犬，猫、家禽等多种家养及野生动物体内也发现了 TTV的感染。2009年，国际病毒分类协会(ICTV)将猪的TTV划分到指环病毒科(AnelIoviridae)细环病毒属(Iotatorquevirus), 并进一步划分为两个种猪I型细环病毒(Torque teno sus virus1:TTSuVl)和猪II型细环病毒(Torque teno sus virus I1:TTSuV2)。作为一种较为新型的病毒，TTSuV2的致病机理知之甚少。2004年，McKeown对中国，爱荷华州，泰国，安大略，韩国，西班牙，魁北克和萨斯喀彻温省这六个不同国家地区的154份猪血清进行检测，TTSuV2阳性率可高达66. 2%(102/154)。Aramouni等证实了 TTSuV2与断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)和猪皮炎肾病综合征(PDNS)之间有一定的联系并发现TTSuV2与其他已知的猪病原体协同感染可以导致疾病加重。近年来，关于TTSuV2和TTSuV2的报道逐渐增多，TTSuV2的感染具有广泛性和普遍性，这一特点引起了诸多科研工作者的关注。因此，加强对TTSuV2的流行病学调查，确定其抗原性位点，对TTSuV2的防治有十分重要的意义。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种猪II型细环病毒TTSUV2-0RF1截短蛋白的酵母表达，获得酵母表达的TTSuV2-0RFl截短蛋白作为包被抗原在用于TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒中，提高试剂盒的特异性、重复性及稳定性。本发明的另一目的在于提供一种酵母表达的TTSUV2-0RF1截短蛋白在TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒中的应用。本发明的又一目的在于提供一种TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒，采用本发明的酵母表达的TTSUV2-0RF1截短蛋白作为包被抗原，以获得具有良好特异性、重复性和稳定性的TTSuV2抗体诊断试剂盒。本发明的目的之四在于提供一种酵母表达的TTSUV2-0RF1截短蛋白在猪II型细环病毒亚单位疫苗中的应用。为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下猪II型细环病毒TTSUV2-0RF1截短蛋白的酵母表达，其包括以下步骤I) TTSuV2 ORFl待表达片段的选择以TTSuV2阳性样品的核酸为模板，在病毒基因序列的保守区设计引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，应用LATaqDNA聚合酶扩增目的片段；对扩增产物进行电泳，切下目的条带，利用OMEGA胶回收试剂盒回收DNA，对纯化的片段进行测序，使用ClustalX软件包对测序结果进行序列匹配和多重序列比对，获取TTSuV2ORFl 序列 SEQ IDNO: 3 ；2) TTSuV2 ORFr片段的选择应用ProtScale氨基酸分析软件在上述的TTSuV2ORFl序列SEQ ID NO:3中选出预测抗原性较强且抗原区较为集中的TTSuV2 0RF1’序列为SEQ ID NO:4的蛋白片段；3)TTSuV2 0RF1’的酵母表达构建插入TTSuV2 0RF1’的pPICZ a A重组质粒，电转化P. pastoris X-33酵母菌，筛选重组TTSuV2 0RF1’的高拷贝子，获取真核表达的TTSuV20RF1，目的蛋白片段；4)TTSuV2 0RF1’目的蛋白片段的鉴定与纯化筛选出的高拷贝子，用50%硫酸铵沉淀上清中蛋白，用8M的尿素溶解沉淀的蛋白，应用亲和层析的方法纯化重组TTSuV2ORFl ’，在PBS中透析后，应用BCA法进行定量，纯化后获得酵母表达的TTSuV2_0RFl截短蛋 白。本发明中，步骤I)应用LA TaqDNA聚合酶扩增目的片段的反应程序为94°C预变性5min，94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸120s,共30个循环;72°C延伸8min ;反应完成后用1. 0%的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳。本发明中，步骤3)的具体过程为应用Primer Premier5. O设计引物SEQ IDNO: 5和引物SEQ ID N0:6,以TTSuV2阳性核酸为模板，应用Kod plus高保真酶的PCR扩增反应获得目的条带，电泳、纯化目的条带；双酶切PCR产物及载体pPICZ α Α，连接，转化E. coli DH5a后测序验证载体正确性，提取构建正确的重组质粒pPICZ a - TTSuV2 ORFI’，Sac I单酶切线性化；将酵母菌X -33制备成感受态细胞，取出80 μ I感受态细胞与5 10 μ g线性化的重组表达质粒混合，转入O. 2cm电转杯，电转化，将菌液用Iml冰浴山梨醇10倍稀释后，涂布于基本葡萄糖培养基选择平板上，置于30°C培养2 3d，在200-1000 μ g/ml浓度段的Zeocin的YPD平板上筛选具有1000 μ g/ml Zeocin抗性且生长良好的菌株作为表达株，接种单菌落于25ml BMGY培养基，于30°C培养至OD6tltol ^ 4.0，离心、收集菌体，用IOOmlBMMY培养基重悬培养,每日取样Iml,并补加纯甲醇于培养基至终浓度为O. 5%,诱导表达5d,取样品离心收集上清作SDS-PAGE分析，以Ant1-HIS_antibody为第一抗体，WesternBlotting获得真核表达的TTSuV2 0RF1’目的蛋白片段。本发明中，所述Kod plus高保真酶的PCR扩增反应程序为94°C预变性5min ；94°C变性30s，52°C退火30s，68°C延伸40s,设置30个循环；68°C延伸8min。本发明所述的酵母表达的猪II型细环病毒TTSUV2-0RF1截短蛋白作为包被抗原在TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒中的应用。一种TTSUV2抗体间接ELISA诊断试剂盒，其包括用本发明所述的酵母表达的猪II型细环病毒TTSuV2-0RFl截短蛋白包被抗原包被的酶标板，100 μ 1TTSuV2阳性对照血清，100 μ I TTSuV2阴性对照血清，100 μ I HRP标记兔抗猪二抗，100 μ I抗体稀释液、100 μ I显色液、100 μ I终止液以及洗脱液。上述TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒中，所述HRP标记兔抗猪二抗液是兔抗猪二抗与HRP保护液按照体积比为1: 2000-5000的比例稀释；所述抗体稀释液为O. 1%BSA1. Og 加入 PBS 至 IOOOrnl ;所述显色液为 50mg TMB, IOmLDMSO, 9. 8g 柠檬酸和1. 2ml30%H202加蒸馏水定容至IOOOml ;所述终止液为双蒸水178. 3mL和98%的浓硫酸21. 7mL混
口 O上述TTSUV2抗体间接ELISA诊断试剂盒中所述酵母表达的猪II型细环病毒TTSuV2-0RFl截短蛋白包被抗原的包被浓度为O. 25-1 μ g/ml。本发明所述的酵母表达的TTSUV2-0RF1截短蛋白在猪II型细环病毒亚单位疫苗中的应用。本发明的有益效果在于本发明获得酵母表达的TTSUV2-0RF1截短蛋白作为包被抗原在用于TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒中，提高试剂盒的特异性、重复性及稳定性。本发明获得的酵母表达的TTSuV2 ORFl截短蛋白还可以应用于猪II型细环病毒亚单位疫苗 中。下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细说明。
图1 :酵母表达的 TTSuV2 ORFl 截短蛋白的 SDS-PAGE 及 Western-blotting 图a)泳道1:毕赤酵母分泌表达TTSuV2 0RF1’后的上清SDS-PAGE图(50%硫酸铵沉淀);泳道2 :毕赤酵母分泌表达TTSuV2 ORFr后的上清SDS-PAGE图(未浓缩上清);泳道
3:毕赤酵母阴性对照上清SDS-PAGE图(转化分泌表达空质粒的阴性对照)；ml :非预染蛋白marker ；b)m2 :蛋白预染marker ;泳道1:毕赤酵母分泌表达TTSuV2 0RF1’后的上清Western-blotting图；泳道2 :毕赤酵母阴性对照上清Western-blotting图；泳道3 :纯化后的酵母表达的TTSuV2 0RF1’ Western-blotting鉴定图；c)泳道1:纯化后的酵母表达的TTSuV2 ORFl’SDS-PAGE图；泳道2 阴性对照；ml 非预染蛋白marker,图中箭头所指均为重组TTSuV2 0RF1’ ；图2为本发明的免疫后血清OD值。
具体实施例方式以下是本发明的具体实施例，猪II型细环病毒TTSUV2-0RF1截短蛋白的酵母表达，包括以下步骤I) TTSuV2 ORFl待表达片段的选择以TTSuV2阳性样品的核酸为模板，在病毒基因序列的保守区设计引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，应用LATaqDNA聚合酶扩增目的片段，反应程序为94°C预变性5min，94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸120s，共30个循环；72°C延伸8min ;反应完成后用1. 0%的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳；对扩增产物进行电泳，切下目的条带，利用OMEGA胶回收试剂盒回收DNA，对纯化的片段进行测序，使用ClustalX软件包对测序结果进行序列匹配和多重序列比对，获取TTSuV2 ORFl序列SEQIDNO:3 ；2) TTSuV2 0RF1’片段的选择应用ProtScale氨基酸分析软件在上述的TTSuV2ORFl序列SEQ ID NO:3中选出预测抗原性较强且抗原区较为集中的TTSuV2 0RF1’序列为SEQ ID NO:4的蛋白片段；3)TTSuV2 0RF1’的酵母表达构建插入TTSuV2 0RF1’的pPICZ a A重组质粒，电转化P. pastoris X - 33酵母菌，筛选重组TTSuV2 0RF1’的高拷贝子，获取真核表达的TTSuV2 0RF1，目的蛋白片段；具体程序为应用PrimerPremier5. O设计引物SEQ ID NO: 5和引物SEQ ID N0:6,以TTSuV2阳性核酸为模板，应用Kod plus高保真酶的PCR扩增反应获得目的条带，反应程序为94°C预变性5min ;94°C变性30s，52 °C退火30s，68 °C延伸40s，设置30个循环；68°C延伸8min ;电泳、纯化目的条带；双酶切PCR产物及载体pPICZ α A，连接，转化E. coli DH5a后测序验证载体正确性，提取构建正确的重组质粒pPICZ a -TTSuV2ORFr , Sac I单酶切线性化；将酵母菌X-33制备成感受态细胞，取出80 μ I感受态细胞与5 10 μ g线性化的重组表达质粒混合,转入O. 2cm电转杯，电转化，将菌液用Iml冰浴山梨醇10倍稀释后，涂布于基本葡萄糖培养基选择平板上，置于30°C培养2 3d，在200-1000 μ g/ml浓度段的Zeocin的YPD平板上筛选具有1000 μ g/ml Zeocin抗性且生长良好的菌株作为表达株，接种单菌落于25ml BMGY培养基，于30°C培养至OD6tltlnm 4. 0，离心、收集菌体，用100ml BMMY培养基重悬培养,每日取样Iml,并补加纯甲醇于培养基至终浓度为O. 5%，诱导表达5d，取样品离心收集上清作SDS-PAGE分析，以Ant1-HIS-antibody为第一抗体，Western Blotting获得真核表达的TTSuV2 0RF1’目的蛋白片段； 4)TTSuV2 0RF1’目的蛋白片段的鉴定与纯化筛选出的高拷贝子，用50%硫酸铵沉淀上清中蛋白，用8M的尿素溶解沉淀的蛋白，应用亲和层析的方法纯化重组TTSuV2ORFl ’，在PBS中透析后，应用BCA法进行定量，纯化后获得酵母表达的TTSuV2_0RFl截短蛋白。应用实施例1酵母表达的TTSuV2 ORFl截短蛋白在TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒中的应用，具体步骤如下I)抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定采用棋盘滴定法，将纯化的酵母表达的TTSuV2 ORFl截短蛋白在酶标板上从左到右以起始浓度为4 μ g/ml按照在后的孔浓度为在先孔浓度的1/2的梯度浓度稀释包被酶标板，最后一列作为空白对照；每孔100μ L，37°C放置I小时；用PBST洗板I次，每孔加入10%羔羊血清，37°C封闭I小时，阳性对照血清和阴性对照血清分别进行梯度稀释，自上而下加入到反应板中，每孔加入100 μ 1，最后一行为无血清对照，37°C反应I小时，PBST洗涤3次，每孔加入100 μ I的HRP标记兔抗猪二抗，37°C反应I小时，PBST洗涤3次，，每孔加入底物显色液100 μ 1，避光显色10分钟，每孔加入100 μ I终止液，于450nm处读数仪读取OD值，620nm作为参考波长。结果确立包被抗原的最佳包被浓度为0. 25-1 μ g/ml，血清最佳稀释倍数为10-100倍；2)试剂盒的组装与优化将纯化的酵母表达的TTSuV2 ORFl截短蛋白稀释到O. 25-1 μ g/mL,加到酶标板上，每孔100 μ L，4°C包被6-8小时或37°C I小时，用PBST洗板I次，每孔加入含10%羔羊血清的PBST，37°C封闭I小时。将待检血清样品用PBST稀释10-100倍，加到酶标板上，每孔100 μ L，设置阴性和阳性对照，37°C反应I小时，PBST洗涤3次，每孔加入100 μ L 2000-5000倍稀释的HRP标记兔抗猪二抗，37°C反应I小时，PBST洗涤3次，每孔加入底物显色液100 μ L，避光显色3-10分钟，每孔加入100 μ I终止液，于450nm处读数仪读取OD值，620nm作为参考波长。应用实施例2
应用本发明的TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒检测血清(I)将酵母表达的TTSuV2-0RFl截短蛋白用稀释至O. 25 μ g/mL，加到酶标板上，每孔100μ 1，4°C包被过夜6-8小时，用PBST洗板I次，每孔加入含10%羔羊血清的PBST，37°C封闭I小时；(2)将待检血清样品用PBST稀释40倍，加到酶标板上，每孔100 μ 1，设置阴性和阳性对照，37°C反应I小时，所有样本均设置两个重复；(3)PBST洗涤3次，每孔加入100 μ I 3000倍稀释的HRP标记兔抗猪二抗，37°C反应I小时，PBST洗涤3次，每孔加入底物显色液100 μ I，避光显色8分钟，每孔加入100 μ I终止液，于450nm处读数仪读取OD值，重复实验两次，结果如下表1:表1:应用TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒检测72份血清样品所对应的平均OD值
权利要求
1.一种猪II型细环病毒TTSUV2-0RF1截短蛋白的酵母表达，其特征在于其包括以下步骤 1)TTSuV2 ORFl待表达片段的选择以TTSuV2阳性样品的核酸为模板，在病毒基因序列的保守区设计引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，应用LA TaqDNA聚合酶扩增目的片段；对扩增产物进行电泳，切下目的条带，利用OMEGA胶回收试剂盒回收DNA，对纯化的片段进行测序，使用Clustal X软件包对测序结果进行序列匹配和多重序列比对，获取TTSuV2ORFl 序列 SEQ ID NO:3 ； 2)TTSuV2ORFr片段的选择应用ProtScale氨基酸分析软件在上述的TTSuV2 ORFl序列SEQ ID NO:3中选出预测抗原性较强且抗原区较为集中的TTSuV2 ORFI’序列为SEQID N0:4的蛋白片段； 3)TTSuV2ORFr的酵母表达构建插入TTSuV2 0RF1’的pPICZ a A重组质粒，电转化P. pastoris X-33酵母菌，筛选重组TTSuV2 0RF1’的高拷贝子，获取真核表达的TTSuV20RF1，目的蛋白片段； 4)TTSuV2 ORFr目的蛋白片段的鉴定与纯化筛选出的高拷贝子，用50%硫酸铵沉淀上清中蛋白，用8M的尿素溶解沉淀的蛋白，应用亲和层析的方法纯化重组TTSuV2 ORFr,在PBS中透析后，应用BCA法进行定量，纯化后获得酵母表达的TTSuV2-0RFl截短蛋白。
2.根据权利要求1所述的猪II型细环病毒TTSUV2-0RF1截短蛋白的酵母表达，其特征在于步骤I)应用LA TaqDNA聚合酶扩增目的片段的反应程序为94°C预变性5min，94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸120s，共30个循环；72°C延伸8 min ;反应完成后用1. 0%的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳。
3.根据权利要求1所述的猪II型细环病毒TTSUV2-0RF1截短蛋白的酵母表达，其特征在于步骤3)的具体过程为应用Primer Premier5. O设计引物SEQ ID NO:5和引物SEQID NO: 6，以TTSuV2阳性核酸为模板，应用Kod plus高保真酶的PCR扩增反应获得目的条带，电泳、纯化目的条带；双酶切PCR产物及载体pPICZ αΑ，连接，转化E. coli DH5 α后测序验证载体正确性，提取构建正确的重组质粒pPICZ a - TTSuV2 ORFI’，Sac I单酶切线性化；将酵母菌X-33制备成感受态细胞，取出80 μ I感受态细胞与5 10 μ g线性化的重组表达质粒混合，转入O. 2 cm电转杯，电转化，将菌液用I ml冰浴山梨醇10倍稀释后，涂布于基本葡萄糖培养基选择平板上，置于30°C培养2 3d，在200-100(^g/ml浓度段的Zeocin的YPD平板上筛选具有lOOOPg/ml Zeocin抗性且生长良好的菌株作为表达株，接种单菌落于25 ml BMGY培养基，于30°C培养至0D6(l(lmi 4. 0，离心、收集菌体，用100 ml BMMY培养基重悬培养，每日取样Iml,并补加纯甲醇于培养基至终浓度为O. 5%,诱导表达5d,取样品离心收集上清作 SDS -PAGE 分析，以 Ant1-HIS -antibody 为第一抗体,Western Blotting获得真核表达的TTSuV2 ORFr目的蛋白片段。
4.根据权利要求3所述的猪II型细环病毒TTSUV2-0RF1截短蛋白的酵母表达，其特征在于所述Kod plus高保真酶的PCR扩增反应程序为94°C预变性5min ;94°C变性30s，52°C退火30s，68°C延伸40s,设置30个循环；68°C延伸8min。
5.权利要求1所述的酵母表达的TTSuV2-0RFl截短蛋白作为包被抗原在TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒中的应用。
6.一种TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于其包括用权利要求1所述的酵母表达的TTSuV2-0RFl截短蛋白包被抗原包被的酶标板，100 μ I TTSuV2阳性对照血清，100 μ I TTSuV2阴性对照血清，100 μ I HRP标记兔抗猪二抗，100 μ I抗体稀释液、100 μ I显色液、100 μ I终止液以及洗脱液。
7.根据权利要求6所述的TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于所述HRP标记兔抗猪二抗液是兔抗猪二抗与HRP保护液按照体积比为1: 2000-5000的比例稀释；所述抗体稀释液为O. 1%BSA1. Og加入PBS至IOOOml ;所述显色液为50mg TMB，IOmL DMSO,.9.8g柠檬酸和1. 2ml 30% H2O2加蒸馏水定容至IOOOml ;所述终止液为双蒸水178. 3mL和98%的浓硫酸21. 7mL混合。
8.根据权利要求6所述的TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于所述酵母表达的TTSuV2-0RFl截短蛋白包被抗原的包被浓度为O. 25-1 μ g/ml。
9.权利要求1所述的酵母表达的TTSUV2-0RF1截短蛋白在猪II型细环病毒亚单位疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开一种猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白TTSuV2ORF1’的酵母表达及应用。本发明通过获取TTSuV2ORF1基因全序列、TTSuV2ORF1蛋白抗原性分析、对截短TTSuV2ORF1’序列的酵母表达、TTSuV2ORF1’截短蛋白的鉴定与纯化，获得真核表达的截短蛋白TTSuV2ORF1’，将该蛋白作为包被抗原用于TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒，试剂盒具有较高的特异性、重复性及稳定性。本发明获得的截短表达的TTSuV2ORF1’重组蛋白还可以应用于猪Ⅱ型细环病毒亚单位疫苗中。
文档编号A61P31/20GK103014056SQ20121048662
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月23日 优先权日2012年11月23日
发明者李中圣, 陈轶雯, 赖芳芳, 赵焱 申请人:广东现代农业集团研究院有限公司