番木瓜环斑病毒基因及其RNAi表达载体的构建方法
【专利摘要】本发明涉及一种番木瓜环斑病毒基因及其RNAi表达载体的构建方法，所述番木瓜环斑病毒基因为CP、Hc-Pro、NIb基因，其核苷酸序列分别如SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列；以感染番木瓜环斑病毒番木瓜叶片为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，以CP、Hc-Pro、NIb为靶标干扰基因的保守区域，通过遗传转化，分别将其构建成高效、稳定抗病毒植物表达载体，从而得到具有抗病毒植株。本发明利用CP、NIb、Hc-Pro基因片断保守序列构建RNAi表达载体，并且将RNAi的高效抗病设计理念引入到番木瓜的抗病基因工程育种中，可用于创造高效、广谱抗PRSV病毒病的新种质。
【专利说明】番木瓜环斑病毒基因及其RNAi表达载体的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学和基因工程领域，涉及一种番木瓜环斑病毒(PRSV)中外壳蛋白基因(CP)、辅助成分蛋白(HC-Pro)、复制酶基因(NIb)基因、保守序列分析和RNAi表达载体构建方法，RNAi植物表达载体可用于基因枪或农杆菌介导的遗传转化，创造高效、广谱抗PRSV病毒病的新种质。
【背景技术】
[0002]番木瓜(Carica papaya L.)的主要用途是生产水果和具有商业价值的蛋白水解酶。它是少有的能全年挂果，并在栽培9个月后就能结出成熟果实的作物。番木瓜树能存活25年或更长的时间，每个叶腋都能不断的抽生一个或多个果实，每个果实含有约1000多粒种子。从雄花或两性花采的花粉，很容易人工授粉到雌花或两性花。周年开花结果的习性，以及易于人工杂交，使得番木瓜能产生大量的后代和取得相当可靠的遗传转化结果，因此番木瓜是遗传/基因组研究和作物改良的一个有吸引力的模型。
[0003]1998年夏威夷转基因番木瓜彩虹和日升品种被开始商业化应用，是众所周知的科学突破，代表了第一次实际应用的转基因水果作物。利用基因枪法从最初转化夏威夷温和毒株HA5-1链的CP基因转基因株系中筛选出的转基因品种具有抗夏威夷PRSV的能力。之后，许多研究小组利用农杆菌介导法进行了大量转化工作，利用的外植体包括叶片、叶柄等，但最常用的是体胚发生的再生体系。番木瓜最高的转化效率是利用碳化硅或钨处理胚性愈伤，使愈伤受伤后再进行共培养得到的，卡那霉素抗性转化系(一般在150毫克/升)的筛选在6至13个月内完成，再生植株一般只有一个插入位点。近年，转抗真菌基因的番木瓜抗棕榈疫霉种质已通过基因枪的方法得到。当转基因育种技术的管制放宽后，转基因番木瓜系将成为世界范围内番木瓜产业增长的重要因素。
[0004]由PRSV-CP基因介导的抗性具有一定的广谱性，尤其是转各株系CP基因的通读部分的植株，对同属病毒均表现出一定的抗性，这是利用CP基因的优势所在。但应用上还有很大的局限性=PRSV-CP介导的抗性主要表现在病毒侵染早期、推迟发病和减轻症状，抗性水平较低；转基因表达的CP能包被异源病毒RNA，从而使得原本不能蚜传的病毒能够被蚜虫传播(Dougherty, 1994),或者一种病毒CP基因的植物表达产物可能包装另一种病毒或其他致病因子的基因组，从而形成一种新的致病因子(高艳梅等，2009)。
[0005]利用PRSV的复制酶(NIb)基因构建人工抗性基因转化植物获得抗病毒植株，是抗PRSV番木瓜生物技术育种的又一重要进展。早在1996、1998年我国中山大学和香港大学的研究人员就对番木瓜PRSV的复制酶基因进行了克隆和转化番木瓜的研究(叶长明等，1996 ;陈谷，1998)。我国华南农业大学的研究人员将番木瓜PRSV-Ys株系的复制酶基因转化入番木瓜中，转化植株对PRSV的Ys、Vb、Sm株系表现高抗，在定植田间的9个月中，转基因植株无一发病，而对照则全部发病。这一转基因品种“华农I号”于2006年获政府批准在广东省商业化种植。该复制酶基因含有35S启动子和一个NOS终止子，并具卡那霉素抗性筛选功能。据报道，华农I号能抗来自中国4个不同地区的番木瓜环斑病毒株系(阮小蕾等，2004 ;阮小蕾等，2009 ;阮小蕾等，2010)。之前，华南农业大学的研究者们尝试利用双元载体PBI121将不可译的复制酶基因和外壳蛋白基因转入番木瓜中，但转化植株没有获得抗病性。转PRSV-NIb基因的植株的抗性特点是:抗性强、专一、持续时间长、但抗性范围狭窄，一般对提供复制酶基因的亲本病毒株系有很强抗性，而对那些与亲本株系同源性差的病毒株系不表现抗性。
[0006]台湾番木瓜转基因研究者发现当PRSV-YK株系的Hc-Pro基因改变后，抗PRSV-YK株系的转基因种质将失去抗病能力(Ying-Huey Cheng, 1996)，这说明Hc-Pro基因在PRSV感染过程中发挥着重要作用，沉默病毒的Hc-Ριχ)基因表达也是值得尝试的转基因育种策略。 [0007]此外，研究中发现由转CP基因介导的抗性不仅仅和外壳蛋白有关，还和RNA介导的抗性有关，即高水平或者是广谱的植物病毒抗性是由外壳蛋白和RNA干扰共同引起的。RNA介导的抗性与蛋白质介导的抗性有着明显的不同，它仅依靠转基因的RNA转录，而不需要病毒基因编码表达的蛋白质，故具有较高的生物安全性，容易被公众接受；同时，其抗性表现型与接种物的剂量无关，类似于免疫，它更为高效；RNA介导的抗性只需病毒RNA序列与靶序列同源，允许部分位点的突变、甚至缺失，并且伴随着dsRNA的产生而产生，这种dsRNA是与沉默基因的正义或反义RNA高度同源性的，但当转基因序列和病毒基因序列的非同源性高于10%的时候，转基因就很难赋予植物抗病性(Bau HJ2003)，因而特异性更强，为了获得广谱的病毒抗性，通过附加更多的病毒相关序列扩充转基因结构，能够使转基因植物获得更为广谱的抗性(Bucher EC2006)。
[0008]RNAi (RNA interference)即RNA干扰,是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象，是由双链RNA( dsRNA)介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达，简单地说，RNAi就是指由RNA介导的高效基因沉默现象。利用RNAi技术设计短片段反向重复发夹结构病毒基因相关序列，序列表达后能够直接产生dsRNA，与传统转病毒全长如CP或RP等相关基因来产生RNA，并进一步在植物体内剪切产生dsRNA，从而介导RNA抗性相比，RNAi技术的抗病毒效率远远更高，一般来说转病毒单链正义或者反义基因赋予植物的病毒抗性只有20%左右，但是转入能够产生dsRNA的IR序列的植物对病毒的抗性却高达90%(Waterhouse PM2003)。因此利用RNAi技术培育广谱、高抗PRSV番木瓜新品系，在理论上是可行的。
[0009]目前，世界上还没有利用RNAi技术转化番木瓜得到转基因种质与品种(系)的研究。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是一种番木瓜环斑病毒基因及其RNAi表达载体的构建方法，利用对抗PRSV有效的病毒CP、NIb、Hc-Pro基因片断保守序列构建RNAi表达载体进行番木瓜转化，解决了分别利用CP和NIb基因转化使番木瓜获得抗PRSV所存在的不足，并且将RNAi的高效抗病设计理念引入到番木瓜的抗病基因工程育种中，可用于创造高效、广谱抗PRSV病毒病的新种质。
[0011]本发明所采用的技术方案:
[0012]一种番木瓜环斑病毒基因，为CP、Hc-Pro, NIb基因，提取自感染番木瓜环斑病毒的番木瓜叶片中，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的核
苷酸序列。
[0013]以感染番木瓜环斑病毒番木瓜叶片为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，以CP、Hc-Pro, NIb为靶标干扰基因的保守区域，通过遗传转化，引入到番木瓜的抗病基因工程育种中，分别将其构建成高效、稳定抗病毒植物表达载体，从而得到具有抗病毒植株。
[0014]本发明的另一目的是提供一种番木瓜环斑病毒CP、Nib、Hc-Pro基因的RNAi表达载体的构建方法，是以感染番木瓜环斑病毒番木瓜叶片为材料，提取总RNA，反转录为cDNA,以CP基因、Hc-Pro基因、NIb基因(其核苷酸序列分别如SEQID N0.1，SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3)为模板，设计特异性引物，用高保真Taq酶进行PCR反应，在CP、Hc-Pro和NIb基因的正向片段分别引入XhoI和BglII酶切位点，在CP、Hc-Pro和NIb基因的反向片段分别引入BamHI和SalI酶切位点，引物序列如下:
[0015]CP正向序列:酶切位点XhoI和BglII
[0016]PRSV-CP-RNA1-Pl: 5，-CCCTCGAGTCAACGCCGGAACTAGTGGAACTT-3，
[0017]PRSV-CP-RNA1-P2:5，-GAAGATCTTCACGAGCCCTATCAGGTGTCTTT-3，
[0018]基因大小544bp
[0019]CP反向序列:酶切位点SalI和BamHI [0020]PRSV-CP-RNA1-P3:5，-GCGTCGACTCAACGCCGGAACTAGTGGAACTT-3，
[0021 ] PRSV-CP-RNA1-P4:5，-CGGGATCCTCACGAGCCCTATCAGGTGTCTTT-3，
[0022]Hc-Pro正向序列:酶切位点XhoI和BglII
[0023]PRSV-Hcpro-RNA1-Pl: 5，-CCCTCGAGTGAATGCACGTAACATGAACGA-3，
[0024]PRSV-Hcpro-RNA1-P2:5，-GAAGATCTACCATTTGCTGCCGAAACCTCT-3，
[0025]基因大小484bp
[0026]Hc-Pro反向序列:酶切位点SalI和BamHI
[0027]PRSV-Hcpro-RNA1-P3:5，-GCGTCGACTGAATGCACGTAACATGAACGA-3，
[0028]PRSV-Hcpro-RNA1-P4:5，-CGGGATCCACCATTTGCTGCCGAAACCTCT-3，
[0029]NIb正向序列:酶切位点XhoI和BglII
[0030]PRSV-NIb-RNA1-Pl: 5，-CCCTCGAGCTTTGTATTGCCATTCACCCAGAT-3，
[0031]PRSV-NIb-RNA1-P2:5’ -GAAGATCTACTCATCCATAGAACCACGCTCAC-3’
[0032]基因大小424bp
[0033]NIb反向序列:酶切位点SalI和BamHI
[0034]PRSV-NIb-RNA1-P3:5，-GCGTCGACCTTTGTATTGCCATTCACCCAGAT-3，
[0035]PRSV-NIb-RNA1-P4:5，-CGGGATCCACTCATCCATAGAACCACGCTCAC-3，
[0036]将PCR产物连接到PMD18-T Simple载体，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，筛选阳性克隆子，提取菌液PCR鉴定正确的重组质粒，由XhoI和BglII双酶切得到的CP、Hc-Pro和NIb基因的正向片段，与XhoI和BglII双酶切的pRNAil017连接，转化，筛选阳性克隆子，提取菌液PCR鉴定正确的重组质粒，经BamHI和SalI双酶切与CP、Hc-Pro和NIb基因的反向片段进行连接，转化，筛选阳性克隆子，提取菌液PCR鉴定正确的重组质粒，经PstI和SalI双酶切与pCAMBIA2300-35S-0CS植物表达载体同样双酶切后进行连接，转化，筛选阳性克隆子，电泳检测并测序验证，植物表达载体PCAMBIA2300-35S-CP正反-0CS、pCAMBIA2300-35S-Hc-Pro 正反-OCS、pCAMBIA2300_35S_NIb 正反-OCS 构建成功。
[0037]本发明的技术优势和有益效果:
[0038]1、本发明米用RNAi技术，设计番木瓜环斑病毒CP、Hc-Pro> NIb保守区域反向重复发夹结构，使之能够高效快速稳定的产生dsRNA，与传统转病毒全长CP或RP等基因产生dsRNA相比，RNAi技术的抗病毒效率更高。
[0039]2、本发明提供的番木瓜环斑病毒(PRSV)中外壳蛋白基因(CP)、辅助成分蛋白基因(Hc-Ρι?)、复制酶基因(NIb)，是番木瓜环斑病毒自身繁殖、复制、侵染相关蛋白的重要编码基因，分别将其构建成高效、稳定抗病毒植物表达载体，通过基因枪或农杆菌介导的遗传转化，引入到番木瓜的抗病基因工程育种中，将其功能蛋白在mRNA水平进行阻断，可以有效抑制病毒的繁殖、复制和扩散，使外源的病毒不能侵染转基因抗病毒植株，达到抗病毒的效果。
[0040]3、本发明构建的番木瓜抗PRSV病毒植物表达载体pCAMBIA2300-35S-CP正反-OCS、pCAMBIA2300-35S-Hc-Pro 正反-OCS、pCAMBIA2300_35S_NIb 正反-OCS 为首次报道，通过基因枪或农杆菌介导的遗传转化，可创造高效、广谱抗PRSV病毒病的新种质。
【专利附图】
【附图说明】
[0041]图1为番木瓜环斑病毒PRSV功能基因CP、Hc-Pro、NIb的共同保守区域分析图谱；
[0042]图2为CP、Hc-Pro、NIb基因干扰片段正向序列与反向序列PCR扩增；
[0043]图3 为重组质粒 pRNAil017-CP 正、pRNAil017_Hc-pro 正、pRNAil017_NIb 正，经Xho I和Bgl II双酶切 ；
[0044]图4 为重组质粒 pRNAil017-CP 正反、pRNAil017_Hc-pro 正反、pRNAil017_NIb 正反经Sal I和Pst I双酶切；
[0045]图5为抗PRSV病毒植物转基因载体双酶切。
【具体实施方式】
[0046]下面结合实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0047]实施例一:番木瓜环斑病毒CP、Hc-Pro和NIb基因保守区域分析
[0048]于2011年6月在海南岛番木瓜主要种植区昌江、乐东、澄迈、文昌和三亚等地采集番木瓜疑似病毒样品叶片(主要以幼嫩叶片上可见到明显斑驳畸形的病状为基准采集病叶)，共采集待测样品76份(采集样品均来自不同地点或同一地点相隔500m以内，所有样品地点采用GPS定位，样品采回以后置-80°C保存备用)。分别提取样品叶片的总RNA，经Random引物反转录后，分别用表1所列引物进行PCR扩增，分子检测(检测存在的番木瓜环斑病毒CP、Hc-Pro和NIb基因的遗传多样性)，检测到番木瓜环斑病毒PRSV的样品有59个，即番木瓜环斑病毒病检出率为59/76=77.63%，因此番木瓜环斑病毒PRSV是影响海南地区番木瓜产业健康发展的主要病毒病。
[0049]发明人将检测到的PRSV样品进行分子克隆测序，以PRSV病毒基因组CP、Hc-Pro和NIb作为靶标基因，Blast比对GenBank数据库中的PRSV核苷酸信息，通过序列比对和运用Clustalx软件分析，挑选出最具有典型的PRSV病毒CP、Hc-Pro和NIb基因的代表样品，序列分析图谱如附图1所示，(a)番木瓜环斑病毒PRSV功能基因CP的共同保守区域分析，(b)番木瓜环斑病毒PRSV功能基因Hc-Pio的共同保守区域分析，(c)番木瓜环斑病毒PRSV功能基因NIb的共同保守区域分析。由图中看出代表样品具有海南番木瓜环斑病毒PRSV功能基因的共同保守区域特点，可作为设计番木瓜环斑病毒CP、Hc-Pro和NIb基因广谱抗病毒植物表达载体的模板。
[0050]表1番木瓜花叶病检测PCR弓丨物
[0051]
【权利要求】
1.一种番木瓜环斑病毒基因，其特征在于:所述番木瓜环斑病毒基因为CP、Hc-Pro,NIb基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:USEQ ID N0:2、SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
2.—种权利要求1所述的番木瓜环斑病毒基因的RNAi表达载体的构建方法，其特征在于:是以感染番木瓜环斑病毒番木瓜叶片为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，以核苷酸序列分别如 SEQ ID N0.1，SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.3 所示的 CP 基因、Hc-Pro 基因、NIb基因为模板，设计特异性引物，用高保真Taq酶进行PCR反应，在CP、Hc-Pro和NIb基因的正向片段分别引入XhoI和BglII酶切位点，在CP、Hc-Pro和NIb基因的反向片段分别引入BamHI和SalI酶切位点，引物序列如下: CP正向序列:酶切位点XhoI和BglII
PRSV-CP-RNA1-Pl:5， -CCCTCGAGTCAACGCCGGAACTAGTGGAACTT-3，
PRSV-CP-RNA1-P2:5， -GAAGATCTTCACGAGCCCTATCAGGTGTCTTT-3， 基因大小544bp CP反向序列:酶切位点SalI和BamHI
PRSV-CP-RNA1-P3:5， -GCGTCGACTCAACGCCGGAACTAGTGGAACTT-3，
PRSV-CP-RNA1-P4:5， -CGGGATCCTCACGAGCCCTATCAGGTGTCTTT-3， Hc-Pro正向序列:酶切位点XhoI和BglII PRSV-Hcpro-RNA1-Pl:5’ -CCCTCGAGTGAATGCACGTAACATGAACGA-3’`
PRSV-Hcpro-RNA1-P2:5， -GAAGATCTACCATTTGCTGCCGAAACCTCT-3， 基因大小484bp Hc-Pro反向序列:酶切位点SalI和BamHI PRSV-Hcpro-RNA1-P3:5， -GCGTCGACTGAATGCACGTAACATGAACGA-3，
PRSV-Hcpro-RNA1-P4:5， -CGGGATCCACCATTTGCTGCCGAAACCTCT-3， NIb正向序列:酶切位点XhoI和BglII
PRSV-NIb-RNA1-Pl:5’ -CCCTCGAGCTTTGTATTGCCATTCACCCAGAT-3’
PRSV-NIb-RNA1-P2:5，-GAAGATCTACTCATCCATAGAACCACGCTCAC-3， 基因大小424bp NIb反向序列:酶切位点SalI和BamHI
PRSV-NIb-RNA1-P3:5， -GCGTCGACCTTTGTATTGCCATTCACCCAGAT-3，
PRSV-NIb-RNA1-P4:5，-CGGGATCCACTCATCCATAGAACCACGCTCAC-3， 将PCR产物连接到PMD18-T Simple载体，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆子，提取菌液PCR鉴定正确的重组质粒，由XhoI和BglII双酶切得到的CP、Hc-Pro和NIb基因的正向片段，与XhoI和BglII双酶切的pRNAil017连接，转化，筛选阳性克隆子，提取菌液PCR鉴定正确的重组质粒，经BamHI和SalI双酶切与CP、Hc-Pro和NIb基因的反向片段进行连接，转化，筛选阳性克隆子，提取菌液PCR鉴定正确的重组质粒，经PstI和SalI双酶切与PCAMBIA2300-35S-0CS植物表达载体同样双酶切后进行连接，转化，筛选阳性克隆子，电泳检测并测序验证，植物表达载体PCAMBIA2300-35S-CP正反-0CS、pCAMBIA2300-35S-Hc-Pro 正反-OCS、pCAMBIA2300_35S_NIb 正反-OCS 构建成功。
【文档编号】C12N15/83GK103484480SQ201310440173
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】赵辉, 张雨良, 贾瑞宗, 朱芸, 曾会才, 孔华, 彭明 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所