D组禽轮状病毒的制作方法

专利名称：D组禽轮状病毒的制作方法
技术领域：
D组禽轮状病毒
背景技术：
轮状病毒属于病毒的呼肠孤病毒科(Reoviridae)，并能影响鸟和其他生物体的胃肠系统和呼吸道。呼肠孤病毒科含有不同属，包含正呼肠病毒(orthoreovirus)(禽和哺乳动物呼肠孤病毒)，环状病毒(orbivirus)(蓝舌病毒(Bluetongue virus))和轮状病毒(rotavirus) (A-G 组)。轮状病毒是非包被、双壳RNA病毒。其基因组有11片段双链RNA组成，编码6个结构和6个非结构蛋白。6个病毒蛋白(VP)形成病毒粒子的三层二十四面蛋白衣壳。所述结构蛋白称为VP1、VP2、VP3、VP4、VP6和VP7[1]。VP6形成衣壳的体。这是高度抗原性并能用于鉴定轮状病毒种类[2]。除了 VP，有6个非结构蛋白(NSP)，只有在被轮状病毒感染的细胞中产生。这些称为NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5和NSP6[1]。已知禽轮状病毒(ARV) [3、4和5]，其在世界范围内经常影响家禽群，并特别对鸡群。受到感染的鸡的症状是腹泻，随后体重增加缓慢，症状称为吸收不良症状(MAS)或生长与发育障碍症状(RSS)。在一个领域研究，检查有RSS的8个群的6-18日龄的肉鸡以检测哪些ARV是RSS发病机理的主要原因[6]。在所述研究中，有RSS的群的34只小鸡中的32只检测到ARV。有RSS的群中鉴定了四组ARV :AVR A、D、F和G。所述研究的结果显示D组的ARV显示在RSS发病机理中的主要作用。RSS对小鸡饲养者的经济学影响严重。会损失所有被感染的小鸡。因此，非常需要早期检测和预防ARV感染。目前，经常使用RNA-PAGE对基于11个基因组RNA片段的迁移作为ARV检测和鉴定的基础。D组ARV的RNA-PAGE概况特征是5:2:2:2 [7]。所述RNA迁移的特征概况能用于鉴定D组ARV。也能用ELISA[8]、透射电镜和逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)检测ARV[6]。只有PAGE能区别不同ARV组，但其灵敏度低。目前，只有使用PCR方法检测A组轮状病毒。在优先权日不存在D组ARV的核酸序列数据。因此迫切需要开发检测其他轮状病毒的替代方法，特别是D组轮状病毒。具体来说，迫切需要开发快速和灵敏检测D组ARV的方法。

发明内容
本发明涉及新D组禽轮状病毒(ARVD)的鉴定[9]并提供在兽医学和药学领域的数个机遇。本发明提供 编码VP6多肽和片段及其变体的核酸，以及与编码VP6多肽的核酸互补的核酸序列。·由上述核酸编码的VP6多肽序列、和片段、变体和其抗原性片段。
·在高度严谨条件下与编码VP6多肽的核酸杂交的核酸分子，包含引物和探针。·与VP6多肽、片段、变体和/或其抗原性决定簇结合的抗体。·诊断试剂和试剂盒，所述试剂和试剂盒包含在生物样品中鉴定ARVD有无的试剂和能用于诊断生物样品中ARVD感染或鉴定ARVD病毒有无的方法。·治疗或防御ARVD感染的疫苗。·证实蛋，特别是用于疫苗生产的胚胎蛋，没有ARVD的方法。核酸发明提供包含SEQ ID NO: I或SEQ ID N0:2核酸序列的核酸。发明也提供包含与SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 2至少i %—致的核酸序列的核酸。i值选自75%、80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%,99. 9%。序列鉴定应该沿核酸序列全长计算。SEQ ID NO: 2提供整个ARVD VP6编码序列。SEQ ID NO: I提供包含如SEQ ID NO2所述的VP6编码序列片段的核酸，并还包含3’非翻译序列的核酸。优选地，所述核酸编码ARVD VP6多肽。本发明的核酸可以编码如SEQ IDN0:3或SEQ ID NO:4 所述的 ARVD VP6 多肽。发明也包含如SEQ ID N0:1和/或2所述的核酸序列片段。因此，所述发明提供包含SEQ ID N0:1和/或2的至少η个连续核酸片段的核酸，其中，η是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50 或更多。核酸可以有 η+χ 核酸的总长度，其中 χ=0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、1 O、11、12、13、14、15、16、17、I 8、19、20、21、22、23、
24、25、30、35、40、50或更多。在一个实施方式中，η值是24。在另一实施方式中，发明提供包含SEQ ID Ν0:1或SEQ ID Ν0:2的反义互补序列的核酸。本发明也提供包含至少与如SEQ ID NO: I或SEQ ID NO:2所述核酸序列的反义互补序列的一致性在 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%,99. 9% 或更高的核酸序列的核酸。本发明也提供包含衍生自SEQ ID Ν0:1和/或2的反义互补的至少η个连续核酸片段的核酸，其中，η 是 8、9、10、11、12、1 3、14、15、16、17、I 8、19、20、21、22、23、24、
25、30、35、40、50或更多。所述核酸可以有η+χ核酸的总长度，其中χ=0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50 或更多。在一个实施方式中，η值是10。在另一个实施方式中，发明提供在严谨条件下与包含SEQ ID NO: I和/或SEQ IDNO: 2的核酸杂交的核酸。实例性严谨杂交条件是65。C 10分钟的O. I X SSC、0. 1% SDS’并用 2XSSC、0. 1% SDS 洗涤 10 分钟，然后再用 O. I X SSC, O. 1% SDS 10 分钟。本发明提供式5’-Χ-Υ-Ζ_3'表示的核酸，式中-Χ-是由X个核苷酸组成的核苷酸序列；-Ζ-是由ζ个核苷酸组成的核苷酸序列；-Υ-是由(a) SEQ ID NO :1或2的片段，或(b) (a)的互补物组成的核苷酸序列;和所述核酸5’-X-Y-Z-3'既不是(i)SEQ ID N0:1或2的片段，也不是(ii) (i)的互补物。例如，-X-和/或-Z-部分可包含启动子序列(或其互补物)。发明也提供包含发明的核酸和片段和也包含进一步核酸、修饰核酸或一个或多个可检测标记的核酸。所述核酸可以用作包含LCR、PCR、RT-PCR、实时PCR、实时RT-PCR、qPCR、qRT-PCR、Northern印迹和Southern印迹的方法的引物和/或探针。示例性标记包含放射性同位素、荧光分子、生物素、碱基对错配、发夹结构等。很多合适荧光团已知并能使用，包括但不限于荧光素，特别是5-FAM (也称为5-羧基荧光素；也称为螺环(异苯并呋喃-I (3H)，9’_ (9H)毒蕈碱)-5-羧酸，3’，6’-二羟基-3-氧代-6-羧基突光素)；丽丝胺(Iissamine);藻红蛋白；罗丹明(帕金埃尔默公司鲸鱼(Cetus)) ;Cy2、Cy3、Cy3. 5、Cy5、Cy5. 5、Cy7 ；FluorX (安玛西亚公司(Amersham))和其他标记，如在参考文献[10]中所述。整合所述标记到核酸分子在分子生物学领域技术人员的技术范围内。在一个特定实施方式中，所述核酸包含荧光标记和淬灭剂。合适的淬灭剂包括但不限于6-TAMRA (6-羧基四甲基罗丹明；Xanthylium, 9- (2，5- 二羧基苯基)-3，6- 二(二甲基氨基)；和DABCYL(4-((4-( 二甲基氨基)苯基)偶氮)苯甲酸)。优选用FAM(如在5’)和DABCYL(如在3’)标记核酸。在进一步的实施方式中，发明提供包含发明核酸的载体。例如，发明包含含有发明核酸的克隆或表达载体。发明也提供某些载体，所述载体包含发明核酸和进一步包含其它核酸，例如编码其它多肽的核酸，包含启动子或终止子序列，包含限制性内切核酸酶识别位点等。本发明的核酸可采取各种形式(如单链、双链、载体、引物、探针、标记等)。在上 述任何一个实施方式中，核酸和多核苷酸可以是DNA、RNA、杂交DNA/RNA分子、和/或修饰的DNA或RNA、或PNA (肽核酸)。核酸和多核苷酸也可以包含至少一个修饰的糖和/或碱基部分，或可以包含修饰的主链或非天然核苷间连接。应理解，核酸是DNA时，RNA序列中的“U”被DNA中的“T”所替代。类似地，当核酸是RNA时，例如在ARV基因组中，应该理解DNA序列(SEQ IDN0:1或SEQ ID N0:2)中的“T”会在RNA中用“U”替代。发明的核酸和多核苷酸也能是化学修饰，连接寡核苷酸到一个或多个部分或偶联以增强活性、稳定性或寡核苷酸的检测。所述部分或偶联包含上述发色团和荧光团，并且还包含脂质，例如胆固醇、胆酸、硫醚、脂族链、磷脂、多胺、聚乙二醇(PEG)、棕榈基部分和其他例如在参考文献11-18中所公开。本发明核酸优选以纯化或基本纯化的形式提供，即基本不含其它核酸(如不含天然产生的核酸)，特别是不含其它ARVD或宿主细胞核酸，通常其纯度至少为约50% (重量)，通常纯度至少为约90%。本发明核酸优选为ARVD核酸。可以多种方式制备本发明的核酸，例如，完全或部分化学合成(例如DNA的亚磷酰胺合成)、利用核酸酶(例如限制性酶)消化较长核酸、连接较短核酸或核苷酸(例如使用连接酶或聚合酶)、由基因组或cDNA文库制备等。本发明核酸可连接于固体支持物(如珠、平板、滤器、膜、玻片、微阵列支持物、树脂等)。可用例如放射性或荧光标记、或生物素标记标记本发明核酸。这在将核酸用于检测技术时(例如核酸是引物或探针时)特别有用。术语“核酸”通常包括任何长度的核苷酸聚合形式，其包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物。它包括DNA、RNA、DNA/RNA杂交体。它也包括DNA或RNA类似物，如含有经修饰主链(如肽核酸(PNA)或硫代磷酸酯)或经修饰碱基的类似物。因此，本发明包括mRNA、tRNA、rRNA、核酶、DNA、cDNA、重组核酸、分枝核酸、质粒、载体、探针、引物等。本发明核酸采取RNA形式时，它可能具有或不具有5’帽。多肽
发明提供包含SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4氨基酸序列的多肽。发明还提供包含与SEQ ID N0:3和/或4所述多肽序列至少—致的氨基酸序列的多肽。j值能选自75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5% 或 99. 9%。序列鉴定应该沿氨基酸序列全长计算。优选，多肽是ARVD VP6多肽。SEQ ID NO :3对应SEQ ID NO: I编码的多肽和SEQID NO :4对应SEQ ID N0:2编码的多肽。SEQ ID NO :3和4列于图3。发明也提供包含至少一个SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:4片段的多肽，其中片段包含SEQ ID N0:3和/或SEQ ID NO:4的至少w个连续氨基酸，其中w是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50 或更多。多肽可以有 w+x 核酸的总长度，其中 x=0、l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50 或更多。发明也提供包含一个或多个氨基酸取代、插入或缺失的发明多肽和片段的变体。 例如，SEQ ID NO: 3是包含I个氨基酸取代的SEQ ID NO:4的C末端片段的变体(图3)。与SEQ ID N0:3或4相比，发明多肽可包含一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)保守氨基酸取代，即用另一具有相关侧链的氨基酸取代氨基酸。遗传编码的氨基酸通常分为四类(I)酸性，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)极性不带电，即甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸一起称为芳族氨基酸。通常，这些家族中的单个氨基酸的取代不会对生物活性产生重要影响。相对于SEQ ID N0:3或4，所述多肽可含有一个或多个(如1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10个等)单个氨基酸的缺失。另外，相对于SEQ ID NO: 3或4，所述多肽可包含一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)插入(如各1、2、3、4或5个氨基酸)。在一个特定实施方式中，片段能在对象中诱导免疫反应。所述对象是禽或哺乳动物。在一个特定实施方式中，所述对象是家禽，例如小鸡或火鸡。该片段可包含至少一个T细胞表位，或优选B细胞表位。可凭经验确定T和B细胞表位(如利用PEPSCAN[19，20]或相似方法)，或可预测这些表位(如利用Jameson-Wolf抗原性指数[21]、基于矩阵的方法[22]、T表位(TEPI TOPE) [23]、神经网络[24]、OptiMer和 EpiMer [25，26]、ADEPT [27]、T 位点(Tsites) [28]、亲水性[29]、抗原性指数[30]或参考文献31和32中所述的方法等)。在SEQ ID NO:4中发现并通过参考文献32所述方法鉴定的示例性表位示于表I。当多肽能特异结合本文所述抗ARVD VP6抗体时，多肽也可以称为抗原。本发明包含ARVD病毒抗原的多肽和编码所述ARVD病毒抗原的多核苷酸。可以多种方式制备本发明多肽，例如化学合成(全部或部分)，用蛋白酶消化较长多肽，由RNA翻译，由细胞培养物纯化(如通过重组表达)，由生物体本身制备(如细菌培养后，或直接从患者制备)等。产生长度〈40个氨基酸的肽的优选方法包括体外化学合成[33, 34] 0尤其优选固相肽合成，例如基于tBoc或Fmoc [35]化学的方法。也可部分或完全利用酶合成[36]。作为化学合成的替代方式，可利用生物合成，例如，可通过翻译产生多肽。这一过程可以在体外或体内进行。生物学方法通常仅限于产生基于L氨基酸的多肽，但可通过操作翻译机器(如氨基酰基tRNA分子的翻译机器)引入D氨基酸(或其它非天然氨基酸，如碘化酪氨酸或甲基苯丙氨酸、叠氮基高丙氨酸等)[37]。然而，包含D氨基酸时，优选使用化学合成。本发明多肽的C末端和/或N末端上可能有共价修饰。本发明多肽优选以纯化或基本纯化，即基本不含其它多肽(如不含天然产生的多肽)、特别是不含其它ARVD或宿主细胞多肽的形式提供，本发明多肽的纯度通常为至少约50%(重量)，通常纯度至少约90%，即组成中少于约50%和更优选少于约10%(如5%或更少)是其它表达的多肽。本发明多肽优选为ARVD多肽。本发明多肽可连接于固体支持物。本发明多肽可包含可检测标记(如放射性或荧光标记，或生物素标记)。术语“多肽”指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是线形或支链聚合物，可以包含经修饰的氨基酸，可以被非氨基酸打断。该术语也包括天然修饰或通过人工介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或 修饰，如与标记组分偶联。该定义也包括，例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)，以及本领域已知的其它修饰。多肽可以以单链或结合链的形式产生。本发明多肽可以是天然或非天然糖基化的(即该多肽的糖基化模式不同于相应天然产生多肽的糖基化模式)。本发明的多肽可以分离或纯化。本发明提供含有序列-X-Y-或-Y-X-的多肽，其中-X-是上述氨基酸序列，-Y-不是上述序列，即本发明提供的融合蛋白。本发明提供产生本发明多肽的方法，该方法包括在诱导多肽表达的条件下培养本发明宿主细胞的步骤。本发明提供产生本发明多肽的方法，其中所述多肽部分或完全用化学方式合成。
检测ARDV核酸的方法和试剂盒发明也提供检测生物样品中ARVD有无的试剂盒和方法。特别地，发明提供检测发明核酸的试剂盒和方法。在一个特定实施方式中，发明提供某个试剂盒，所述试剂盒包含在发明核酸中扩增模板序列的引物，所述试剂盒包含第一引物和第二引物，其中所述第一引物包含与所述模板序列部分基本互补的序列和所述第二引物包含与所述模板序列部分基本互补的序列，其中在所述弓I物中序列限定被扩增的模板序列的末端。关于引物序列的“基本互补”是指引物对模板序列或其互补链有足够互补，以退火模板序列或其互补链，在温度45-65° C，例如45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64 或 65° C，在 50mM—价阳离子的盐浓度中。模板序列(包含引物的互补部分)可以是50-1500核苷酸长度。例如，模板序列可以是 50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250 或 1500 核苷酸长度。在一个实施方式中，模板核酸包含在如SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 2所示的核酸序列中。在一个实施方式中，模板核酸是如SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 2所示的核酸序列。发明引物也适合使用在检测与SEQ ID NO: I或SEQ ID N0:2不同的模板序列。发明也提供进一步包含与所述模板序列基本互补或与所述模板序列反义互补部分基本互补的探针序列。探针序列也可包含可检测标记。关于探针序列的“基本互补”是指探针对模板序列或其互补链有足够互补，以退火模板序列或其互补链，在温度45-65° C，例如 45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64 或 65 。 C，在50mM 一价阳离子的盐浓度中。引物和探针长度可以是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50 或更
长核苷酸。探针和引物可以还包含核苷酸或在5’末端、3’末端或两端的其他修饰。进一步核苷酸可以包含启动子序列、限制性内切核酸酶识别位点或其他核酸序列。通常，探针和引物不多于100核苷酸长度,如< 75核苷酸。引物和探针也可以包含一个或多个错配核苷酸，例如引入位点特异突变到模板序列。一个能用在发明试剂盒和方法的特定引物对包含ARVD正向序列(GCRACAACTGARACAACffG - SEQ ID NO: 24)和 ARVD 反向序列(GGAAGCAGTTGTCATCAAC - SEQ IDN0:25)。所述引物对可以与任何探针序列使用，但特别与qRT-PCR中包含6FAMTTG CATATTAGATTGTCTCGCTGGTGTATA-Dabcyl (SEQ ID NO: 26)的探针序列使用。进一步引物序列在下面表2中给出。在一个实施方式中，引物用于下列对SEQ IDN0:27和28;SEQ ID N0:29和30;SEQ ID N0:31 和 32;SEQ ID N0:33和34;SEQ ID NO:35和36。发明也提供诊断ARVD感染或鉴定生物样品中ARVD病毒有无的方法，包含检测发明核酸分子有无的步骤。在特定实施方式中，所述方法涉及检测包含如SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO:2所示核酸的核酸有无。检测步骤可以先于扩增步骤，例如，使用本领域已知的任何核酸扩增技术，和特别是LCR、PCR、RT-PCR、实时PCR、实时RT-PCR、qPCR和qRT-PCR任何合适方法可用于检测本发明核酸的有无，包括但不限于Southern印迹,northern印迹和琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后用溴化乙锭观察核酸。本发明核酸也可以用实时分析检测核酸(例如，“qPCR”；Taqman , Lightcycler ；Scorpion 等)。因为ARVD有RNA基因组，在本发明的一个特定实施方式中，RT-PCR用于扩增步骤。但是，也可用如为本领域技术人员已知的相当的RNA扩增方法(NASBA ；3SR ；TMA 等)在一个特定的实施方式中，采用一步RT-实时PCR测试(“一步RT-qPCR”)。使用市售可得RT-PCR试剂盒,例如凯杰公司(Qiagen) QuantiTect 病毒试剂盒或英杰公司(Invitrogen)Super Script IllPlatinum 试剂盒。可用本领域已知的相应实时循环仪软件分析所得荧光信号。因此发明的试剂盒可以包含逆转录酶。上述弓I物和探针可用于发明的任何方法。上述检测生物样品中ARVD有无的发明方法对筛选家禽群和特别是鸡群的ARVD感染特别有用。家禽的ARVD有无的筛选能用于控制或防止RSS和MAS的爆发的方法。上述发明方法可用于筛选家禽蛋的ARVD的有无。筛选蛋ARVD的有无能用于确定用于疫苗生成的蛋没有ARVD。发明也提供确定蛋没有ARVD的方法，包含检测蛋中ARVD的有无。上述任何检测发明核酸有无的方法能用于确定蛋没有ARVD。上述方法中，蛋可以是鸡蛋。在进一步实施方式中，蛋是胚胎期鸡蛋并且特别是用于疫苗生产的胚胎期鸡蛋。生产的疫苗可以是流感疫苗。抗体和免疫分析在一个实施方式中，本发明提供特异结合发明多肽的抗体。特别地，发明抗体特异结合包含SEQ ID N0:3和/或SEQ ID N0:4的氨基酸序列的多肽。“特异结合”指抗体结合发明多肽的基本亲和性大于BSA。优选，亲和性是对发明多肽至少100倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍等大于BSA。在一个实施方式中，抗体结合发明多肽的亲和性以最少10倍、100倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍等大于与任何其他呼肠孤病毒衍生的VP6多肽的结合亲和性。在另一个实施方式中，抗体结合发明多肽的亲和性以最少10倍、100倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍等大于与另一个轮状病毒衍生的VP6多肽的结合亲和性。特异结合发明抗体的发明多肽称为抗原。本领域已知的“抗体”包含一个或多个生物部分，通过化学或物理方式，结合感兴趣多肽的表位。发明抗体包含特异结合发明VP6多肽的ARVD病毒抗原的抗体。术语“抗体”包含从多克隆和单克隆制备和下列所得的抗体杂交(嵌合)抗体分子[38和39]；Fiah1 )2和F(ab)片段；Fv分子[40和41];单链Fv分子(sFv) [42] ;二聚和三聚抗体片 段构建物；和任何获自此类分子的功能片段，其中上述片段保留亲本抗体分子的免疫源性结合属性。术语“抗体”还包含通过非常规工艺(例如噬菌体展示)获得的抗体。如本文使用，术语“单克隆抗体”指有均一抗体群的抗体组合物。术语不限于关于抗体的种类或来源，也不试图限于生产方式。抗体使用本领域熟知并且如在参考文献43和44中公开的技术生产。例如，多克隆抗体通过用感兴趣抗原免疫合适动物产生，例如小鼠、大鼠、兔子、山羊、小鸡或绵羊。为了增强免疫原性，在免疫前将抗原连接到载体。这种载体为本领域普通技术人员熟知。免疫通常通过混合或乳化盐水中的抗原完成，优选在例如弗氏(Freund)完全佐剂的佐剂中，并且经胃肠道(通常皮下或肌肉内)注射混合物或乳液。动物通常过后用一种或多种盐水中抗原注射刺激2-6周，优选使用弗氏完全佐剂。抗体也可以通过使用本领域已知方法体外免疫生成。然后从免疫的动物中获得多克隆抗血清。单克隆抗体通常使用Kohler和Milstein的方法[45]或其修改的方法制备。通常，如上述免疫小鼠或大鼠。也可使用兔子。然而，不通过动物取血来提取血清，除去脾(可选几个大淋巴结)并溶解成单个细胞。如果需要，脾细胞可以通过细胞悬液筛选(去除非特异性结合细胞后)到有抗原包被的平板或孔中。表达膜结合免疫球蛋白特异抗原的B细胞，会结合到板上，并且不会被其余悬浮液洗掉。所得B细胞或所有溶解脾细胞然后引入与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤，并且在选择性培养基(例如次黄嘌呤、氨蝶呤和胸苷(“HAT”)培养基)中培育。所得杂交瘤通过有限稀释置板，并且分析生成特异结合免疫性抗原(和不结合不相关抗原)的抗体。选择的单克隆抗体分泌杂交瘤然后在体外(如在组织培养瓶或空心纤维反应器中)，或体内(如小鼠腹水)培育。本发明也提供检测发明多肽的试剂盒和方法。能使用任何本领域已知的检测多肽的方法。所述方法包括但不限于质谱、免疫扩散、免疫电泳、免疫化学方法、结合一配体分析、免疫组织化学技术、凝集和补体分析[46]。发明也提供通过检测生物样品中ARVD VP6抗原或抗ARVD VP6抗体的有无测定生物样品中ARVD有无的方法，所述方法包含检测抗ARVD VP6抗体(天然抗体或所述发明抗体)与ARVD VP6抗原的相互作用。“天然抗体”是对象获得的生物样品中出现的抗体，其中对象接触或定位在ARVDVP6免疫反应，造成抗ARVD VP6抗体的生成。所述对象是哺乳动物或禽。在一个实施方式中，所述对象是小鸡。在另一实施方式中，所述对象是胚胎蛋。免疫测试的设计变化极大，其中很多形式为本领域已知。例如，方案可使用固体支持物或免疫沉降。大多数实验涉及带标记抗体或多肽的使用；例如，所述标记可以是酶、荧光、化学发光、放射性或染料分子。放大免疫复合物信号的实验也是已知的；这些实验的例子是利用生物素和亲和素的实验以及酶标记和介导的免疫实验，例如ELISA实验。免疫分析可以是没有限定的不均一或均一形式以及典型或竞争类型。在不均一形式中，多肽通常结合在固体基质或支持物以帮助培育后从多肽中分离样品。能使用的固体支持物实例是硝酸纤维素(如膜或微量滴定孔形式)，聚氯乙烯(如层或微量滴定孔)，聚苯乙烯胶乳(如珠或微量滴定板、聚偏氟乙烯、重氮化纸、尼龙膜、微芯片、高或低密度生物芯片、重组免疫分析(RIBA)、微流(microf Iuidity)设备、微磁(micromagnetic)珠、活性珠和蛋白A珠。例如，Dynatech Immunlon或Immunlon 2微量滴定板或O. 25英尺聚苯乙烯珠(精确塑料球(Precision Plastic Ball))能用在非均一形式中。包含抗原多肽的所述固 体支持物通常在分离后和检测结合抗体前从检测样品洗脱。标准和竞争形式都为本领域已 知。在均一形式中，检测样品与溶液中抗原结合培育。例如，这可以是在沉降任何形成的抗原-抗体复合物的情况下。分析的标准和竞争形式都为本领域已知。在标准形式中，检测抗原-抗体复合物中抗ARVD VP6抗体的量。这可以通过测定标记抗异种(如抗鸡)识别抗ARVD VP6抗体上表位的抗体是否因为复合物形成结合来完成。在竞争形式中，样品中抗ARVD VP6抗体的量通过监控复合物中对已知量标记抗体(或其他竞争配体)的结合的竞争影响来推算。包含抗ARVD VP6抗体(或竞争实验形式中，竞争抗体的量)形成的复合物通过任何一些取决于形式的已知技术检测。例如，复合物中的未标记抗ARVD VP6抗体可以使用与标记(如酶标记)复合的抗异种Ig结合检测。在免疫沉降或聚集实验形式中,ARVD抗原和抗体之间的反应形成从溶液或悬液沉降的网络，并且形成沉降的可见层或膜。如果在检测样品中没有抗ARVD VP6抗体，则不形成可见沉降。至少有三种特异类型的颗粒凝集(PA)实验。所述实验用于检测支持物包被的多个抗原的抗体。所述实验的一种类型是使用血红细胞(RBC)血凝素实验，所述细胞被RBC上被动吸附抗原(或抗体)敏化。加入身体成分中出现的特定抗原抗体(如果有)造成包被纯化抗原的RBC凝集。消除潜在血凝素实验中的非特异反应，可用两个人工载体在PA中替代RBC。最常见的是胶乳颗粒。然而，也可用明胶颗粒。使用所述载体的实验基于包被有纯化抗原的颗粒的被动凝集。抗ARVD VP6抗原通常以所述免疫反应中使用的试剂盒的形式包装。试剂盒通常在分别的容器中包含ARVD VP6抗原、对照抗体制剂(阳性和/或阴性)、当实验形式需要相同时的标记抗体和如果标记不直接产生信号时的信号生成试剂(如酶底物)。ARVD VP6抗原可以已经结合到固体基质或与结合到基质的试剂分开。操作所述实验的指令(如书写，CD-ROM等)通常包括在试剂盒中。
在发明一个替代实施方式中，生物样品中ARVD的有无可以通过免疫组织化学的方式测定(使用在样品中探针特异抗原的抗体)。所述分析在本领域标准化，其中在组织中检测抗原称为免疫组织化学，而在培养细胞中检测通常名为免疫细胞化学。简单说，一抗通过与其特定抗原结合检测。抗体-抗原复合物然后通过第二酶结合抗体结合。在所需底物和发色团出现时，结合酶根据抗体-抗原结合位点的颜色沉积来检测。存在广泛合适样品类型、抗原-抗体亲和性、抗体类型和检测增强方法。因此免疫组织化学或免疫细胞化学检测的最优情况必须通过本领域技术人员对每个单独情况测定。生物样品中ARVD有无的发明的免疫分析、免疫组织化学检测和免疫细胞化学检测方法对筛选家禽群和特别是鸡群的ARVD感染特别有用。家禽的ARVD出现的筛选能用于控制或防止RSS和MAS的爆发的方法。发明的免疫分析、免疫组织化学检测和免疫细胞化学检测方法也用于筛选家禽蛋ARVD的有无。筛选蛋ARVD的有无能用于确定用于疫苗生产的蛋没有ARVD。
发明也提供确定蛋没有ARVD的方法，包含检测蛋中ARVD的有无。上述任何检测 发明多肽或抗ARVD抗体的有无的方法能用于确定蛋没有ARVD。上述方法中，蛋可以是鸡蛋。在进一步实施方式中，蛋是胚胎期鸡蛋并且特别是用于疫苗生产的胚胎期鸡蛋。生产的疫苗可以是流感疫苗。优选以纯化或基本纯化的形式提供本发明抗体。通常，抗体所在组合物中基本不含其它多肽，例如，小于90% (重量)，通常小于60%，更通常小于50%的组合物由其它多肽组成。疫苗发明也提供治疗或保护ARVD感染的疫苗，并且在一个实施方式中，用于治疗或防御RSS和/或MAS。发明的疫苗制剂包含含有一个或多个ARVD病毒抗原(包含ARVD VP6抗原)的发明多肽或重组或纯化亚基制剂的减毒ARVD病毒。疫苗制剂还可以包含佐剂。所述发明包含含有有本文所述的VP6多肽序列的减毒ARVD病毒的组合物。所述组合物能用作预防或治疗ARVD病毒的疫苗。本领域已知减毒病毒的方法。所述方法包含在培养细胞(家禽或哺乳动物细胞培养)中ARVD病毒的连续传代，直到ARVD病毒显示减毒功能。病毒生长的温度能是任何组织培养传代减毒发生的温度。细胞培养中一个或多个传代后ARVD病毒的减毒功能能由本领域技术人员测定。如本文使用，减毒指在家禽对象，特别是小鸡中，ARVD病毒毒力的降低。病毒复制水平的降低或动物模型中毒力下降可以指示减毒功能。在一个特定实施方式中，ARVD通过在编码VP6多肽的核酸序列引入突变来减毒。其他生产减毒ARVD病毒的方法包括在次优选或“冷”温度下细胞培养病毒的传代和通过随机突变(如化学突变)或点特异定位突变引入减毒突变到ARVD病毒基因组中。减毒RSV疫苗的制备和生成(通常可用ARVD病毒的方法)在例如参考文献47-50中公开。本发明包含含有分离或纯化来自发明多肽的ARVD病毒抗原的组合物。特别地，本发明提供含有发明多肽或其抗原片段的疫苗组合物。所述组合物还包含一个或多个佐剂。ARVD病毒抗原能从细胞培养中生长的ARVD病毒分离或纯化。或者，ARVD病毒抗原能通过本领域已知方法重组生产。能以多种本领域已知的不同表达系统生产本发明使用的ARVD病毒抗原；例如用哺乳动物、杆状病毒、细菌和酵母。所述表达系统通常使用编码本发明病毒抗原的多核苷酸。所述序列能使用标准分子生物学技术包含翻译本文列出氨基酸序列得到。因此，本发明包含编码发明病毒抗原的多核苷酸。另外，发明的病毒抗原通过合成化学方法生产(至少部分，优选全部)。本发明疫苗可以通过本领域已知任何疫苗给药途径给予，包含皮下或肌肉内注射、眼内给药、鼻内给药或口服给药。在一个实施方式中，本发明ARVD疫苗适用于口服给药。特别地，疫苗可以通过饮用水给予家禽群。概述术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可以包括其它物质，例如X+Y。词汇“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。需要时，词汇“基本上”可以忽略本发明的定义。与数值X相关的术语“约”是任选的并表示例如x± 10%。两个序列间的序列一致性百分数表示进行比对时所比较的两条序列中相同单体的百分数。利用本领域所知软件程序，例如参考文献51的7. 7. 18部分所描述的软件程序，可进行比对并确定同源性或序列一致性百分数。氨基酸或核酸序列之间的一致性优选通过Smith Waterman同源性搜索算法测定[52]，利用仿射缺口搜索，其中默认参数为缺口开放罚分=12、缺口延伸罚分=1。能使用BL0SUM62评分基质。如上文所述，本发明核酸和多肽可包含序列(a)与 SEQ ID NO: 1-4 序列一致(即 100%—致)；(b)共有与 SEQ ID NO: 1-4 序列一致；(c)与(a)或(b)的序列相比，含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个单核苷酸或氨基 酸改变(缺失、插入、取代)的序列，这些改变可以位于不同位置或连续出现；和(d)用逐对比对算法与SEQ ID NO: 1-4的特定序列比对时，移动的x单体(氨基酸或核苷酸)窗口从起点(N末端或5’)向终点(C末端或3’)移动，以便在p(p>x)个单体上比对p-x+1个这种窗口，各窗口具有至少X · y个相同比对单体，其中χ选自20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200 ;y 选自 O. 50,0. 60,0. 70,0. 75,0. 80,0. 85,0. 90、
O.91,0. 92,0. 93,0. 94,0. 95,0. 96,0. 97,0. 98,0. 99 ;并且如果 x · y 不是整数，则四舍五入至整数。优选的逐对比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法[53],使用默认参数(如缺口开放罚分=10. 0，缺口延伸罚分=0. 5，使用EBL0SUM62积分矩阵)。用EMBOSS软件包中的needle工具能方便地实施这种算法[54]。本发明核酸和多肽还可在序列(a)-(d)的N末端/5’ 一侧和/或C末端/3’ 一侧包含其它序列。除非另有说明，本发明的实施将采用化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法，这些方法在本领域技术范围内。这些技术在文献中已有充分描述。见例如文献55-62等。附图
简要说明图I:在系列稀释(2倍)和阴性对照(水)中ARVD阳性样品的扩增图。图 2 :SEQ ID NO: I 和 SEQ ID NO: 2 的 Clustalff 比对。
图 3 :SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 的 Clustalff 比对。
具体实施例方式材料和方法肠含量的样品肠含量从10日龄矮化鸡中收集。通过小鸡的肠含量中PAGE确定ARVD的多个颗粒。样品制备、病毒dsRNA的分离和PAGE在参考文献6中描述。凯杰QIAamp病毒RNA迷你试剂盒，VP6基因组片段的凝胶提取病毒dsRNA的扩增和克隆(从参考文献63所述方法中修改) 寡核苷酸连接10μ I dsRNA、2，5μ I 引物 PC3 100 μ MU μ I RNAse 抑制剂、2· 5 μ IBSA,2. 5 μ I ATP 10πιΜ、4μ1 RNA 连接酶、2. 75 μ I 缓冲液和 2. 5 μ IPEG 4000 在 17。C 培育24小时。连接的dsRNA在TE缓冲液中稀释到100 μ I和如生产商所述通过Eppendorf凝胶提取柱纯化。对14 1寡聚!17稀释液，加入1()(^1和1.54 1 DMS0，并且在99° C热循环仪中培育2分钟并用冰冷却。这个步骤后立即加入下列试剂2 μ I水、I μ I Ribolock、I. 5 μ ITRIS ρΗ8· 3 1Μ、6μ I MgCL2 50mM、2. I μ I KCl 1Μ、6μ I dNTPs 2. 5mM、0. 35 μ I AMV 逆转录酶。反应在42° C培育45分钟，然后在50° C培育15分钟。加入I μ I EDTA IM终止反应。残留RNA通过加入3. 4 μ I NaOH IM和65° C培育30分钟除去。加入4·3μ1 Tris(pH7. 5，1Μ)和 4· 3μ I HCl(IM)后在 65。C I 小时完成 cDNA退火。5μ1 cDNA反应加入到包含5 μ I Ex Taq缓冲液、4μ I dNTPs 2. 5mM、I μ 1PC2引物100 μ MU μ I Ex Taq的50 μ I PCR反应中。在72° C预培育5分钟，填充cDNA的部分悬垂。这随后用94° C培育2分钟，和94° C 30秒的30次循环，67° C 30秒和72° C 5分钟。PCR扩增子的质量和数量通过琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物通过T/A克隆方法克隆并测序。qRT-PCR对1-4μ1 dsRNA (用凯杰QIAamp病毒RNA迷你试剂盒提取)，加入3μ I的每个 10 μ M 引物(ARVD 正向引物 GCRACAACTGARACAACffG (SEQID NO: 24)和 ARVD 反向引物GGAAGCAGTTGTCATCAAC (SEQ ID NO:25))并且 99。C 变性 10 分钟。PCR 管在冰上冷却，并且加入主混物(10 μ IEppendorf RealMasterMix RT 探针 2· 5χ, O. 5 μ I ARDV 10 μ M 探针(6FAM-TTGCATATTAGATTGTCTCGCTGGTGTATA-Dabcyl(SEQ ID NO:26)), 0. 25 μ I realMasterRT酶，0· 25 μ I RNase抑制剂溶液)和PCR级水到总共25 μ I。在司查塔基(Stratagene)Μχ3000Ρ实时PCR机器上，逆转录在50° C 30分钟完成，接着95° C 2分钟起始变性和45次95° C 10秒变性的两步循环，和60° C 30秒退火/扩增。结果qRT-PCR的结果见图I所示。扩增片段的序列示于SEQ ID NO: I完整ARVD VP6核酸序列示于SEQ ID N0:2。编码多肽序列示于SEQ IDN0:4。应理解，仅以举例的方式描述了本发明，在本发明的范围和构思内可对之进行修改。表I:预测表位"SEQj开始位置j结束位置j隻基酸序列戕长度
ID No._____
5— 4 〗2 Tssialtvr 9 —.....6..................................— .24...............................................................................—.....33..............................................................................—.....Y'SKVSDVIQQ.......................................................................................................................................................................................................................................................................................10.....................................................................
7— 3743MVRVLNG7
8— ...6278DLPQLGTTLLNIDANYV~ 17
9一 88 — 103LTEFVIAVCETELLVD16
"To Ti! Π9 PQsimill9
11— 121128IiiKYVFLNj ~
12— 137144E WH Y RL SA8
13— 150162SNHVPYTFPYDMA13
14— 164■■174AYDRVTAAYDNI I —
15—183195LNNAIH FAAF DQ D—13
16207235 FEYLYNLRTPVSNATIVIHPISILSV 29____PSM__
17— 241247ATHYWPY
18— 260275R'/EFQIAGQV-1YVAAN16Ii290 pqfdavn11 io
20 — 292306Tmrrlflladlqm I 115
.....21.......................—.....314.......................... 328....................................................THQ AVISTKIE VLN A...................................................................................................—15...................................
22 — 333 347 TVPSIDEHLYALIVG 15.....23....................................................................355.....................................................................................................362............................................................................................................QAG'pvt'PF............................................................................................................................................................................................................................................................................................................8....................................................................................

表2:引物序列

SEQ ID IElqJSEQ ID 反向
NO:___NO:__
27TTAGAAACCAAGCTGCCACA28TGCAAATCAGCTAGCAATGG
29rGCCmTGCTAG^GP^TTG30'ACGCM^CmGmGAAmh
3 Il\ACCAAGCTGCCAC^CACTA__32__TGCAAATCAGCTAGCAATGG_
33__AAACCAAGCTGCCACACACT__34__AAACCAAGCTGCCACACACT_
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1.ー种核酸,所述核酸包含 (a)与如SEQID NO: I或SEQ ID NO: 2所示核酸序列至少90%—致性的核酸序列； (b)与如SEQID NO: I或SEQ ID NO: 2所示核酸序列的反义互补序列至少90%—致性的核酸序列； (c)包含SEQID NO: I和/或2中至少24个连续核苷酸的如SEQ ID NO: I和/或2所示核酸序列的片段； (d)包含SEQID NO: I和/或2反义互补序列中至少10个连续核苷酸的如SEQ ID NO: I和/或2所示核酸序列的反义互补序列的片段；或 (e)与如SEQID NO: I或SEQ ID NO: 2所示核酸序列在高度严谨情况下杂交的核酸序列。
2.如权利要求I所述的核酸，其特征在于，所述核酸还包含可检测标记。
3.ー种试剂盒，所述试剂盒包含用于扩增权利要求I所述ARVD病毒核酸内模板序列的引物，所述试剂盒包含第一引物和第二引物，其中所述第一引物包含与所述模板序列某部分基本互补的序列且所述第二引物包含与所述模板序列某部分基本互补的序列，所述弓I物中具有上述基本互补性的序列定义被扩增的模板序列末端。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含与所述模板序列某部分基本互补或与所述模板序列的反义互补序列某部分基本互补的探针序列。
5.如权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述模板序列包含在如SEQID NO: I或SEQ ID NO:2所示的核酸序列中。
6.一种诊断ARVD感染或鉴定生物样品中ARVD病毒有无的方法，所述方法包含检测如权利要求I所述核酸分子有无的步骤。
7.—种多肽,所述多肽包含 (a)与如SEQID NO:3或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列至少90%—致性的氨基酸序列；或 (b)包含从SEQID NO: 3和/或4中衍生至少8个连续氨基酸的如SEQ IDNO: 3和/或4所示的氨基酸序列片段。
8.ー种抗体，所述抗体特异结合如权利要求7所述的多肽和/或其抗原片段。
9.如权利要求8所述的抗体,其特征在于，所述抗体是单克隆抗体。
10.如权利要求8所述的抗体，其特征在于，所述抗体是禽抗体。
11.一种检测生物样品中ARVD抗原有无的免疫分析，所述免疫分析包含将所述样品与权利要求8-10任一项所述抗体接触的步骤。
12.如权利要求6所述的方法或如权利要求11所述的免疫分析，其特征在于，所述生物样品是蛋。
13.—种包含如权利要求7所述多肽的治疗或防御ARVD的疫苗。
全文摘要
本发明涉及新鉴定的禽轮状病毒D VP6核酸序列和其应用。
文档编号C07K14/14GK102858369SQ201180012025
公开日2013年1月2日 申请日期2011年3月4日 优先权日2010年3月4日
发明者B·罗斯 申请人:诺华有限公司