专利名称：轮状病毒Vp6基因与乳酸菌非抗性表达载体的重组与表达的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因领域，具体涉及猪A组轮状病毒Wa株Vp6基因的基因序列、Vp6基因的克隆、与“疫苗级”的非抗生素抗性的可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的质粒载体pW425t重组、乳酸杆菌、黏膜免疫、在大肠杆菌中的表达。
背景技术：
轮状病毒(Rotavirus，RV)是引起婴幼儿和各种幼龄动物非细菌性腹泻的主要病原之一。RV性腹泻是一种世界性传染病。自1969年Mebus等首次从犊牛腹泻中分离出轮状病毒(RV)以来，人们逐渐发现该病毒是引起婴幼儿及幼龄动物腹泻并致死亡的主要病原体。轮状病毒引起的感染在发展中国家每年造成近百万婴幼儿死亡。A组RV是引起全世界婴幼儿严重腹泻的最重要病原，在发展中国家，每年发生中度和严重腹泻的儿童约18000000人，死于轮状病毒感染的超过350000～390000人；在发达国家，由于RV腹泻导致脱水是儿童住院的一个常见病因，医疗费用高，据估计美国每年直接的医药损失达2亿6千万美元。2004年11月，广州轮状病毒日感染近千人。2005年2月，孟加拉国共有190000人感染轮状病毒，其中32人死亡。在动物性腹泻中，仔猪、小绵羊、马、狗、猫、兔、牛、鸡、火鸡雏、横河猴、鼠等出生动物常感染发病。自1982年我国首次分离到水牛轮状病毒后，已相继发现猪、牛、羊、犬、兔和多种禽类的RV感染报道，并已发现或分离鉴定了病毒。据对华东地区牛、猪血清中轮状病毒抗体的调查，奶牛、黄牛和猪群的抗体阳性率分别达到85.4％、83.0％、68.3％。表明我国动物轮状病毒感染较普遍，感染率也很高。轮状病毒主要侵害幼龄畜禽，15~30日龄的仔猪轮状病毒感染最为普遍；牛的发病年龄从出生到60日龄不等，但以15~40日龄发病率最高；兔和鸡的易感期是30~70日龄和7~30日龄。成年动物对轮状病毒也有易感性。仔猪感染PRV后，因腹泻使机体免疫力急剧下降，易继发多种细菌性感染，导致仔猪存活率下降，存活者生长缓慢或停滞。近年来，随着养猪数量的增加，本病的流行范围不断扩大，发病率不断增加。其发病率最高可达80％，14日龄以内新生仔猪的病死率可达100％，我国是养猪大国，仔猪存活率低给养猪业造成了严重的经济损失。一般认为RV只引起消化系统损害，但近年来的研究表明RV感染可引起多脏器损害，病毒血症是RV多系统播散的途径。动物感染RV后对生产和生长有较大影响，造成严重的经济损失。环境卫生和用水卫生条件的改善，不能减少轮状病毒的发病频率。由于目前尚无治疗轮状病毒的特效药物，因此预防显得尤为重要。为此，世界卫生组织多次呼吁各国科学家研制开发有效的轮状病毒疫苗，并将其列为最优先发展的疫苗项目之一。指出疫苗预防才是遏制轮状病毒腹泻唯一有效的手段。因此认为控制轮状病毒疾病的发生，必须从疫苗的研制着手。纵向研究表明，不论发达国家还是发展中国家，婴幼儿轮状病毒的重复感染都十分常见，尤其在出生后的最初几年内。与初次感染相比，再次感染症状一般较温和，或者为无症状感染，这一研究结果肯定了用疫苗免疫婴儿可以预防重症轮状病毒疾病。据估计，如果使用有效的疫苗，每年在全世界可以挽救500000~1000000个儿童的生命。疫苗预防是控制此病的最佳选择。虽然当前的弱毒疫苗在预防该病的发生上起到了重要的作用，它仍存在弱毒疫苗的相对不稳定，易返祖，潜在感染等缺陷。随着分子生物学的深入研究，新型基因工程疫苗的问世为猪轮状病毒的诊断和预防提供了一条的途径。
随着分子生物学技术的进展，RV主要保护性抗原基因已经被克隆和测序，现已明确VP6蛋白为RV组特异性抗原，位于病毒的内壳，占病毒颗粒的51％。由于VP6主要刺激机体产生黏膜免疫抗体sIgA，在黏膜免疫中具有非常重要的作用，因而研制轮状病毒Vp6基因介导黏膜免疫的口服基因工程疫苗具有重要的意义。
但是目前在基因工程中需要解决的问难是如何纯化表达的蛋白，因为基因工程中所用的表达重组保护性抗原的受体菌株主要是活的减毒病原菌，而细菌疫苗的免疫保护力往往和菌株的残余毒力成正比。所以试图寻找能良好地表达外源性抗原且安全的受体菌株日益受到人们的关注。乳酸杆菌为人及动物体内正常菌群的重要成员，以乳酸杆菌作为表达外源保护性抗原基因的受体菌株，就可以将乳酸菌的生物学功能和外源功能抗原基因的特异性免疫相结合，Christiaens(1992)等研究发现乳酸杆菌可以作为基因工程菌表达的外源基因，与大肠杆菌，相比较乳酸杆菌仅有一层细胞膜，目的蛋白可在信号肽的引导下直接分泌进入上清，从而容易获得目的蛋白。Allson(1996)等研究指出，乳酸杆菌是保护性抗原基因或免疫调节因子的良好的转化或表达系统，以乳酸杆菌为载体表达内源或外源蛋白，在功能食品、医疗保健等领域具有诱人的前景。这类疫苗的研制成功将为新型疫苗的发展探索一条新路。
但目前报道的人和动物消化道共生乳酸杆菌表达载体系统，多是以抗生素抗性作为外源基因稳定表达的压力。然而由于抗药性基因不断向环境中漂移扩散，可能造成对环境微生态的破坏，带来严重后果，因而这类表达系统离“可食性”的要求还有很大的距离，不能直接用于人和动物。所以构建以营养因子代替抗生素基因作为载体表达的选择压力具有非常重要的意义。非抗生素抗性为选择压力的表达系统是以细菌的管家基因缺陷菌株为受体菌，在质粒上克隆入同源或异源完整的受体菌缺陷基因，作为外源基因稳定表达的压力。自Nakayama(1988)用Asd基因为选择压力构建鼠伤寒沙门氏菌非抗性表达系统以来，此类表达系统发展很快。目前比较成熟的系统包括胸苷酸合成酶基因(thymidylatesynthase，thyA)、Asd基因、β-半乳糖苷酶基因、SSB基因、D-木糖异构酶基因、琥珀突变体、赭石突变体、乳链菌肽及其它的营养生长因子基因等。
发明内容
本发明的目的是本发明提供了一种轮状病毒Vp6基因与乳酸菌非抗性表达载体的重组与表达，即猪A组轮状病毒Wa株Vp6基因的基因序列、与“疫苗级”的非抗生素抗性的可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的质粒载体pW425t重组、乳酸杆菌、在大肠杆菌中的表达。
本发明的技术方案是轮状病毒Vp6全基因与乳酸菌非抗性表达载体的重组是从培养的RV中用反转录聚合酶链式反应RT-PCR技术扩增Vp6基因，开放阅读框含1194bp，编码397个氨基酸，通过T-A克隆技术，将PCR产物克隆至克隆载体pGEM-T载体中，获得重组克隆质粒pGEM-T-Vp6，以SacI和KpnI双酶切pGEM-T-Vp6和以胸苷酸合成酶基因thyA为选择压力的非抗生素抗性的可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的质粒载体pW425t，纯化回收后，以T4DNA连接酶连接，连接产物转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E.coli X13中，在普通的LB固体培养基(没有添加胸腺嘧啶)上培养，经生长功能弥补，筛选获得原核重组表达质粒pW425t-Vp6。
轮状病毒Vp6基因与乳酸菌非抗性表达载体的表达是将阳性菌用苏氨酸诱导表达，经SDS-PAGE电泳分析显示，重组质粒获得高效表达，融合蛋白的相对分子量约为44.88kD。
本发明人已构建了“疫苗级”的以thyA基因为选择标记的可在乳酸菌与大肠杆菌穿梭表达载体pW425t非抗性表达载体和将柔嫩艾美耳球虫S07基因成功表达的基础上。应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增猪轮状病毒Vp6全长基因。应用DNASTAR和DNAMAN软件进行分析。该轮状病毒Wa株Vp6基因的核苷酸序列及相应的氨基酸序列是1 atg gag gtt ctg tac tct cta tca aaa act ctc aaa gat gct aaa gac1 MET Glu Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Lys Asp49 aaa att gtc gaa ggc aca tta tac tcc aat gta agt gat cta att caa17 Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln97 caa ttt aat caa atg ata att act atg aat gga aat gag ttc caa act33 Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr145gga gga att ggt aat cta ccg att aaa aat tgg aat ttt gat ttt gga49 Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Ile Lys Asn Trp Asn Phe Asp Phe Gly193tta ctt gga aca act cta cta aat tta gat gct aac tac gtc gaa acg65 Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr
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pW425t载体是在大肠杆菌和乳酸菌之间穿梭表达的质粒，所以重组质粒首先在大肠杆菌中表达，因为大肠杆菌具有遗传背景清楚、培养方便、操作简便、尤其是应用氯化钙转化方法简单。重组质粒转化入thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E.coli X13中，经过生长功能弥补筛选阳性克隆pW425t-Vp6，通过SDS-PAGE和Western-blot检测外源基因Vp6是否可以通过乳酸菌与大肠杆菌的穿梭表达载体pW425t，首先在大肠杆菌中表达及其是否具有反应源性。
就目前报道的人和动物消化道共生乳酸杆菌表达载体系统，多是以抗生素抗性作为外源基因稳定表达的压力。然而由于抗药性基因不断向环境中漂移扩散，可能造成对环境微生态的破坏，带来严重后果，因而这类表达系统离“可食性”的要求还有很大的距离，不能直接用于人和动物。所以构建以营养因子代替抗生素基因作为载体表达的选择压力具有非常重要的意义。非抗生素抗性为选择压力的表达系统是以细菌的管家基因缺陷菌株为受体菌，在质粒上克隆入同源或异源完整的受体菌缺陷基因，作为外源基因稳定表达的压力。自Nakayama(1988)用Asd基因为选择压力构建鼠伤寒沙门氏菌非抗性表达系统以来，此类表达系统发展很快。目前比较成熟的系统包括胸苷酸合成酶基因(thymidylatesynthase，thyA)、Asd基因、β-半乳糖苷酶基因、SSB基因、D-木糖异构酶基因、琥珀突变体、赭石突变体、乳链菌肽及其它的营养生长因子基因等。
人和动物的黏膜免疫系统是指机体与外界相通的腔道黏膜(胃肠道黏膜、呼吸道黏膜、生殖道黏膜等)表面的免疫。是机体抵抗感染的第一道防线，所以黏膜免疫系统在机体抵抗感染方面起着极其重要的作用。
猪轮状病毒Vp6基因可以通过与乳酸菌表达载体重组，在消化道乳酸菌中表达，分泌的VP6蛋白可以通过刺激肠黏膜相关淋巴样组织(GALT)而诱导产生抗轮状病毒的sIgA抗体，在抵抗猪轮状病毒感染中具有重要功能。
将克隆质粒pGEM-T-Vp4和以thyA基因为选择压力的载体pW425t均以SacI、KpnI双酶切，纯化回收后，以T4 DNA连接酶连接。连接产物转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E.coli X13中，在普通的LB固体培养基(没有添加胸腺嘧啶)上培养，经生长功能弥补，筛选获得原核重组表达质粒pW425t-Vp6。将阳性菌用苏氨酸诱导表达。SDS-PAGE电泳分析显示，重组质粒获得高效表达，融合蛋白的相对分子量约为44.88kD。Western blot分析显示该表达产物与猪轮状病毒多克隆抗体发生反应，而载体蛋白不与抗体发生反应，表明该融合蛋白具有良好的抗原性，为下一步pW425t-Vp6在乳酸菌受体菌株中表达提供依据，也为研制口服轮状病毒乳酸菌疫苗奠定基础。
本发明的有益效果是1、肠局部粘膜免疫机制局部免疫机理在介导保护中起重要作用。肠道局部免疫中起主要作用的是IgA。VP6被认为是RV产生免疫的最重要蛋白，可以刺激粘膜分泌sIgA，从而介导粘膜免疫，抵抗再次感染。在肠管，sIgA的产生，必须是抗原刺激肠壁相关淋巴样组织(GALT)而诱导出的双聚体的IgA产生细胞返回和固定于肠道粘膜固有层。有些研究认为，肠道的粘膜免疫很可能是临床免疫的更持久的预报因子。自然感染所介导的短期保护本质上也与sIgA有关。粘膜免疫不仅仅是体液免疫，也包括细胞免疫和其他免疫因子的作用。
粘膜或腺体分泌的sIgA抗体可结合特殊的上皮细胞(M细胞)，并经M细胞运输至上皮再到达粘膜淋巴组织。该运输过程可使sIgA或IgA-抗原复合物与淋巴细胞或抗原递呈细胞反应，露出IgA结合位点[73]。B细胞及T细胞上IgA结合位点(FcA受体)已在不同动物中找到。进入粘膜组织后，IgA抗体(与抗原相连或不相连)可发挥多种功能。首先引发粘膜免疫反应，其次，由于IgA-抗原复合物可经M细胞运输至腹下淋巴组织，抗原递呈细胞(B细胞、巨噬细胞)的FcA受体可强化摄取和处理抗原；经此途径，再摄取的sIgA可形成一个扩大环，增强免疫和再次免疫反应；最后，M细胞再次摄取的IgA可通过基因型网络调节免疫反应。因此，IgA能通过M细胞摄取途径来活化粘膜免疫系统。
1.1肠粘膜免疫对急性感染的恢复作用病毒特异性sIgA和/或CTL对急性病毒感染恢复的重要性由实验动物中的几个发现所证实。产生病毒特异性sIgA能力缺陷的小鼠在感染鼠RV后发展为慢性排毒。另外，一些报道支持病毒特异性CTL在急性感染恢复中可能起重要作用，如，病毒特异性CTL于感染一周内出现在小鼠肠粘膜表面；不能产生RV特异性CTL的成年小鼠(β2-微球蛋白基因缺失小鼠)排毒延长好几天；给急性感染乳鼠输入病毒特异性CTL能改善腹泻症状。
1.2粘膜免疫对保护再感染的作用RV自然感染能保护再感染引起的发病。肠粘膜表面存在的病毒特异性sIgA的量(反映在粪便中)能预测对发病的保护性，也能由血清中病毒特异性IgA的存在来预测。由于RV在肠粘膜表面成熟的绒毛上皮细胞中复制，一般不能在血流中或远离肠道的位置检测到病毒。因此，对再感染的保护一定由活跃于肠粘膜表面的免疫反应所介导。此外，在实验动物中，肠粘膜表面和血清中病毒特异性IgA能使再感染引起的排毒量减少。然而疫苗免疫试验表明，血清及肠道RV特异性IgA抗体滴度与抗病抗排毒保护性之间有普遍的而非绝对的相关性。疫苗免疫与自然感染结果的差别，可能与宿主对同源和异源性病毒感染的反应不同有关，例如同源性病毒比异源性病毒在宿主肠绒毛上皮细胞的适应繁殖能力强很多(相差104～105)；也可能与研究方法的不同有关，例如采集血样的时间不同，疫苗免疫血样采集于最后一次服苗一月后，这可能与第一次服苗相差几个月，而血清中RV特异性IgA是短寿的，所以这时IgA的水平不能精确预示抗病保护作用。
轮状病毒(Rotavirus，RV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)、轮状病毒属(Rotaviras)，作为婴幼儿和动物腹泻的主要病原在世界范围内广泛流行，每年造成巨大损失。鉴于其危害严重且无有效治疗手段，世界卫生组织将RV疫苗列为最优先发展的疫苗项目之一，尤其是它的基因工程疫苗的研制更为重要。
随着分子生物学技术的进展，RV主要保护性抗原基因已经被克隆和测序，现已明确VP6蛋白为RV组特异性抗原，位于病毒的内壳，占病毒颗粒的51％。由于VP6主要刺激机体产生黏膜免疫抗体sIgA，在黏膜免疫中具有非常重要的作用，因而研制轮状病毒Vp6基因介导黏膜免疫的口服基因工程疫苗具有重要的意义。
图1是本发明pW425t-Vp6质粒构建图谱具体实施方式
实施例11、目的基因PCR扩增与克隆根据GenBank中(AF317123.)猪轮状病毒Wa株Vp6的基因序列，设计一对扩增该基因的PCR引物(由大连TaKaRa公司合成)P15’-GTGGAGCTCATGGAG GTT CTG TAC TCT TTA T-3’；P25’-GTGGGTACCTCA CTT AAT CAACAT GCT TCT-3’(划线序列分别为SacI、KpnI酶切位点)。按Trizol试剂盒方法提取猪轮状病毒总RNA；以总RNA为模板，以P1、P2为引物，对Vp6基因进行RT-PCR扩增。50μl反转录反应体系及反应条件如下取10μl mRNA，75C加热5min，使双链RNA变性，迅速置于冰上冷却后，再加入5×AMV Buffer10.0μl；dNTPs(10mM each)4.0μl；RNasin 1.0μl；下游引物0.5μl；AMV(5Units/μl)0.5μl；Olig(dT)1.0μl；MgCl2(25mM)4.0μl；加DEPC水19.0μl。42C反转录1h，95C煮沸5min灭活AMV反转录酶。50μl PCR反应体系及反应条件如下取经DEPC处理的0.5ml EP管，在50μl反应体系中加入10×PCR Buffer 5.0μl；dNTPs(2.5mM)3.0μl；上游引物1.0μl；下游引物1.0μl；cDNA 5.0μl；RNasin 1.0μl；MgCl22.0μl；EX Taq Dnase 0.5μl；DEPC水31.5μl。反应条件为94C预变性8min；94C变性1.5min，55C退火1.0min，72C延伸2.0min，共35 circles；72C延伸10min。PCR产物经纯化后，以T4 DNA连接酶连接于pGEM-T Vector中，并转化至感受态E.coliJM109中。通过质粒提取、酶切分析及PCR扩增鉴定重组克隆，获得重组质粒pGEM-T-Vp6，送至大连TaKaRa公司进行测序，并应用DNASTAR软件进行分析。
2、乳酸菌与大肠杆菌原核表达重组质粒的构建与目的基因的表达对重组质粒pGEM-T-Vp6和以thyA基因为选择压力的载体pW425t均以SacI、KpnI双酶切，切胶纯化后，以T4 DNA连接酶连接。连接产物转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E.coli X13中，在普通的LB固体培养基(没有添加胸腺嘧啶核苷)上培养，经生长功能弥补，筛选获得原核重组表达质粒pW425t-Vp6。
将原核重组表达菌接种于5ml普通的LB液体(没有添加胸腺嘧啶核苷)培养基中，37℃ 200r/min培养过夜。取2ml接种于100ml LB液体培养基中，37℃250r/min培养至OD600为0.6～0.8，在培养基中添加40mM DL-苏氨酸。每隔1h取一次菌液，取至10h。以同样的方法诱导含空质粒pW425t的E.coli X13 10h作对照。
3、SDS-PAGE分析将各个时间诱导收获的菌液OD600均调至0.72，取菌液1.2ml，4℃离心收集菌体。沉淀菌体中加入100μl去离子水裂解细菌，再加入等量的2×SDS凝胶上样缓冲液，混匀后，于沸水中煮沸5min，15000r/min离心10min，取上清15μl按《分子克隆》中方法进行15％SDS-PAGE。
4、Western blot分析表达产物经SDS-PAGE后，按《分子克隆》中方法以BIO-RAD系统电转移至PVDF转移膜上，经牛血清白蛋白封闭后，依次加入轮状病毒兔抗猪多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，最后在联苯胺(DAB)溶液中显色并观察结果。
5、结果5.1轮状病毒的RNA提取此实验株符合A组RV核酸电泳时11个节段按分子量大小呈4-2-3-2分布模式。它们其中6个编码结构蛋白VP1-VP4、VP6、VP7，5个编码非结构蛋白NSP1(NS53)、NSP2(NS35)、NSP3(NS34)、NSP4(NS28)和NSP5(NS26)，其中4种蛋白VP6、VP4、VP7及NSP4有重要作用。
5.2RT-PCR扩增用提取的总RNA为模板反转录成cDNA后，经PCR扩增在1％琼脂糖凝胶中检查，以DL2000为Marker，结果扩增出与预期大小相符的条带。
5.3目的片段的回收纯化用DNA回收试剂盒对目的片段进行纯化，纯化后的产物取1μl在1％琼脂糖凝胶中检查，结果无非特异性条带存在。
5.4重组质粒的鉴定5.4.1重组质粒的提取鉴定挑取其中7个白色菌落和1个蓝色菌落，接种普通AMP+LB培养液中，37℃过夜培养后，进行质粒的小抽提。经1％琼脂糖凝胶电泳，结果显示1、3、4、5菌落的质粒可能含有目的片段。
5.4.2酶切鉴定挑选其中的1、3号菌进行SacI和KpnI酶切鉴定。结果显示，菌株3中的重组载体中含有外源基因Vp6，为阳性克隆；菌株1中无外源Vp6基因，为阴性克隆。
5.4.3 PCR鉴定以3号菌的质粒为模板，进行PCR鉴定，扩出与预期大小相符的目的条带。
5.5乳酸菌与大肠杆菌原核重组表达质粒的构建及重组子的鉴定pGEM-T-Vp6和pW425t均以SacI、KpnI双酶切和纯化后，由T4 DNA连接酶连接，连接产物转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E.coli X13中，thyA基因缺陷的E.coli X13在普通的LB培养基上不能生长或生长不良，必须在加有外源的胸腺嘧啶核苷(50μg/ml)的条件下才能恢复生长。在本实验中含thyA基因重组质粒pW425t-Vp6的转入能使thyA基因缺陷的E.coli X13在普通的LB平板上恢复生长。
将经过生长功能弥补获得的菌落在普通LB液体培养基(未添加外源的胸腺嘧啶核苷(50μg/ml)中培养，对筛选的7个菌落进行质粒提取，菌株1、2可能含有预期的质粒，但尚需进一步鉴定。用SacI和KpnI双酶切，得到约3700bp的pW425t线性片段和1194bp的插入片段，表明已构建出猪轮状病毒Vp6基因的乳酸菌与大肠杆菌原核重组表达质粒pW425t-Vp6。
5.5.1重组表达质粒pW425t-Vp6的PCR鉴定以初筛的重组质粒1为模板，PCR扩增Vp6基因，结果扩增出目的条带而无非特异性条带。
5.5.2重组表达质粒pW425t-Vp6的酶切鉴定将阳性重组质粒1用SacI和KpnI酶切，应得两条片段大片段约为3700kb，小片段约为1194bp，酶切结果与预期相符。
5.6 SDS-PAGE分析分析上述经过鉴定为阳性的克隆菌株1在E.coli X13中各时间的表达情况。Vp6基因获得了表达，与对照相比，其表达量随时间的延长而增加，蛋白质的相对分子量约为44.88kD融合蛋白，与预期VP6蛋白的分子量一致。而含空质粒pW425t的E.coli X13对照则未见该蛋白质表达。
5.7 Western blot分析表达产物经SDS-PAGE电泳后，转移至PVDF转移膜上，以兔抗猪轮状病毒多克隆抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗，联苯胺(DAB)为底物，进行蛋白印迹分析，结果在44.88kD处可见有一条明显的蛋白印迹带，说明该表达产物与猪轮状病毒多克隆抗体具有反应原性。
权利要求
1.一种轮状病毒Vp6基因与乳酸菌非抗性表达载体的重组与表达，其特征是轮状病毒Vp6基因与乳酸菌非抗性表达载体的重组是从培养的RV中用反转录聚合酶链式反应RT-PCR技术扩增Vp6基因，开放阅读框含1194bp，编码397个氨基酸，通过T-A克隆技术，将PCR产物克隆至克隆载体pGEM-T载体中，获得重组克隆质粒pGEM-T-Vp6，以SacI和KpnI双酶切pGEM-T-Vp6和以胸苷酸合成酶基因thyA为选择压力的非抗生素抗性的可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的质粒载体pW425t，纯化回收后，以T4DNA连接酶连接，连接产物转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E.coli X13中，在普通的LB固体培养基(没有添加胸腺嘧啶)上培养，经生长功能弥补，筛选获得原核重组表达质粒pW425t-Vp6；轮状病毒Vp6基因与乳酸菌非抗性表达载体的表达是将阳性菌用苏氨酸诱导表达，经SDS-PAGE电泳分析显示，重组质粒获得高效表达，融合蛋白的相对分子量约为44.88kD。
2.根据权利要求1所述的一种轮状病毒Vp6基因与乳酸菌非抗性表达载体的重组与表达，其特征是从培养的RV中用反转录聚合酶链式反应RT-PCR技术扩增Vp6基因，开放阅读框含1194bp，编码397个氨基酸，通过T-A克隆技术，将PCR产物克隆至克隆载体pGEM-T载体中，获得重组克隆质粒pGEM-T-Vp6，应用DNASTAR和DNAMAN软件进行分析，该轮状病毒Wa株Vp6基因的核苷酸序列及相应的氨基酸序列是1 atg gag gtt ctg tac tct cta tca aaa act ctc aaa gat gct aaa gac1 MET Glu Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Lys Asp49aaa att gtc gaa ggc aca tta tac tcc aat gta agt gat cta att caa17Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln97caa ttt aat caa atg ata att act atg aat gga aat gag ttc caa act33Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile ThrMet Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr145 gga gga att ggt aat cta ccg att aaa aat tgg aat ttt gat ttt gga49Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Ile Lys Asn Trp Asn Phe Asp Phe Gly193 tta ctt gga aca act cta cta aat tta gat gct aac tac gtc gaa acg65Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr241 gcc cgc aat aca att gat tat ttt gta gat ttt gta gat aat gta tgt81Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val cys289 atg gac gaa atg gtt aga gaa tca caa aga aat gga att gca cca caa97Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln337 tca gat tca ctt ata aag tta tca ggc att aaa ttt aaa aga ata aat113 Ser Asp Ser Leu Ile Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn385 ttt gac aat tca tca gaa tac ata gag aac tgg aat ttg caa aat aga129 Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg433 aga caa aga acg ggt ttt aca ttt cat aaa cca aac att ttc cct tat145 Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr481 tca gct tca ttc acg ttg aac aga tca caa ccg gct cat gat aac ttg161 Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Asp Asn Leu529 atg ggt acg atg tgg ctc aat gcg gga tca gaa att cag gtc gct gga177 Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly577 ttc gac tac tca tgt gca ata aac gcg cca gct agt acg caa caa ttt193 Phe Asp Tyr Ser Cys Ala Ile Asn Ala Pro Ala Ser Thr Gln Gln Phe625 gag cat att gta cag ctt cga agg gtg ttg act aca gct aca ata act209 Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr673 ctt tta cca gat gca gaa aga ttt agt ttt cca aga gtg att aat tca225 Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser721 gct gac gga gcg act aca tgg tac ttc aat cca gtg att ctt aga cca241 Ala Asp Gly Ala Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro769 aat aac gtt gaa ata gag ttt cta cta aac ggg cag ata ata aat act257 Asn Asn Val Glu Ile Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr817 tac caa gca aga ttt gga acg atc ata gct aga aat ttt gat aca att273 Tyr Gln Ala Arg Phe Gly Thr Ile Ile Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile865 aga ttg tca ttt cag ttg atg aga cca cca aat atg aca cca gct gta289 Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Pro Asn Met Thr Pro Ala Val913 gcg gcg tta ttt cca aat gcg cag cca ttt gaa cat cac gca aca gta305 Ala Ala Leu Phe Pro Asn Ala Gln Pro Phe Glu His His Ala Thr Val961 gga ctc acg ctt aga att gaa tct gca gtt tgt gaa tca gta ctt gcc321 Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Val Cys Glu Ser Val Leu Ala1009 gac gca agc gaa aca atg cta gca aat gtg aca tct gtt aga caa gaa337 Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu1057 tac gcg ata cca gtt gga cca gtt ttt cca cca ggt atg aat tgg act353 Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr1105 gat ttg atc act aac tat tcg cca tct aga gag gat aac ttg cag cgt369 Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg1153 gta ttt aca gtg gct tcc att aga agc atg ttg att aag tga385 ValPhe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Ile Lys***
全文摘要
一种轮状病毒Vp6基因与乳酸菌非抗性表达载体的重组与表达，属于生物基因领域，其特征是将克隆质粒和以thyA基因为选择压力的载体均以SacI、KpnI双酶切，纯化回收后，以T4 DNA连接酶连接，连接产物转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E.coli X13中，在培养基上培养，经生长功能弥补，筛选获得原核重组表达质粒；将阳性菌用苏氨酸诱导表达，重组质粒获得高效表达，融合蛋白的相对分子量约为44.88kD。有益效果是VP6蛋白为RV组特异性抗原，位于病毒的内壳，占病毒颗粒的51％。由于VP6主要刺激机体产生黏膜免疫抗体sIgA，在黏膜免疫中具有非常重要的作用，因而研制轮状病毒Vp6基因介导黏膜免疫的口服基因工程疫苗具有重要的意义。
文档编号C07K14/14GK1952156SQ200510017199
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月19日 优先权日2005年10月19日
发明者王春凤, 王会岩, 李玉 申请人:吉林农业大学, 王春凤, 王会岩, 李玉