专利名称：皂角刺总黄酮在制备预防和治疗肿瘤药物方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于皂角刺总黄酮应用技术领域，具体涉及皂角刺总黄酮作为细胞连接通讯增强剂，在制备预防和治疗肿瘤药物方面的应用，尤其是在肿瘤预防、肿瘤化疗增效、组织增生方面的应用，如预防化学致癌、提高肿瘤化疗指数、逆转肿瘤化疗耐药、阻止乳腺增生和前列腺增生等。
背景技术：
细胞通讯通过细胞间连接，在细胞多种生理方面起重要作用，如调解细胞生长和分化、维持组织稳态和胚胎发育等，是细胞间通道的集合器，负责实体组织中邻近细胞间的离子和小分子直接交换，其功能紊乱与多种疾病如组织增生、肿瘤形成等直接相关。细胞间通讯依靠间隙连接蛋白形成的蛋白通道维持，其中已知的重要间隙连接蛋白是间隙连接蛋白43(ConneXin 43)，在多种过度增殖的增生组织及肿瘤组织中表达减少。因此，升高间隙 连接蛋白43可以恢复细胞间连接通讯的正常化，对组织稳态失常化疾病有潜在的预防和治疗作用。调节组织稳态、维持阴阳平衡是中药治疗疾病的主要特色。皂角刺，又称天丁、皂针等，为豆科植物阜荚(Gleditsiasinensis Lain)的干燥棘刺,主要产于江苏、湖北，以及四川和贵州等地，有破血散结、消肿止痛、祛风止痒、通经活络之功。皂角刺在中医临床中应用历史悠久，《本草纲目》记载其“消肿脱毒，妒乳，风疠恶疮，排脓，杀虫”。现代医学证实，皂角刺辛散性强，善通经活血，药力能直达病所，是一味具有温通消结功能的良药。皂角刺总黄酮是一类主含黄酮类化合物的皂角刺精提物。本申请首次发现皂角刺总黄酮是一个细胞连接通讯增强剂，有很好的预防和逆转肿瘤耐药作用，并能阻止组织增生，进而对其在医药中潜在的临床应用进行了深入的研究。
发明内容
本发明目的在于提供皂角刺总黄酮作为细胞连接通讯增强剂，在制备预防和治疗肿瘤药物方面的应用。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案
皂角刺总黄酮作为细胞连接通讯增强剂，在制备预防和治疗肿瘤药物方面的应用。进一步的，皂角刺总黄酮在制备抗癌药物方面的应用，尤其是在制备抗皮肤癌、肺癌、乳腺癌及治疗乳腺增生或前列腺增生药物方面的应用。皂角刺总黄酮作为细胞连接通讯增强剂，可用于预防化学致癌、提高肿瘤化疗指数、逆转肿瘤化疗耐药、阻止乳腺增生和前列腺增生等组织稳态失常化疾病。其动物有效剂量范围为口服50-5000mg/kg体重/日、注射20-2000mg / kg体重/日，优选剂量为口服IOO-IOOOmg /kg体重/日、注射50-500mg /kg体重/日。推算的人用有效剂量范围为口服O. 4-40g /日、注射O. 16-16g /日，优选剂量为口服O. 8-8g/日、注射0.4_4g/日。所述皂角刺总黄酮可按照本领域常规技术进行提取即可。如，在本发明中，皂角刺总黄酮可按下述方法获取将洗净、烘干、粉碎过的皂角刺经石油醚脱脂后，用体积浓度60 — 80%的乙醇水溶液按液料比20 — 30 I于80±5°C提取2次，每次2h，过滤，合并提取液并浓缩至每ml相当于O. Ig原药材，分别经95%乙醇(指体积浓度，下同)、80%乙醇各醇沉I次，过滤，滤液再经大孔吸附树脂吸附、70%乙醇洗脱，洗脱液真空干燥后即得。以芦丁为标准经分光光度测定总黄酮含量>90%。本发明经试验发现皂角刺总黄酮作为细胞连接通讯增强剂，可用于预防化学致癌、提高肿瘤化疗指数、逆转肿瘤化疗耐药、阻止乳腺增生和前列腺增生等组织稳态失常化疾病。皂角刺总黄酮对二甲基苯蒽/巴豆油引起的小鼠皮肤癌及乌拉坦引起的小鼠肺癌均有显著降低发病率作用(见图I、图2);对阿霉素、环磷腺癌、氟尿嘧啶治疗的小鼠lewis肺癌皮下肿瘤均有增效作用(见图3、图4);可以逆转阿霉素耐药小鼠乳腺癌4T1及阿霉素耐药小鼠肺癌lewis对阿霉素的治疗抵抗作用(见图5、图6、图7)。皂角刺总黄酮对小鼠乳腺增生和前列腺增生均有抑制作用(见图8、图9);能升高诱癌组织、肿瘤组织和增生组织间隙连接蛋白43(见图10、图11),增加阿霉素耐药小鼠肺癌lewis和正常小鼠肺癌lewis细胞间通讯(见图12)。 综合上述试验结果，本发明内容可概括以下几个方面①皂角刺总黄酮对诱癌组织、肿瘤组织和增生组织间隙连接蛋白43含量有升高作用，增强肿瘤细胞间通讯，是一个细胞连接通讯增强剂。②皂角刺总黄酮对二甲基苯蒽/巴豆油引起的小鼠皮肤癌及乌拉坦引起的小鼠肺癌均有抑制作用，可以预防化学致癌。③皂角刺总黄酮对阿霉素、环磷腺癌、氟尿嘧啶治疗的小鼠lewis肺癌皮下肿瘤均有增效作用，可以提高肿瘤化疗指数。④皂角刺总黄酮可以逆转阿霉素耐药小鼠乳腺癌4T1及阿霉素耐药小鼠肺癌lewis对阿霉素的治疗抵抗作用，可以逆转肿瘤化疗耐药。⑤皂角刺总黄酮对小鼠乳腺增生和前列腺增生均有抑制作用，可以阻止组织增生。
图I代表皂角刺总黄酮对二甲基苯蒽/巴豆油引起的小鼠皮肤癌及乌拉坦引起的小鼠肺癌发病率的影响；
图2代表皂角刺总黄酮对二甲基苯蒽/巴豆油引起的小鼠皮肤肿瘤数及乌拉坦引起的小鼠肺肿瘤结节数的影响(n=20);注与模型组比较1ZXO. 05，2/X0. 01 ；
图3代表皂角刺总黄酮对阿霉素、环磷腺癌、氟尿嘧啶治疗的小鼠lewis肺癌皮下肿瘤生长的影响(n=10);注与模型组比较2ZXO-Ol ；
图4代表皂角刺总黄酮对阿霉素、环磷腺癌、氟尿嘧啶治疗的小鼠lewis肺癌皮下肿瘤大小及肺转移的影响(n=10);注与模型组比较2/X0. 01 ；
图5代表皂角刺总黄酮对阿霉素耐药小鼠lewis肺癌皮下肿瘤生长的影响(n=10)；注与模型组比较2ZXO. 01 ；
图6代表皂角刺总黄酮对阿霉素耐药小鼠4T1乳腺癌原位肿瘤生长的影响(n=10)；注与模型组比较2ZXO. 01 ；
图7代表皂角刺总黄酮对阿霉素耐药小鼠lewis肺癌皮下肿瘤及阿霉素耐药小鼠4T1乳腺癌原位肿瘤大小和肺转移的影响(n=10);注与模型组比较2/X0. 01 ；
图8代表皂角刺总黄酮对小鼠乳腺增生的影响(n=10);注与模型组比较1ZXO. 05，2ZXO. 01 ；
图9代表皂角刺总黄酮对小鼠前列腺增生的影响(n=10);注与模型组比较1ZXO. 05，2ZXO. 01 ；
图10代表皂角刺总黄酮对诱癌组织及增生组织间隙连接蛋白43的影响(n=3);注 与模型组比较2ZXO. 01 ；
图11代表皂角刺总黄酮对肿瘤组织间隙连接蛋白43的影响(n=3);注与模型组比较2ZXO. 01 ；
图12代表皂角刺总黄酮对阿霉素耐药小鼠肺癌lewis和正常小鼠肺癌lewis细胞间通讯的影响(n=10);注与空白对照组比较2P〈0. 01。
具体实施例方式本发明对皂角刺总黄酮作为一个细胞连接通讯增强剂及其在医药中的应用进行了试验，皂角刺总黄酮口服、注射均有效，下面各试验以皂角刺总黄酮口服为例。试验中用到的皂角刺总黄酮按下述方法获取将洗净、烘干、粉碎过的皂角刺经石油醚脱脂后，用体积浓度70%的乙醇水溶液按液料比25 I于80°C提取2次，每次2h，过滤，合并提取液并浓缩至每ml相当于O. Ig原药材，分别经95%乙醇(添加量以乙醇浓度占溶液体积总量的70%为宜)、80%乙醇(添加量以乙醇浓度占溶液体积总量的50%为宜)各醇沉I次，过滤，滤液再经大孔吸附树脂吸附、70%乙醇洗脱，洗脱液真空干燥即得后黄色的粉状固体皂角刺总黄酮。以芦丁为标准经分光光度测定总黄酮含量>90%。实验I.皂角刺总黄酮对二甲基苯蒽/巴豆油引起小鼠皮肤癌的影响
实验方法将100只昆明小鼠适应性喂养I周后随机分为5组，每组20只，雌雄各半，分别为正常对照组，模型组，皂角刺总黄酮低剂量、中剂量、高剂量组(50mg/kg体重/日、100mg/kg体重/日、200mg/kg体重/日)。正常组和模型组饮正常水和食正常饲料，皂角刺总黄酮各剂量组按每只小鼠日食量将皂角刺总黄酮按所需剂量浓度掺入饲料中喂饲小鼠，从实验分组后开始到处死小鼠全程喂饲。除正常对照小鼠外，将其他实验组小鼠用理发电推除去背部毛发，于实验第I天背部脱毛区涂二甲基苯蒽丙酮液200 μ I (150 μ g)，每周I次，共4次；第22天起在相同部位涂O. 25%巴豆油丙酮液200 μ 1，每周2次，连续20周。第40周计数各组出现皮肤肿瘤的小鼠数和每只小鼠皮肤出现的肿瘤数。颈椎脱白法处死全部小鼠，切取诱癌部位冻存于_80°C用于致癌组织间隙连接蛋白43检测。结果模型组20只小鼠全部发生皮肤癌，平均每鼠皮肤出现肿瘤的数目为4. 5个；皂角刺总黄酮低剂量、中剂量、高剂量组20只小鼠发生皮肤癌的小鼠分别为15只、11只、8只(见图1)，平均每鼠皮肤出现肿瘤的数目分别为3. I个、2. 5个、I. 6个(见图2)。 实验2 :皂角刺总黄酮对乌拉坦引起小鼠肺癌的影响
实验方法将100只昆明小鼠适应性喂养I周后随机分为5组，每组20只，雌雄各半，分别为正常对照组，模型组，皂角刺总黄酮低剂量、中剂量、高剂量组(50mg/kg体重/日、100mg/kg体重/日、200mg/kg体重/日)。正常组和模型组饮正常水和食正常饲料，皂角刺总黄酮各剂量组按每只小鼠日食量将皂角刺总黄酮按所需剂量浓度掺入饲料中喂饲小鼠，从实验分组后开始到处死小鼠全程喂饲。除正常对照小鼠外，其他实验组小鼠于实验第I天腹腔注射乌拉坦1000mg/kg，每周I次,共5次。第30周颈椎脱臼法处死全部小鼠，计数各组出现肺肿瘤的小鼠数和每只小鼠肺表面出现的肿瘤结节数，并取小鼠肺脏冻存于_80°C用于致癌组织间隙连接蛋白43检测。结果模型组20只小鼠全部发生肺癌，平均每鼠肺表面出现的肿瘤结节数为13. I个；过山蕨黄酮低剂量、中剂量、高剂量组20只小鼠发生肺癌的小鼠分别为17只、14只、10只(见图I)，平均每鼠肺表面出现的肿瘤结节数分别为8. 5个、4. 8个、2. 2个(见图2)。实验3 :皂角刺总黄酮对阿霉素、环磷酰胺、氟尿嘧啶治疗的小鼠lewis肺癌皮下肿瘤生长的影响
实验方法取生长良好的lewis肺癌传代实体瘤，用生理盐水制备瘤细胞悬液，调细胞数I X IO6个细胞/ml，按O. 2 ml/只接种于80只雌性C57BL /6小鼠右前肢腋部皮下。将肿瘤接种小鼠随机分为8组，每组10只，分别为模型组，皂角刺总黄酮组(100mg/kg体重/日)，阿霉素组(5mg/kg体重/日)、环磷酰胺组(10mg/kg体重/日)、氟尿嘧啶组 (15mg/kg体重/日)、皂角刺总黄酮+阿霉素组、皂角刺总黄酮+环磷酰胺组、皂角刺总黄酮+氟尿嘧啶组。肿瘤接种后次日，模型组和正常组灌胃生理盐水10ml/kg，皂角刺总黄酮组灌胃相应剂量的皂角刺总黄酮水溶液，环磷酰胺组和氟尿嘧啶组腹腔注射相应剂量的药物，每日I次，连续3周；阿霉素组尾静脉注射相应剂量的药物，每周I次，共3次；两种药物联用组按2种药物单独使用时的剂量和方式联合治疗。肿瘤长出后每周用游标卡尺测量肿瘤直径2次，肿瘤大小按下面公式计算肿瘤体积(mm3)=肿瘤长度X肿瘤宽度X肿瘤宽度/ 2。肿瘤接种后22日颈椎脱白法处死全部小鼠，剥离接种部位肿瘤，称重，取部分瘤组织冻存于_80°C用于瘤组织间隙连接蛋白43检测检测。另剥离小鼠肺脏，检测出现肺肿瘤的小鼠数和每只小鼠肺表面出现的肿瘤结节数，评价皂角刺总黄酮对阿霉素、环磷酰胺、氟尿嘧啶治疗的小鼠lewis肺癌皮下肿瘤生长的影响。结果模型组小鼠皮下肿瘤生长较快，并全部出现肺转移。与模型组比较，阿霉素、环磷酰胺和氟尿嘧啶组小鼠皮下肿瘤生长虽均明显减缓，但肿瘤肺转移并无减轻。皂角刺总黄酮对小鼠皮下肿瘤生长抑制作用虽比阿霉素、环磷酰胺和啶氟尿嘧啶弱，但可同时可阻止肿瘤肺转移。皂角刺总黄酮与阿霉素、环磷酰胺和氟尿嘧联合后对小鼠皮下肿瘤生长抑制作用明显增强，且能显著降低肺转移(见图3，图4)。实验4 :皂角刺总黄酮对阿霉素耐药小鼠肺癌lewis皮下肿瘤及阿霉素耐药小鼠4T1乳腺癌阿霉素治疗抵抗的影响
实验方法体外阿霉素浓度递增法建立阿霉素耐药小鼠乳腺癌4T1及阿霉素耐药小鼠肺癌lewis细胞。取对数生长期阿霉素耐药lewis肺癌细胞，用生理盐水调细胞数5X IO5个/ ml，以O. 2ml/只接种于40只雌性C57BL/6小鼠右前肢腋部皮下；或对数生长期阿霉素耐药4T1乳腺癌细胞，用生理盐水调细胞数3X IO5个/ml，以O. Im I/只接种于40只雌性BALB/c小鼠右侧第2乳头脂肪垫下。将肿瘤接种小鼠随机分为4组，每组10只，分别为模型组，皂角刺总黄酮组(100mg/kg体重/日)，阿霉素组(5mg/kg体重/日)，皂角刺总黄酮+阿霉素组。肿瘤接种后次日，模型组和正常组灌胃生理盐水10ml/kg，皂角刺总黄酮组灌胃相应剂量的皂角刺总黄酮水溶液，每日I次，连续3周；阿霉素组尾静脉注射相应剂量的药物，每周I次，共3次；两种药物联用组按2种药物单独使用时的剂量和方式联合治疗。肿瘤长出后每周用游标卡尺测量肿瘤直径2次，肿瘤大小按下面公式计算肿瘤体积(mm3)=肿瘤长度X肿瘤宽度X肿瘤宽度/ 2。肿瘤接种后22日颈椎脱白法处死全部小鼠，剥离接种部位肿瘤，称重，取部分瘤组织冻存于-80°C用于瘤组织间隙连接蛋白43检测检测。另剥离小鼠肺脏，检测出现肺肿瘤的小鼠数和每只小鼠肺表面出现的肿瘤结节数，评价皂角刺总黄酮对阿霉素耐药小鼠肺癌lewis皮下肿瘤及阿霉素耐药小鼠4T1乳腺癌阿霉素治疗抵抗的影响。结果模型组阿霉素耐药小鼠肺癌lewis皮下肿瘤及阿霉素耐药小鼠4T1乳腺癌生长较快，并全部出现肺转移。与模型组比较，阿霉素组小鼠肿瘤生长抑制仅为越20%，显示对阿霉素治疗抵抗，并且肿瘤肺转移无减轻。皂角刺总黄酮对阿霉素耐药小鼠肿瘤有抑制作用，同时可阻止肿瘤肺转移。皂角刺总黄酮与阿霉素联合后对小鼠耐药肿瘤阿霉素治疗抵抗有逆转作用，且能显著降低肺转移(见图5、图6和图7)。实验5 :皂角刺总黄酮对小鼠乳腺增生的影响
实验方法将50只昆明雌性小鼠适应性喂养I周后随机分为5组，每组10只，分别为正常对照组，模型组，皂角刺总黄酮低剂量、中剂量、高剂量组(50mg/kg体重/日、100mg/kg 体重/日、200mg/kg体重/日)。除正常对照组外，其余各组小鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇
O.5mg/kg, I次/2d，共注射15次。从实验第I天开始，正常组和模型组饮正常水和食正常饲料，皂角刺总黄酮各剂量组按每只小鼠日食量将皂角刺总黄酮按所需剂量浓度掺入饲料中喂饲小鼠，从实验分组后开始到处死小鼠全程喂饲。造模结束后第5周颈椎脱臼法处死全部小鼠，取右侧第2乳腺用10%甲醛液固定作病理组织切片，HE染色，通过光镜视野下观察乳腺腺泡数、乳腺小叶数、乳腺腺泡腔直径、乳腺胞浆面积、每小叶平均腺泡数及导管的平均直径，以乳腺增生病变记分标准对各组小鼠进行计分。另取部分乳腺组织冻存于_80°C用于增生组织间隙连接蛋白43检测。(O分)腺小叶散在分布，每个小叶腺泡数< 5，腺泡腔不扩张，导管壁较薄，上皮层数约为2-5层；
(I分)乳腺小叶无明显增生，个别腺泡和导管轻度增生，无扩张；
(2分)乳腺小叶增生、体积变大，腺泡数量增多；部分腺泡和导管处于明显扩张状态；(3分)乳腺腺小叶明显增生，部分腺泡和导管处于极度扩张状态，腺上皮细胞呈扁平状，腺泡内及导管内有大量的分泌物。结果正常对照组小鼠无I例乳腺增生症状(O分)，与正常对照组比较，模型组的小叶数、腺胞数、腺泡腔直径、导管平均直径、胞浆面积均明显增加，全部小鼠出现乳腺增生(平均2.4分)。乳腺增生小鼠经皂角刺总黄酮治疗后，乳腺增生各项指标有不同程度降低，50mg/kg体重/日组增生分值大都在1-2分(仅有I例增生3分，平均I. 5分)；IOOmg/kg体重/日组增生分值大都在1-2分(无I例增生3分，平均I. O分)；200mg/kg体重/日组增生分值大都在I分(仅有I例增生2分，平均O. 6分)(见图8)。实验6 :皂角刺总黄酮对小鼠前列腺增生的影响
实验方法将50只昆明雄性小鼠适应性喂养I周后随机分为5组，每组10只，分别为正常对照组，模型组，皂角刺总黄酮低剂量、中剂量、高剂量组(50mg/kg体重/日、100mg/kg体重/日、200mg/kg体重/日)。除正常对照组外其余各组小鼠皮下注射用橄榄油溶解的丙酸睾丸酮5mg/kg，连续3周，正常对照组注射橄榄油溶液，每日造模30min后灌胃给药。从实验第I天开始，正常组和模型组灌胃生理盐水10ml/kg，皂角刺总黄酮各剂量组按所需剂量浓度灌胃皂角刺总黄酮水溶液，每天I次，连续3周。末次造模后小鼠禁食24h处死，分离背侧叶前列腺，剥离干净后立即用电子天平称重，计算前列腺指数。前列腺指数=前列腺湿质量mg/小鼠体重g。取部分前列腺组织用10%甲醛液固定作病理组织切片，HE染色，通过光镜视野下观察组织形态，以前列腺增生病变记分标准对各组小鼠进行计分。另取小鼠前列腺冻存于_80°C用于增生组织间隙连接蛋白43检测。(O分)腺体无增生，间质无纤维增生和炎细胞浸润；
(I分)腺体稍有增生，间质出现2层纤维增生和少数炎细胞浸润；
(2分)腺体明显增生，间质出现3-4层纤维增生和少数炎细胞浸润；
(3分)腺体显著增生，间质出现5-7层纤维增生和少数炎细胞浸润。结果正常对照组小鼠前列腺腺体较少，无I例出现间质纤维增生和炎细胞浸润(O分)。与正常对照组比较，模型组前列腺腺体显著增多，全部小鼠增生分值都在2-3分(平均2. 5分)。前列腺增生小鼠经皂角刺总黄酮治疗后，前列腺增生指标有不同程度降低，·50mg/kg体重/日组增生分值大都在1-2分(仅有2例增生3分，平均I. 7分);100mg/kg体重/日组增生分值大都在1-2分(仅有I例增生3分，平均I. 4分)；200mg/kg体重/日组增生分值大都在I分(无I例增生3分，平均I. O分)(见图9)。实验7 :皂角刺总黄酮对诱癌组织、瘤组织及增生组织间隙连接蛋白43的影响 实验方法将收集冻存的诱癌组织、瘤组织及增生组织用RIPA强裂解液(50 mMTris -
HCl, pH 7.4，150 mM NaCl, l%TritonX-100, I mM EDTA, 100 mM NaVO3, I mMPMSF, O. 1% SDS, 1%去氧胆酸钠，另加蛋白酶抑制剂混合物)提取蛋白。上样50yg蛋白，经10% SDS-PAGE电泳分离后转移到PVDF膜上(德国)，4°C、5%脱脂奶粉-Tris盐酸缓冲液(TBS)封闭，将兔抗(鼠)间隙连接蛋白43单克隆抗体(Anti-Cx 43，1:100,北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)或兔抗(鼠)β肌动蛋白单克隆抗体(Anti-β-Actin, 1:100,北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)加入含5%脱脂奶粉的TBS中，室温下与PVDF膜结合孵育lh，再与辣根过氧化物酶偶联的鼠抗IgG (1:200) 二抗室温下在含5%脱脂奶粉的TBS中结合孵育30mins。抗原抗体结合物检测用化学发光增强底物试剂盒，进行，光带的相对光密度用间隙连接蛋白43和β肌动蛋白的光密度比值表示。结果诱癌组织及增生组织与其相应的正常组织比较，间隙连接蛋白43的光密度值明显降低，皂角刺总黄酮治疗后诱癌组织及增生组织间隙连接蛋白43的光密度值均有不同程度回升，其中皂角刺总黄酮200mg/kg体重/日组使诱癌组织及增生组织间隙连接蛋白43的光密度值回升到相应的正常组织(见图10)。阿霉素耐药的肿瘤及非阿霉素耐药肿瘤经皂角刺总黄酮治疗后瘤组织中间隙连接蛋白43的光密度值比未经皂角刺总黄酮治疗的肿瘤组织显著升高(见图11)。实验8 :皂角刺总黄酮对阿霉素耐药小鼠肺癌lewis和正常小鼠肺癌lewis细胞间通讯的影响
实验方法体外阿霉素浓度递增法建立阿霉素耐药小鼠Lewis肺癌细胞。取对数生长期阿霉素耐药小鼠Lewis肺癌细胞或正常小鼠Lewis肺癌细胞,按2 X IO5个/ml细胞接种在6孔培养板中，贴壁过夜后加入皂角刺总黄酮和RPMI-1640细胞培养液，使皂角刺总黄酮终浓度分别为1μπιο1/1、3μπιο1/1、10μπιο1/1和20ymol/l,同时设不加皂角刺总黄酮的空白对照组。加药后置培养箱内培养48h，弃去培养基，用手术刀在板孔底部表面划痕2条，PBS漂洗3次，将细胞浸入O. 05%的荧光黄染液中，孵育5min，吸净染液，PBS漂洗3次，荧光倒置显微镜下下观察记录染料传递的层次和范围。每孔随机取5处，结果判读选择划痕较平滑处计数带有荧光的细胞层数，对每处计分，计算每孔平均得分。(O分)荧光只出现在划痕旁I列细胞中；
(I分)荧光出现在划痕旁2列细胞中；
(2分)荧光出现在划痕旁3列细胞中；
(3分)荧光出现在划痕旁4列细胞中；
(4分)荧光自划痕两侧传递至邻近的4列细胞或更远距离。结果荧光黄染料划痕负载阿霉素耐药小鼠Lewis肺癌细胞或非阿霉素耐药小鼠Lewis肺癌细胞5 m in后，空白对照组染料主要出现在划痕旁I列细胞中(平均O. 3分)，经皂角刺总黄酮作用48 h后，I μ mol/L组荧光染料主要出现在划痕旁的1-2列细胞内 (平均1.4分)；3 μ mol/L组荧光染料主要出现在划痕旁的2 - 3列细胞内(平均2. 2分)；
10μ mo I/L组荧光染料主要出现在划痕以外的3-4列细胞内(平均3. I分)；20 μ mol/L组荧光染料主要出现在划痕以外的4列细胞或更远距离(平均3. 8分)(见图12)。
权利要求
1.皂角刺总黄酮作为细胞连接通讯增强剂，在制备预防和治疗肿瘤药物方面的应用。
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于，皂角刺总黄酮在制备抗癌药物方面的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，皂角刺总黄酮在制备抗皮肤癌药物方面的应用。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，皂角刺总黄酮在制备抗肺癌药物方面的应用。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，皂角刺总黄酮在制备抗乳腺癌药物方面的应用。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，皂角刺总黄酮在制备治疗乳腺增生或前列腺增生药物方面的应用。
全文摘要
本发明属于皂角刺总黄酮应用技术领域，具体涉及皂角刺总黄酮作为细胞连接通讯增强剂，在制备预防和治疗肿瘤药物方面的应用，尤其是在肿瘤预防、肿瘤化疗增效、组织增生方面的应用，如预防化学致癌、提高肿瘤化疗指数、逆转肿瘤化疗耐药、阻止乳腺增生和前列腺增生等。
文档编号A61K36/483GK102940672SQ20121048636
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月26日 优先权日2012年11月26日
发明者杜钢军, 杨义明, 卢琳琳, 林海红, 刘伟杰, 刘迎辉, 王莹莹, 李鸿儒, 赵贝, 侯西栋 申请人:河南大学