一种计数植物乳杆菌活菌数的方法及其引物和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种计数植物乳杆菌ST-III活菌数的方法及其引物和试剂盒。该方法包括步骤：（1）以平板计数法计数样品中的活菌数X；（2）分别提取步骤（1）所述平板上所长的Y个单菌落的基因组DNA，以所得的基因组DNA为模板分别进行PCR反应，所述PCR反应的反应体系中加入SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2所示的引物以及检测细菌16S?rRNA的通用引物对；（3）根据步骤（2）所得反应产物中阳性条带的存在与否统计阳性菌落数Z，即得样品中植物乳杆菌ST-III的活菌数W，W=X×Z÷Y。本发明的方法操作简单，特异性强，灵敏度高，能够方便快速地检测样品中植物乳杆菌ST-III的活菌数。
【专利说明】一种计数植物乳杆菌活菌数的方法及其引物和试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种计数植物乳杆菌(lactobacillusplantarum) ST-1II活菌数的方法及其引物和试剂盒。
【背景技术】
[0002]光明乳业股份有限公司筛选的专利菌株植物乳杆菌ST-1II，具有降血脂、降胆固醇、减肥等益生功效，但是植物乳杆菌的种类很多，并不是所有植物乳杆菌都具有这些功能。而且益生菌要发挥益生功能，其活菌数必需大于106cfu/g，产品中植物乳杆菌ST-1II的活菌数决定着产品的质量与功能。为此，有必要发展准确的特定菌株活菌计数技术。
[0003]到目前为止，已经有一些应用PCR检测鉴定植物乳杆菌ST-1II的方法。如专利CN102453767A中公开了一种快速定量检测植物乳杆菌ST-1II的方法及其试剂盒，该方法的基本操作包括:提取待检样品的总RNA，反转录成cDNA，再做荧光定量。由于菌体内的RNA分解速度较快，通常只有在菌体保持新鲜的状态下才能获得较准确的结果，因此该方法只适合于对新鲜的样品进行计数。当样品存放一段时间后，产品中的活菌数可能变化不大，但是提取的RNA却可能发生部分降解，从而影响计数的准确性。此外，该方法的检测极限仅为
2.85X103cfu/mL，并在检测过程中常伴有正负I个数量级的误差，而且该方法的操作过程很繁杂，对实验者的要求很高，更由于所使用的部分试剂有毒，因此在实际应用中难以推广。又如，专利CN102533 790A中公开了一种检测植物乳杆菌ST-1II的PCR检测方法及其引物和试剂盒，该方法能特异性地检测植物乳杆菌ST-1II，但却不能区分产品中的死菌与活菌，且在PCR反应中常出现假阴性和假阳性，所以该方法也无法对样品中的植物乳杆菌ST-1II的活菌数进行准确的计数。因此，到目前为止，本领域尚缺乏系统的、能够准确定量检测植物乳杆菌ST-1II活菌的计数方法。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是针对目前对植物乳杆菌ST-1II的定量检测方法灵敏度不够高、准确性较差且操作复杂的缺陷，而提供一种新的计数植物乳杆菌ST-1II活菌数的方法及其引物和试剂盒。本发明的方法及其引物和试剂盒用于测定植物乳杆菌ST-111，其操作简单，特异性强，灵敏度高，能够方便、快速地测定样品中植物乳杆菌ST-111的活菌数，为具有特定功能的植物乳杆菌ST-1II的应用打下基础；同时也为研究其它功能性菌株的活菌计数方法提供了有益参考。
[0005]本发明提供的技术方案之一是:一种对样品中植物乳杆菌(IactobaciIIusplantarum) ST-1II活菌进行计数的方法,其包括如下步骤:
[0006](I)以平板计数法计数样品中的活菌数X ;
[0007](2)分别提取步骤(1)所述平板上所长的Y个单菌落的基因组DNA，以所得的基因组DNA为模板分别进行PCR反应，所述PCR反应的反应体系中加入SEQ ID N0.1、SEQ IDN0.2所示的引物以及检测细菌16S rRNA的通用引物对；[0008](3)根据步骤(2)所得反应产物中阳性条带的存在与否统计阳性菌落数Z，即得样品中植物乳杆菌ST-1II的活菌数W，W=XXZ + Y。
[0009]本发明步骤(1)中，所述的平板计数法为本领域常规所述，一般是先将待测样品进行梯度稀释，将稀释后的样品涂布计数平板，直至在计数平板上长出单克隆，对单克隆菌落进行计数即可。所述的计数平板可以为本领域常规，如MRS固体平板、TPY固体平板和BBL固体平板等。较佳地，在本发明中，所述平板计数法为采用MRS固体平板培养稀释后的样品，直至在MRS固体平板上长出单克隆，对单克隆菌落进行计数，所得菌落数代表样品中的活菌数X。
[0010]本发明步骤(2)中所述分别提取步骤(1)所述平板上所长的Y个单菌落的基因组DNA 一般按常规分子生物学检测的方法进行，所述Y的数量可为任意的适合于常规实验操作进行的数目，一般在10~100之间为佳。
[0011]本发明步骤(2)中，所述的检测细菌16S rRNA的通用引物对为本领域常规所述，只要其能够扩增出细菌16S rRNA的对应片段即可，以此作为检测时的阳性对照，防止假阴性的发生。较佳地，所述的检测细菌16S rRNA的通用引物对为序列如SEQ ID N0.3和SEQID N0.4所示的引物 对。
[0012]本发明步骤(2)中，所述PCR反应的扩增程序为常规，只要能扩增出目标片段即可。较佳地，所述PCR反应的扩增程序为:①90~98°C，3~IOmin 90~98°C，10~120s ;@45 ~6(TC，10 ~120s ;@65 ~8(TC，20 ~120s ;?68 ~75°C，2 ~30min ;其中，步骤②至④的循环数为20~45。更佳地，所述PCR反应的扩增程序为:①93~96°C，4~6min 93 ~96°C, 20 ~40s 53 ~58°C, 20 ~40s 70 ~74°C，20 ~40s 70 ~72°C，5~IOmin ;其中，步骤②至④的循环数为25~35。最佳地，所述PCR反应的扩增程序为:① 95°C，5min ;@95°C，30s ;@55°C，30s ;@72°C，30s ;?72°C，5min ;其中，步骤②至④的循环数为30。
[0013]本发明步骤(2)中，所述PCR反应的反应体系为常规，只要能扩增出目标片段即可。较佳地，所述PCR反应的反应体系包括如下终浓度的各组分:0.1~0.5 μ mol/L序列如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2所示的引物和检测细菌16S rRNA的通用引物对、0.1~0.5mmol/L dNTP、0.5 ~1.5 X PCR buffer,0.5 ~2mM 的 Mg2+、0.01 ~0.03U/ μ L Taq DNA 聚合酶和0.1~IOng/ μ L模板。更佳地，所述PCR反应的反应体系包括如下终浓度的各组分:0.2~0.4 μ mol/L 序列如 SEQ ID N0.USEQ ID N0.2,SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4 所示的引物、0.15 ~0.35mmol/L dNTP、0.8 ~1.2 XPCR buffer、。.8 ~1.8mM 的 Mg2+、0.015 ~0.025U/μ L Taq DNA聚合酶和0.5~2ng/μ L模板。最佳地，所述PCR反应的反应体系包括如下终浓度的各组分:0.25 μ mol/L 序列如 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 和 SEQ IDN0.4 所示的引物、0.2mmol/L dNTPU XPCR buffer、ImM 的 Mg2+、0.02U/μ L Taq DNA聚合酶和lng/μ L模板。
[0014]本发明步骤(2)中，在分别提取步骤(1)所述平板上所长的Y个单菌落的基因组DNA，以所得的基因组DNA为模板分别进行PCR反应时，较佳地还包括同时以步骤(1)所述的计数平板的培养基成分为阴性对照的模板进行阴性对照PCR，所述阴性对照PCR的反应体系除模板为步骤(1)所述的计数平板的培养基成分之外，其余同步骤(2)所述的PCR反应，所述阴性对照PCR的反应程序同步骤(2)所述的PCR反应。[0015]本发明步骤(3)中，所述阳性条带包括由SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2所示引物扩增出的173bp的条带和由检测细菌16S rRNA的通用引物对扩增出的对应阳性片段；所述根据步骤(2)所得反应产物中阳性条带的存在与否统计阳性菌落数Z即指，若步骤(2)所得的反应产物中同时存在由SEQ ID N0.USEQ ID N0.2所示引物扩增出的173bp的条带和由检测细菌16S rRNA的通用引物对扩增出的对应阳性片段，则说明该菌落为阳性菌落，若步骤
(2)所得的反应产物中不同时存在由SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2所示引物扩增出的173bp的条带和由检测细菌16S rRNA的通用引物对扩增出的对应阳性片段，则说明该菌落为阴性菌落。较佳地，所述阳性条带包括由SEQ ID N0.K SEQ ID N0.2所示引物扩增出的173bp的条带和由SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4所示的通用引物对扩增出的362bp的条带。
[0016]本发明提供的技术方案之二是:一种检测植物乳杆菌ST-1II的引物对，其包括序列如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2所示的引物。
[0017]本发明所述的引物对与细菌16S rRNA的通用引物对一起使用进行多重PCR反应，可以更特异地检测植物乳杆菌ST-1II菌株，保证结果的准确性。
[0018]本发明提供的技术方案之三是:一种用于检测植物乳杆菌ST-1II的试剂盒，其包括如上所述的检测植物乳杆菌ST-1II的引物对。
[0019]较佳地，所述的试剂盒中还包括检测细菌16S rRNA的通用引物对，所述引物对优选序列如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的引物对。
[0020]较佳地，所述的试剂盒中还包括dNTP、PCR buffer、Mg2+、Taq DNA聚合酶和dd H2O中的任一种或多种。
[0021]更佳地，所述 的试剂盒还包括基因抽提试剂。
[0022]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0023]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0024]本发明的积极进步效果在于:本发明的方法操作简单，特异性强，灵敏度高，能够方便快速地检测样品中植物乳杆菌ST-1II的活菌数，达到平板计数的准确度，为具有特定功能的植物乳杆菌ST-1II的应用打下基础；同时也为其它功能性菌株的计数方法提供了
有益参考。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为PCR引物特异性验证的结果图，其中，M为DL2，000DNA Marker ；0为阴性对照；I 为 L.plantarum ST-1II ；2 为 L.plantarum ATCC8014 ；3 为 L.plantarum ACCCl 1095 ；4 为 L.plantarum GIM6003 ；5 为 L.plantarum LP-Onlly ；6 为 L.plantarum WCFSl ；7 为Bifidobacterium animal is Bb-12 ；8 为 Bifidobacterium bifidum ；9 为 Lactobacillushelveticus ; 10 为 Streptococcus thermophilus ST-21 ;11 为Lactobacillusdelbrueckiisubsp.Bulgaricus ；12 为 Lactobacillus, acidophilus NCFM ; 13 为 Bacillus subtilisCMCC63501 ; 14 为 Escherichia coli ATCC25922。
[0026]图2为实施例2多重PCR计数的结果图，其中，M为DL2，000DNA Marker ;0为阴性对照；1_20分别代表选取的单个菌落1-20。【具体实施方式】
[0027]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0028]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0029]下述实施例中所用引物和探针由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
[0030]实施例1多重PCR引物特异性验证
[0031]选择与植物乳杆菌ST-1II同种不同株以及不同种的细菌，抽提菌体DNA为模板进行多重PCR反应，检验多重PCR引物的特异性。所用菌株为:植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum ST-1II,光明乳业技术中心),其它同种不同株植物乳杆菌(L.plantarum ATCC8014、L.plantarum ACCCl 1095、L.plantarum GIM6003、L.plantarumLP-OnlIy, L.plantarum WCFS1，均购自上海北诺生物科技有限公司)；不同种的细菌为:动物双歧杆菌(Bifidobacterium animal is Bb_12,购自科汉森有限公司)、两岐双岐杆菌(Bifidobacterium bif idum,购自丹尼斯克有限公司)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus,购自丹尼斯克有限公司)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus ST-21，购自丹尼斯克有限公司)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp.Bulgaricus,购自丹尼斯克有限公司)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus.acidophilus NCFM,购自科汉森有限公司)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CMCC63501，购自上海北诺生物科技有限公司)、大肠杆菌(Escherichia coli ATCC25922，购自上海北诺生物科技有限公司)。
[0032]在PCR反应体系中加入由序列如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示引物组成的通用引物对进行PCR，作为阳性对照以防止假阴性的发生。所述多重PCR反应的反应体系的总体积为 30 μ L，其中包括 0.25 μ mol/L 序列分别如 SEQ ID N0.USEQ ID N0.2,SEQ ID N0.3和 SEQ ID N0.4 所示的引物、0.2mmol/L dNTPU XPCR buffer、ImM 的 Mg2+、0.02U/μ L TaqDNA聚合酶和lng/μ L模板DNA，其余为去离子水。所述多重PCR反应的扩增程序为:95°C预热 5min，30 个循环(95°C，30s ；55°C, 30s ;72°C，30s)，72°C延伸 5min。PCR 产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果如图1所示。
[0033]从图1可以看出，所有细菌的阳性标记PCR都有条带(362bp )，说明PCR试剂有效。只有植物乳杆菌ST-1II能特异性扩增出相应的菌株特异性条带(173bp)，而其它细菌，特别是与植物乳杆菌ST-1II相近的同种不同株的植物乳杆菌都没有扩增出相应的条带。实验结果说明本发明多重PCR的特异性强，可以适合于对混合发酵产品中植物乳杆菌ST-1II的检测。
[0034]实施例2多重PCR对植物乳杆菌ST-111计数
[0035]光明乳业有限公司生产的畅优酸奶含有功能性益生菌植物乳杆菌ST-1II，另外还含有嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和动物双歧杆菌等。称取Ig样品，做系列梯度稀释，选择10_5、10_6两个梯度，分别涂布MRS固体平板，厌氧箱内培养2-3天。选择菌落数在30-300间的平板进行计数，将稀释倍数与计数所得的平均菌落数相乘即得样品中植物乳杆菌ST-1II的疑似菌落总数(该疑似菌落总数包含植物乳杆菌ST-1II，同时还可能包含部分杂菌)。随机挑选一定数量的(本实施例选取了 20个单菌落)植物乳杆菌ST-111疑似单菌落，做PCR鉴定。用灭菌枪头吸取菌体，吹吸数次将益生菌菌体悬浮于抽提试剂中，抽提试剂由终浓度为1父？0?缓冲液和0.0211101/1 NaOH组成。100°C水浴5分钟，混合物直接作为PCR模板。同时在平板空白处吸取培养基用抽提试剂提取作为阴性空白对照。根据植物乳杆菌ST-1II PCR鉴定为阳性所占的比例，以及平板计数的疑似菌落总数，计算出产品中植物乳杆菌ST-1II的数量。
[0036]结果如图2所示，所选取的20个菌落(Y)都有细菌阳性标志PCR条带，其中15个(Z)为植物乳杆菌ST-1II, Z与Y的比值为15/20，平板计数结果(X)为2.1X 108cfu/g。因此所检测的样品中植物乳杆菌ST-1II的活菌数W为1.6X108cfu/g (由2.1 X IO8Cfu/gX 15 + 20计算得出)。阴性对照的2对PCR引物都没有条带，说明PCR没有污染，计数准确。
[0037]实施例3植物乳杆菌ST-111保藏计数
[0038]将光明乳业有限公司生产的畅优酸奶在4°C保藏一个月，计数植物乳杆菌ST-1II活菌数。具体操作参照实施例2。所述多重PCR反应的反应体系的总体积为30 μ L,其中包括 0.2 μ mol/L 序列分别如 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4 所示的引物、0.15mmol/L dNTP,0.8 XPCR buffer、0.8mM 的 Mg2+、0.015U/μ L Taq DNA 聚合酶和
0.Sng/yL模板DNA，其余为去离子水。所述多重PCR反应的扩增程序为:93°C预热4min，25 个循环(93°C，20s ；53°C, 20s ;70°C，20s)，72°C延伸 5min。
[0039]结果显示，所选取的20个菌落(Y)都有细菌阳性标志PCR条带，其中10个(Z)为植物乳杆菌ST-1II，Z与Y的比值为10/20平板计数结果(X)为1.6X108cfu/g。因此，所检测的样品中植物乳杆菌ST-1II的活菌数W为8X107cfu/g (由1.6X108cfu/gX10 + 20计算得出)，大于lX106cfu/g，说明产品在保质期内合格。阴性对照没有条带，说明PCR没有污染，计数准确。同时，本实施例还抽提了待测样品的菌体RNA，发现在实验过程中菌体RNA完全降解，无法按照专利CN102453767A介绍的方法进行检测。
[0040]实施例4光明畅优植物乳酸菌饮品ST-111计数
[0041]称取Ig光明畅优植物乳酸菌饮品样品，具体操作参照实施例2。所述多重PCR反应的反应体系的总体积为30 μ L，其中包括0.4 μ mol/L序列分别如SEQ ID N0.1、SEQ IDN0.2,SEQ ID N0.3和 SEQ ID N0.4所示的引物、0.35mmol/L dNTPU.2 XPCR bufferU.8mM的Mg2+、0.025U/ μ L Taq DNA聚合酶和2ng/ μ L模板DNA，其余为去离子水。所述多重PCR反应的扩增程序为:96°C预热6min，35个循环(96°C，40s ；58°C,40s ;74°C，40s)，70°C延伸IOmin0
[0042]结果显示，所选取的20个菌落(Y)都有细菌阳性标志PCR条带，其中3个(Z)为植物乳杆菌ST-1II，Z与Y的比值为3/20，平板计数结果(X)为1.7X108cfu/g。因此，所检测的样品中植物乳杆菌ST-1II活菌数W为2.6X 107cfu/g(由1.7 X 108cfu/gX 3 + 20计算得出)。阴性对照没有条带，说明PCR没有污染，计数准确。
[0043]实施例5光明畅优植物乳酸菌饮品室温保藏计数
[0044]将光明畅优植物乳酸菌饮品在25°C保藏2周，计数产品中植物乳杆菌ST-1II的活菌数。具体操作参照实施例2。所述多重PCR反应的体系为:序列分别如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2, SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4所示的引物(5 μ mol/L) I μ L，2.5m M dNTP2 μ L，IOXPCR Buffer3 μ L，模板DNAl μ L, Taq DNA聚合酶0.9U，加去离子水至总体积为30 μ L。所述多重PCR反应的扩增程序为:94°C预热4min，30个循环(94°C，20s ；54°C, 20s ；72°C,20s)，72。。延伸 5min。 [0045]结果显示，所选取的20个菌落(Y)都有细菌阳性标志PCR条带，其中6个(Z)为植物乳杆菌ST-1II，Z与Y的比值为6/20，平板计数结果(X)为1.6X102cfu/g。因此，所检测的样品中植物乳杆菌ST-1II的活菌数W为4.8 X IO1CfVg (由1.6 X 102cfu/gX 6 + 20计算得出)，远小于lX106cfu/g。阴性对照没有条带，说明PCR没有污染，计数准确。说明光明畅优植物乳酸菌饮品不适宜室温存放，易造成菌体失活。而专利CN102453767A中介绍的方法的检测极限仅为2.85xl03Cfu/mL，无法对活菌数低的样品进行检测。
【权利要求】
1.一种对样品中植物乳杆菌(lactobacillus plantarum) ST-1II活菌进行计数的方法，其特征在于，其包括如下步骤: (O以平板计数法计数样品中的活菌数X ; (2)分别提取步骤(1)所述平板上所长的Y个单菌落的基因组DNA，以所得的基因组DNA为模板分别进行PCR反应，所述PCR反应的反应体系中加入SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2所示的引物以及检测细菌16S rRNA的通用引物对； (3)根据步骤(2)所得反应产物中阳性条带的存在与否统计阳性菌落数Z，即得样品中植物乳杆菌ST-1II的活菌数W，W=XXZ + Y。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的检测细菌16SrRNA的通用引物对为序列如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的引物对。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR反应的扩增程序为:① 93 ~96°C，4 ~6min ?,② 93 ~96°C，20 ~40s 53 ~58°C，20 ~40s 70 ~74°C，20~40s 70~72°C，5~IOmin ;其中，步骤②至④的循环数为25~35 ;所述PCR反应的反应体系包括如下终浓度的各组分:0.2~0.4 μ mol/L序列如SEQ ID N0.1、SEQ IDN0.2,SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4 所示的引物、0.15 ~0.35mmol/L dNTP、0.8 ~1.2XPCRbuffer,0.8 ~1.8mM 的 Mg2+、0.015 ~0.025U/ μ L Taq DNA 聚合酶和 0.5 ~2ng/ μ L 模板。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR反应的扩增程序为:① 95°C，5min ;@95°C，30s ;@55°C，30s ;@72°C，30s ;?72°C，5min ;其中，步骤②至④的循环数为30 ;所述PCR反应的反应体系包括如下终浓度的各组分:0.25 μ mol/L序列如SEQID N0.USEQ ID N0.2,SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4 所示的引物、0.2mmol/L dNTP、lXPCRbuffer、ImM 的 Mg2+、0.02U/ μ L Taq DNA 聚合酶和 lng/ μ L 模板。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述阳性条带包括由SEQIDN0.1、SEQ ID N0.2所示引物扩增出的173bp的条带和由SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4所示的通用引物对扩增出的362bp的条带。
6.一种检测植物乳杆菌ST- 1II的引物对，其特征在于，其包括序列如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2所示的引物。
7.一种用于检测植物乳杆菌ST-1II的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求6所述的检测植物乳杆菌ST-1II的引物对。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括序列如SEQIDN0.3和SEQ ID N0.4所示的引物对。
9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括dNTP、PCRbuffer、Mg2+、Taq DNA聚合酶和dd H2O中的任一种或多种。
10.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括基因抽提试剂。
【文档编号】C12Q1/02GK103525914SQ201310440028
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月23日 优先权日:2013年9月23日
【发明者】张红发, 任婧 申请人:光明乳业股份有限公司