专利名称：一种乳酸菌食品级表达载体pMG36N及其制备方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种乳酸菌食品级表达载体pMG36N及其制备方法。
背景技术：
乳酸菌(LAB)是一类被公认安全的食品级微生物(generally regard as safe, GRAS)，它 包括乳酸乳球菌、双歧杆菌及乳酸杆菌等十几个属，是人类一大益生菌，有增加食物的营养 价值、改善肠道环境、改善乳糖代谢、控制血清胆固醇水平、抑制致病菌繁殖、抗肿瘤活性 等功能，在食品发酵、医药等与人类生活密切相关的领域有着极其重要的作用。
乳酸乳球菌(Zactococo^/acto)作为乳酸菌的一个模式种长期应用于食品发酵工业，用 于生产和保存乳制品及作为异源蛋白的输送载体，已逐渐成为在食品工业、微生物药物和疫 苗研究等领域具有极其重要应用前景的基因工程菌。近年来，构建乳酸菌食品级表达系统，
探究一些有实际应用价值的基因在乳酸菌中的克隆和表达已成为乳酸菌分子遗传学的研究热 点。
传统的乳酸菌表达载体大多以红霉素或氯霉素等抗生素抗性基因作为筛选标记，但将抗 生素抗性基因投放到环境中或人和动物体内，由于存在抗性因子转移的隐患，可能带来生物 安全性的严重后果，所以从食品安全性考虑，含抗生素抗性基因标记的微生物不能应用于食 品生产中。目前国内外报道的食品级选择标记有a-半乳糖苷酶基因flga，镉抗性基因CdR， 丙氨酸消旋酶基因"/"等，由于上述选择标记是非乳酸菌来源的，其应用安全性将受到一定 的限制。
Nisin抗性基因m's/所编码的蛋白Nisi,是乳链菌肽Nisin产生菌为防御Nisin对自身的 毒害作用而产生的一种脂蛋白，将其导入对Nisin敏感的宿主菌中，能赋予宿主菌对Nisin的 抗性，这为它的应用带来了极大的方便。此外，Nisin是被公认安全无毒的天然食品防腐剂， 且n"/基因来源于产Nisin的乳酸菌，这使得将m's/基因作为乳酸菌食品级选择标记更有优 势。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可以用于食品生产的安全的乳酸菌食 品 级表达载体pMG36N。本发明的另一 目的在于提供上述表达载体pMG36N的制备方法。 本发明通过如下技术方案予以实现
在乳酸菌表达载体pMG36e的基础上，敲除了编码红霉素抗性基因的碱基序列，插入了 编码脂蛋白Nisi的w"/碱基序列，还保留了 pMG36e中的p32启动子、pUC18的多克隆位点 及pWVOl的复制子片段。
其中，所述编码脂蛋白Nisi的m'W碱基序列来源于产Nisin的乳酸菌。 所述pMG36e中p32启动子、pUC18的多克隆位点及pWVOl的复制子片段均来源于乳 酸菌。
本发明乳酸菌食品级表达载体pMG36N的制备方法包括如下步骤
(1) 设计引物pl和p2，以pLEB590为模板，扩增出编码脂蛋白NisI的wW片段，其 中，pl序列如SEQ ID NO:l所示，p2序列如SEQ ID NO:2所示；
(2) 将mi/片段进行纯化后，进行双酶切；
(3) 经双酶切后的m's/片段与经相同酶切处理的pMG36e在DNA连接酶的作用下进行 连接，连接液热激转化至感受态；
(4) 取转化菌液涂布在含红霉素的平板上，37"C培养后，挑单克隆至含红霉素的培养基 中培养，提取质粒进行酶切鉴定、测序，将阳性重组子命名为pMG36e-NisI;
(5) 将pMG36e-NisI转化至MG1363中，然后将转化菌液涂布在含Nisin的平板上，30°C 培养，挑单克隆至含Nisin的培养基中培养，提取质粒进行酶切鉴定；
(6) 设计引物p3和p4，扩增出pMG36e-NisI中除红霉素基因以外的片段，此片段即为 pMG36N，其中，p3序列如SEQIDNO:3所示，p4序列如SEQ ID NO:4所示。
上述制备方法优选为
(1)设计引物pl和p2，以pLEB590为模板，扩增出编码脂蛋白Nisi的m's/片段，其 中，pl序列如SEQ ID NO:l所示，p2序列如SEQ ID NO:2所示；； (2 )将片段进行纯化后，用Z&al+PWl进行双酶切；
(3 )经双酶切后的m's/片段与经相同酶切处理的pMG36e在T4 DNA连接酶的作用下进 行连接，连接液热激转化至Eco// XL-Blue感受态；
(4) 取转化菌液40ul涂布在含红霉素的LB平板上，37'C培养16小时后，挑单克隆至 含红霉素的液体LB中过夜培养，提取质粒进行酶切鉴定、测序，将阳性重组子命名为 pMG36e-NisI;
(5) 将pMG36e-NisI电转化至MG1363中，然后将电转化菌液涂布在含Nisin的GM17平板上，3(TC培养3天，挑单克隆至含Nisin的液体GM17中3(TC静置过夜培养，提取质粒 进行酶切鉴定；
(6) 设计引物p3和p4扩增出pMG36e-NisI中除红霉素基因以外的片段，将此片段即为 pMG36N，其中，p3序列如SEQ ID NO:3所示，p4序列如SEQ ID NO:4所示；
(7) 将pMG36N的PCR产物进行纯化后，用五coRI进行酶切处理；
(8) 将上述酶切产物进行纯化，然后等体积加入T载体试剂盒中的Solution I， 16'C让 其自连过夜；
(9) 将连接液电转化至MG1363中，然后将电转化菌液涂布在含Nisin的GM17平板上， 30'C培养3天左右，挑单克隆至含Nisin的液体GM17中，3(TC静置过夜培养，提取质粒进 行鉴定，并将菌液转接至含红霉素的液体GM17中进行复检。
其中，所述步骤(1)中，pl引入Z&al位点，p2引入尸Wl位点。 所述步骤(6)中，p3和p4的上游和下游均引入五coRI位点。 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明乳酸菌食品级表达载体pMG36N通过将原有的pMG36e中的红霉素抗性基因敲 除，避免了抗性因子转移的隐患，可以用于食品生产，将乳酸菌来源的m's/基因作为乳酸菌 的选择标记更为安全，利用本发明载体可制成活菌制剂直接表达有益于人类健康的基因，避 免了传统基因工程所需的繁琐复杂的提取工艺，极大降低了微生物制剂的生产成本。
具体实施例方式
以下就实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何限定。 实施例l
一、 菌株及质粒
乳酸乳球菌MG1363和质粒pMG36e为荷兰University of Groningen Jan.Kok教授惠赠； 乳酸乳球菌MG1614和质粒pLEB590为芬兰University of Helsinki Timo TakaLa博士惠
赠；
五.co"XLl-Blue为山东大学孔健教授惠赠。
二、 培养基 l.LB培养基 Triptone 10g^ Yeast Extract 5g; NaCl 10g;加蒸馏水定容至1000ml,用NaOH调pH至7.4，分装。121°C， 20min， 4'C储存备用， 固体培养基添加1.5%的琼脂。
2. GM17培养基
M17(购自青岛海博生物有限公司) 4.23g ;
Glucose 0.5g;
加蒸馏水定容至100ml， 121°C， 20min，固体培养基添加1.5%的琼脂。
3. 大肠杆菌复苏用SOC培养基 Triptone 2% (W/V); Yeast Extract0.5% (W/V); NaCl 0.05% (W/V); KC1 2.5mmol/L; MgCl2 10腿ol/L; Glucose 20umol/Ls 121°C， 20min， 4"C储存备用。
4. MG1363感受态制备用培养基G-SGM17 M17(购自青岛海博生物有限公司) 42.3g ; Glucose 5g; Sucrose 171g; Glycin 12g; 加蒸馏水定容至1000ml， 121°C， 20min。
5. MG1363感受态制备用洗液
洗液I:含0.5mol/L Sucrose和10% (V/V) glycerol;
洗液II:含0.5mol/L Sucrose 、 10% glycerol (V/V)及0.05mol/LEDTA。
6. 乳酸乳球菌复苏用SGM17培养基 M17(购自青岛海博生物有限公司) 4.23g ; Glucose 0.5g;
Sucrose
lmol/L的MgCl2 lmol/L的CaCl2
17.1g;
2ml;
0.2ml;
加蒸馏水定容至lOOml， 121°C， 20min，分装至1.5ml的Eppendorf管中，每管lml， 4°C储存备用。
大肠杆菌用LB培养基培养，37°C， 250r/min; 乳酸乳球菌用GM17培养基培养，30°C，静置培养；
红霉素在大肠杆菌和乳酸乳球菌中的使用浓度分别为250ug/ml和10ug/ml;
Nisin在乳酸乳球菌MG1614和MG1363中的使用浓度分别为100IU/ml和20 60 IU /ml。
三、 主要试剂
乳链菌肽Nisin由浙江银象生物工程有限公司惠赠，M17 Broth购自青岛海博生物技术有 限公司。限制性内切酶Wa/、尸W/、五coi 7、 T4 DNA连接酶、Prime STAR HS DNA polymerase ， rr叫DNA聚合酶以及Ex7^DNA聚合酶、质粒小量提取试剂盒、TaKaRa DNA fragment purification kit等购自TakaRa宝生物工程(大连)有限公司，红霉素购自上海生工生物工程有限 公司，溶菌酶购自广州威佳生物有限公司，胶回收试剂盒购自Promega生物有限公司。其他 试剂为国产分析纯。
四、 主要仪器
冷冻离心机、PCR仪(Eppendorf， MastertycLer型)，凝胶成像分析仪(Bio-Rad， Universal Hood II型)，电转仪(Bio-Rad， Gene Pulser Xcell)，电击杯(0.2cm, Bio-Rad),超微量紫外/ 可见光光度计(NavoVue)。
五、 乳酸乳球菌食品级表达载体pMG36N的具体制备步骤 1. Nisin抗性基因m'W的获取
根据pMG36e MCS处的酶切位点，结合Genbank已报道的m、/的碱基序列(登录号 X76884),设计特异性引物，在上游引入JKaI位点，下游引入尸Wl位点，以pLEB590为模 板进行PCR扩增，引物序列如下
pi: 5'-AGA TCTAGA C AGG AGG GAA GAG GAA ATG AG-3'，下划线为位点(SEQ
ID NO:l);
p2: 5'-CGT CTGCAG TTA GGATCC CTA GTT TCC TAC-3'，下划线为尸M位点(SEQ ID NO:2)。
PCR反应体系如下
1 OxEx — Buffer ( Mg2+ Plus ) 5ul; dNTP(each 2.5mM) 4ul; 上游引物(20uM) lul; 下游引物(20uM) lul;pLEB590 (40ng/ul) M; Ex T叫(5U/ml) 0.5ul; 双蒸水 37.5ul; 扩增参数如下94。C5min， 94°C 30 s， 58.5。C30s， 72°C 1 min， 30 cycles, 72。C最后延 伸10min。
2. 的PCR产物及酶切产物的纯化
将PCR产物切胶回收，使用Promega胶回收试剂盒进行纯化。将纯化后的PCR片段用 Jftal+尸M进行分步双酶切，酶切产物直接使用TaKaRa DNA fragment purification kit进行纯化。
3. 重组质粒pMG36e-NisI的构建
将经双酶切处理并纯化的w's/片段与经相同处理的pMG36e在T4 DNA连接酶的作用下 16。C连接过夜(连接体系总体积10ul， "^/片段pMG36e片段的比控制在0.3pmol:0.03pmol); 取连接液10ul 42。C热激转化至100ul感受态￡.co" XL-Blue中(感受态的制备采用CaCV法)， 然后涂布在含有红霉素(终作用浓度为250ug/ml)的LB平板上培养16h左右，挑取单克隆 到含有红霉素(终作用浓度为250ug/ml)的液体LB过夜培养，以提取质粒进行酶切鉴定(质 粒提取采用TaKaRa质粒小量提取试剂盒)。将经鉴定为阳性的重组子pMG36e-NisI送上海 Invitrogen公司测序，测序结果与NCBI数据库进行比对，其匹配率为100%。
4. Nisin抗性脂蛋白NisI在MG1363中的表达
将1 2ul质粒pMG3636e-NisI (约50ng/ul)与40ul感受态MG1363置于预冷的电击杯 中10min，设置电转参数如下电压2000 V (场强为10KV/cm)，电容25 uF，电阻200 12。 电转完成后(实际脉冲电压约1980V，实际脉冲时间4.7 5ms);立即加入复苏培养基冰置 10min，然后3(TC复苏培养1 2 h后，将其涂布在含有终质量浓度为20 60 IU Nisin/ml的 GM17平板上，培养3d左右，挑取单克隆至含终作用浓度为20 IU Nisin/ml的GM17液体培 养基中，同时，以空载宿主菌MG1363及MG1363/pMG36e作为对照。过夜培养后，提取质 粒进行酶切鉴定。结果重组菌MG1363/pMG36e-NisI能在20 IU Nisin/ml的GM17液体培养 基中正常生长，但空载宿主菌MG1363及MG1363/pMG36e在20 IU Nisin/ml的GM17液体 培养基中生长受到抑制。由此说明，编码Nisin抗性脂蛋白Nisi的基因w's/在MG1363中获 得了表达并赋予了宿主菌MG1363对Nisin的抗性。
5. MG1363感受态的制备方法如下
①取-80。C库存的MG1363 50ul至5ml G-SGM17中30。C静置培养12 16小时；② 将上述培养物5ml转接至50ml G-SGM17中3(TC静置培养约10小时；
③ 将上述培养物50ml转接至400ml G-SGM17中30。C静置培养3小时左右，其OD600=0.35;
④ 收集菌体，4°C， 4000r/min， 20min;
用400ml预冷的洗液I重悬沉淀，4°C， 4000r/min， 20min，去上清；
⑥ 冰浴15min;
⑦ 用200ml预冷的洗液II重悬沉淀，4'C， 4000r/min， 20min，去上清；
⑧ 用100ml预冷的洗液I重悬沉淀，4'C， 4000r/min， 20min，去上清； (D将沉淀重悬于5ml预冷的洗液I;
⑩冰上分装至己灭菌的1.5mlEppendorf管中，每管40ul， -80匸库存备用。 6.红霉素抗性基因Emr的敲除
根据pMG36e及编码红霉素抗性基因的碱基序列，设计特异性引物(p3: 5'-TAC GTC GAT CGA ATT CGG TCC T-3'，下划线为五coi /位点，p4: 5'-CGC GAATTCATG CAT AAACTG CAT CCCTTA-3'，下划线为五coi /位点，p3序列如SEQ ID N0:3所示，p4序列如SEQ ID N0:4 所示)，扩增出pMG36e-NisI中除红霉素抗性基因以外的片段，命名为pMG36N。
PCR反应体系如下
5xPrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus) 10ul;
dNTP(each 2.5 mM) 4ul;
上游引物p3 (20uM) lul;
下游引物p4 (20uM) lul;
pMG36e-NisI(40ng/ul) lul;
PrimeSTAR HS DNA polymerase(2.5U/ml) 0.5ul;
双蒸水 32.5ul;
扩增参数如下94。C5min， 94。C30s， 58.2。C30s， 72°C 3 min， 30 cycles, 72。C最后延 伸10min。
将此PCR产物切胶回收，使用Promega胶回收试剂盒进行纯化，将纯化后的PCR片段 用五coRI进行酶切，酶切产物直接使用TaKaRa DNA fragment purification kit进行上柱纯化， 取纯化产物(纯化产物的浓度约60 90ng/ul) 5ul，加入5ul Solution I (此为TaKaRa T载体 试剂盒当中的成分)，16。C连接过夜；连接液经乙醇沉淀处理后电转化至感受态MG1363中， 电转参数为电压2000 V，电容25uF，电阻200fi。 30。C复苏培养1 2 h后，将其涂布在含 有终作用浓度为20 60IUNisin/ml的GM17平板上，培养3d，挑取单克隆至含终作用浓度为20 IU Nisin/ml的GM17液体培养基中，培养30小时左右其培养液混浊，提取质粒pMG36N 进行PCR鉴定如下
① 以pl和p2为引物，以pMG36N为模板，结果能成功扩增出目的大小的片段，将此片 段送上海Invitrogen公司测序，测序结果与NCBI数据库进行比对，其匹配率为100%;
② 以p3和p4为引物，以pMG36N为模板，结果能成功扩增出3.4Kb大小的片段，比 pMG36e-NisI (4.4Kb)小1Kb，而编码红霉素抗性基因的大小近1Kb，由此可知pMG36N中 已不含有编码红霉素抗性基因的片段。
③ 生理上作进一步鉴定按2%的接种量转接至含红霉素(终作用浓度为10ug/ml)的液 体GM17中进行复检，培养两周以上，结果其培养液没有变化，处于澄清状态。
由此说明，pMG36e中的红霉素抗性基因已成功敲除。一种乳酸菌食品级表达载体pMG36N及其制备方法 SEQUENCE LISTING
<110〉 华南理工大学
<120〉 一种乳酸菌食品级表达载体pMG36N及其制备方法
<130>
<160〉 4
<170〉 Patentln version 3. 2
〈210〉 1
〈211〉 30
<212> DNA
〈213〉 人工序列
<■〉 1
agatctagac aggagggaag aggaaatgag 30
<210> 2
<211〉 30
<212〉 DNA
<213> 人工序列
<400〉 2
cgtctgcagt taggatccct agtttcctac 30
<210> 3
〈211〉 22
<212〉 腿
<213〉 人工序列
<400〉 3
tacgt.cgatc gaattcggtc ct 22
<210〉 4
〈211> 30
<212> DNA
<213〉 人工序列
〈400> 4
cgcgaattca tgcataaact gcatccctta 30
权利要求
1.一种乳酸菌食品级表达载体pMG36N，其特征在于该表达载体是通过改造乳酸菌表达载体pMG36e得到的，所述改造是将乳酸菌表达载体pMG36e中的红霉素抗性基因敲除，引入乳链菌肽Nisin抗性基因nisI片段。
2. 如权利要求1所述的乳酸菌食品级表达载体pMG36N，其特征在于所述编码脂蛋白 Nisi的w's/碱基序列来源于产Nisin的乳酸菌。
3. 权利要求1所述乳酸菌食品级表达载体pMG36N的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1) 设计引物pl和p2，以pLEB590为模板，扩增出编码脂蛋白NisI的m's/片段，其 中，pl序列如SEQ ID NO:l所示，p2序列如SEQ ID NO:2所示；(2) 将mi/片段纯化后，进行双酶切；(3) 经双酶切后的m's/片段与经相同酶切处理的pMG36e在DNA连接酶的作用下进行 连接，连接液热激转化至大肠杆菌感受态；(4) 取转化菌液涂布在含红霉素的平板上，37'C培养后，挑单克隆至含红霉素的液体培 养基中培养，提取质粒进行酶切鉴定、测序，将阳性重组子命名为pMG36e-NisI;(5) 将pMG36e-NisI转化至MG1363中，然后将转化菌液涂布在含Nisin的平板上，30°C 培养，挑单克隆至含Nisin的液体培养基中培养，提取质粒进行酶切鉴定；(6) 设计引物p3和p4,扩增出pMG36e-NisI中除红霉素基因以外的片段，此片段即为 pMG36N，其中，p3序列如SEQIDNO:3所示，p4序列如SEQ ID NO:4所示。
4. 如权利要求3所述乳酸菌食品级表达载体pMG36N的制备方法，其特征在于包括如下 步骤(1) 设计引物pl和p2，以pLEB590为模板，扩增出编码脂蛋白NisI的^/片段，其 中，pl序列如SEQ ID NO:l所示，p2序列如SEQ ID NO:2所示；(2) 将片段进行纯化后，用Ja"l+i^1进行双酶切；(3) 经双酶切后的m's/片段与经相同酶切处理的pMG36e在T4 DNA连接酶的作用下进 行连接，连接液热激转化至五.co/z'XL-Blue的感受态；(4) 取转化菌液40ul涂布在含红霉素的LB平板上，37t:培养16小时后，挑单克隆至 含红霉素的液体LB中过夜培养，提取质粒进行酶切鉴定、测序，将阳性重组子命名为 pMG36e-NisI;(5) 将pMG36e-NisI电转化至MG1363中，然后将电转化菌液涂布在含Nisin的GM17平板上，3(TC培养3天，挑单克隆至含Nisin的液体GM17中3(TC静置过夜培养，提取质粒 进行酶切鉴定；(6) 设计引物p3和p4扩增出pMG36e-NisI中除红霉素基因以外的片段，此片段即为 pMG36N，其中，p3序列如SEQ ID NO:3所示，p4序列如SEQ ID NO:4所示；(7) 将pMG36N的PCR产物进行纯化后，用五coRI进行酶切处理；(8) 将上述酶切产物进行纯化，然后等体积加入T载体试剂盒中的Solution I， 16。C让 其自连过夜；(9) 将连接液电转化至MG1363中，然后将电转化菌液涂布在含Nisin的GM17平板上， 3(TC培养3天左右，挑单克隆至含Nisin的液体GM17中，3(TC静置过夜培养，提取质粒进 行鉴定，并将菌液转接至含红霉素的液体GM17中进行复检。
5. 如权利要求3或4所述乳酸菌食品级表达载体pMG36N的制备方法，其特征在于所述 步骤(1)中，pl引入^bfll位点，p2引入/VI位点。
6. 如权利要求3或4所述乳酸菌食品级表达载体pMG36N的制备方法，其特征在于所述 步骤(6 )中，p3和p4的上游和下游均引入五coRI位点。
全文摘要
本发明公开了一种乳酸菌食品级表达载体pMG36N。该乳酸菌食品级表达载体不含红霉素抗性基因，并引入了天然食品防腐剂乳链菌肽Nisin抗性基因nisI，以此作为选择标记。本发明还公开了上述乳酸菌食品级表达载体pMG36N的制备方法。本发明乳酸菌食品级表达载体pMG36N不以红霉素等抗性基因作为筛选标记，提高了乳酸菌的安全性，可以用于食品生产。
文档编号C12N15/74GK101654681SQ20091019214
公开日2010年2月24日 申请日期2009年9月8日 优先权日2009年9月8日
发明者成 王, 罗立新 申请人:华南理工大学