专利名称：Wnt拮抗剂和治疗与筛选方法
技术领域：
本发明提供用于治疗癌症和其它与Wnt相关的疾病或病症的新型组合物和方法，以及用于鉴别其它新型治疗剂的新型筛选方法。具体来说，本发明提供包含用于治疗实体瘤和其它与Wnt相关的疾病和病况的可溶性受体蛋白质的Wnt拮抗剂。发明背景·癌症为发达国家中的一个主要死亡原因，仅在美国每年就有超过百万人被诊断罹患癌症且造成50万人死亡。总体而言，据估计每3人中超过I人在其一生中会患上出某种形式的癌症。癌症有超过200种不同的类型，其中四种乳癌、肺癌、大肠直肠癌和前列腺癌占了新病例的一半以上(Jemal 等，2009，Cancer J. Clin.，58:225-249)。Wnt信号传递途径已被鉴别为癌症疗法的潜在标靶。Wnt信号传递途径是胚胎模式形成、胚胎后期组织维护和干细胞生物学的数种关键调节因子之一。更具体来说，Wnt信号传递在产生细胞极性和细胞命运特化(包括干细胞群的自我更新)上扮演重要角色。Wnt途径的不受控管地活化与许多人类癌症有关，癌症中肿瘤细胞的命运发展可被改变以维持其未分化和增生状态。因此，癌变可通过夺取控制正常发展的恒定机制和由干细胞进行的组织修复来进行(综述在Reya & Clevers, 2005, Nature, 434:843-50; Beachy等，2004，Nature, 432:324-31 中)。Wnt信号传递途径首先是在发展突变体无翅(wg)果蝇和小鼠原癌基因int-Ι (现在称为 Wntl)中阐明(Nusse & Varmus, 1982, Cell, 31:99-109 ；Van Ooyen& Nusse, 1984, Cel1,39:233-40 ；Cabrera 等,1987, Cel1,50:659-63 ；Rijsewijk等，1987，Cell, 50:649-57)。Wnt基因编码分泌型脂质修饰的糖蛋白，其中19种已在哺乳动物中鉴别出。这些分泌型配体活化由Frizzled(FZD)受体家族成员和低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白5或6(LRPS/6)所组成的受体复治物。所述FZD受体为G-蛋白偶联受体(GPCR)超家族的七次跨膜结构域蛋白并且含有一个大胞外N端配体结合域，此结合域具有10个经过保留的半胱氨酸，称为富含半胱氨酸的结构域(CRD)或Fri结构域。有十种人FZD受体，FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9 和 FZDlO。不同 FZD CRD 对特殊 Wnt 具有不同的结合亲和力(Wu & Nusse 2002，J. Biol. Chem.，277:41762-9)，并且 FZD受体已被分类成下述活化典型β_连锁蛋白(β-catenin)途径的受体和活化非典型途径的受体(Miller等，1999，Oncogene, 18:7860-72)。为了形成与FZD配体结合的受体复合物，FZD 受体与 LRP5/6,单次跨膜蛋白(single-pass transmembrane protein)(具有四个胞外EGF样结构域，由6个YWTD氨基酸重复子分隔)交互作用(Johnson等，2004, J. BoneMineral Res.，19:1749)。
受体结合时典型Wnt信号传递途径被活化是通过胞衆蛋白Dishevelled(Dsh)直接与FZD受体交互作用介导，此可使细胞质稳定和β-连锁蛋白积累。无Wnt信号时，β-连锁蛋白是局部位于包含肿瘤抑制蛋白腺瘤结肠息肉(APC)和Axin的细胞质破坏复合物中。这些蛋白质作为关键支架以允许糖原合成酶激酶3 β (GSK3i3)结合β-连锁蛋白并将其磷酸化，且将其标记以经由泛素/蛋白酶体途径降解。Dsh活化造成GSK3 0磷酸化以及所述破坏复合物的分解。然后，累积的细胞质β -连锁蛋白被转运到细胞核，在此处与TGF/LEF族的DNA结合蛋白交互作用来活化转录作用。
除了典型的信号传递途径外，Wnt配体还活化β -连锁蛋白依赖性途径(Veeman等，2003，Dev. Cell，5:367-77)。非典型的Wnt信号传递涉及多种过程，但最令人信服的为经由类似于果蝇平面细胞极性(PCP)途径的机制牵涉原肠运动。其它潜在的非典型的fct信号传递机制包括钙流、JNK以及小G蛋白和异三聚体G蛋白两者。拮抗性通常可在典型和非典型途径之间观察到，而且有证据指出非典型的信号传递可遏制癌细胞形成(Olson& Gibo, 1998 Exp. Cell Res.，241:134; Topol 等，2003. J. Cell Biol. , 162:899-908) 因此，在某些情况下，FZD受体是作为典型的Wnt信号传递途径的负向调节子。例如，当与FZDl共同表达时，FZD6经由TAKl-NLK途径压制经过Wnt3a诱导的典型信号传递(Golan等，2004, JBC279:14879-88)。类似地，FZD2 显示出在 Wnt5a 的存在下经由 TAKl-NLK MAPK级联反应拮抗典型的 Wnt 信号传递(Ishitani 等，2003，Mol. Cell. Biol.，23:131-39)。典型的Wnt信号传递途径也在维持小肠和大肠干细胞群中扮演核心角色，所述途径的不适当活化在大肠直肠癌中扮演重要角色(Reya & Clevers, 2005，Nature, 434:843)。小肠的吸收上皮细胞是排列成绒毛和腺窝。干细胞存在于腺窝中，慢慢地分裂以产生快速增殖细胞，使迁出腺窝的所有分化的细胞群占据小肠绒毛。fct信号传递的级联反应在控制沿着腺窝-绒毛轴的细胞命运中具有主导作用，对维持干细胞群是必要的。经由同源重组遗传性丧失TCF7/2(Korinek 等，1998, Nat. Genet.，19:379)或过度表达Dickkopf-I (Dkkl)(一种强力的分泌型 Wnt 拮抗剂)(Pinto 等,2003, Genes Dev. , 17:1709-13; Kuhnert等，2004，PNAS, 101:266-71)来破坏Wnt信号传递会造成小肠干细胞群体竭尽。Wnt信号传递在癌症中的角色首先是由确定Wntl(原先为inti)为乳腺肿瘤中的致癌基因而被揭露，所述乳腺肿瘤是经由在附近插入小鼠病毒转化而成(Nusse&Varmus, 1982, Cell 31:99-109)。至今已累积更多Wnt信号传递在乳癌中的角色的证据。例如连锁蛋白转殖基因在乳腺中过度表达造成过度增生及腺癌(Imbert等，2001，J.Cell Biol. 153:555-68;Michaelson & Leder, 2001, Oncogene, 20:5093-9),然而丧失 Wnt信号传递会扰乱正常的乳腺发育(T印era等，2003, J. Cell Sci.，116:1137-49;Hatsell等，2003, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia 8:145-58)。最近，乳腺干细胞已被证明是由Wnt信号传递活化(Liu等，2004，PNAS, 101:4158-4163)。在人类乳癌中，β-连锁蛋白的积累涉及超过50%的癌症中的Wnt信号传递活化，虽然并未鉴别出特定的基因突变，但观察到 Frizzled 受体表达上调(Brennan & Brown, 2004, J. Mammary GlandNeoplasia, 9:119-31;Malovanovic 等,2004, Int. J. Oncol, 25:1337-42)。结肠直肠癌最常经由活化Wnt信号传递级联反应中的突变起动。全部结肠直肠癌中约有5-10%为遗传性，主要形式之一为家族性腺瘤性息肉病(FAP)，此为一种体染色体显性遗传疾病，其中约80%受影响的受试者中的腺瘤样息肉(APC)基因含有胚系突变。其它fct途径组分(包括Axin和β-连锁蛋白)中也被鉴别出突变。个别腺瘤为含有第二个去活化的等位基因的上皮细胞无性繁殖瘤，而大量FAP腺瘤透过致癌基因和/或肿瘤抑制基因的额外突变不可避免地造成腺癌发展。再者，fct信号传递途径活化(包括APC和β -连锁蛋白中的功能获得突变(gain-of-function mutation))可在小鼠模型中诱导增生发展和肿瘤生长(Oshima 等，1997，Cancer Res, 57:1644-9; Harada 等，1999，EMBO J.，18:5931-42)。发明概述本发明提供多种结合一种或多种人Wnt蛋白的药剂(包括但不限于可溶性FZD受体和其它包含Fri结构域的药剂)，以及使用那些药剂的新方法。本发明进一步提供通过向有需要的受试者施用所述药剂的使用所述药剂来治疗癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括抑制癌细胞生长。在某些实施方案中，所述fct结合剂为一种Wnt拮抗剂。本发明也提供筛选这类fct结合剂的新方法。同样地，本发明提供编码所述药剂的多核苷酸、 制造所述药剂的方法，以及各种包含所述药剂的组合物。因此，在一个方面中，本发明提供一种抑制肿瘤生长的方法。在某些实施方案中，所述方法包含将肿瘤与有效量的结合一种或多种Wnt蛋白(例如，人Wnt蛋白)的药剂接触。所述方法可在体内或体外进行。在某些实施方案中，所述肿瘤是在受试者中，而肿瘤与药剂的接触包含向受试者施用治疗有效量的Wnt结合剂。在另一方面中，本发明提供降低包含癌干细胞的肿瘤中的癌干细胞发生频率的方法。因此，本发明也提供降低肿瘤的致瘤性的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将肿瘤与有效量的结合一种或多种Wnt蛋白(例如，人Wnt蛋白)的药剂接触。所述方法可在活体内或体外进行。例如所述接触可包含向具有肿瘤的人类施用有效量的fct结合剂。在另一方面中，本发明提供诱导肿瘤中的细胞分化，或诱导肿瘤中的分化标记表达的方法。在某些实施方案中，所述方法包括将肿瘤与有效量的结合一种或多种fct蛋白(例如，人fct蛋白)的药剂接触。所述方法可在体内或体外进行。再在另一方面中，本发明提供治疗受试者中的癌症的方法，其包含向受试者施用治疗有效量的Wnt结合剂。在另一方面中，本发明提供治疗受试者内的疾病的方法，其中所述疾病与Wnt信号传递活化相关，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的fct结合剂。在另一方面中，本发明提供治疗受试者中的病症的方法，其中所述病症的特征为干细胞和/或祖细胞的水平提高，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的Wnt结合剂。在本文提供的上述方面以及其它方面中每一方面的某些实施方案中，所述Wnt结合剂为一种多肽。在某些实施方案中，所述药剂为一种可溶性受体。在本文提供的上述方面以及其它方面中每一方面的某些实施方案中，所述药剂包含结合一种或多种Wnt蛋白的FZD受体的Fri结构域，或FZD Fri结构域的片段。在某些实施方案中，所述FZD受体为人FZD受体。例如，所述Fri结构域可能来自一人FZD4或人FZD5。在某些替代实施方案中，所述药剂为可包含结合一种或多种Wnt蛋白的人FZD8受体的Fri结构域或所述Fri结构域的片段。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂为一种可溶性FZD受体。在替代实施方案中，所述Wnt结合剂不包含FZD受体的Fri结构域。在本文提供的上述方面以及其它方面中每一方面的某些实施方案中，所述药剂包含结合一种或多Wnt蛋白的可溶性Frizzled相关蛋白(SFRP)的结构域,或SFRP Fri结构域的片段。在某些实施方案中，所述SFRP为人SFRP。在本文提供的上述方面以及其它方面中每一方面的某些实施方案中，所述药剂包含结合一种或多种Wnt蛋白的Ror蛋白的Fri结构域,或Ror Fri结构域的片段。在某些实施方案中，所述Ror蛋白为人Ror蛋白。在本文提供的上述方面以及其它方面中每一方面的某些实施方案中，所述药剂进一步包含人Fe区。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂为一种融合蛋白。在某些实施方案中，所述fct结合剂包含SEQ ID NO: I。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含SEQ IDNO: 46。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含SEQ ID NO: 48。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含SEQ ID NO: 50。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含SEQ ID NO: 53。在一些实施方案中，所述fct结合剂(信号序列裂解前)包含SEQ ID NO: 50和选自以下组成的组的信号序列SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73 和 SEQ ID NO: 74。在一些实施方案中，所述 Wnt 结合齐U(信号序列裂解前)包含SEQID NO:50和选自以下组成的组的信号序列SEQ ID NO:70,SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73 和 SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂(信号序列裂解前)包含SEQ ID N0:50和SEQ ID N0:71。在一些实施方案中，所述fct结合剂(信号序列裂解前)包含SEQ ID NO: 53和选自以下组成的组的信号序列SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:69,SEQ ID NO:70,SEQ ID N0:7USEQ ID NO:72,SEQ ID N0:73和SEQ ID N0:74。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂(信号序列裂解前)包含SEQ ID NO: 53和选自以下组成的组的信号序列SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ IDNO:72, SEQ ID N0:73和SEQ ID N0:74。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂(信号序列裂解前)包含 SEQ ID NO:53 和 SEQ ID NO:71。在本文提供的上述方面以及其它方面中每一方面的某些实施方案中，所述Wnt结·合剂结合一种或多种、两或更多种、三种或更多种、或四种或更多种选自由以下组成的组的人Wnt 蛋白Wntl、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wntl0a和 WntlOb。在某些实施方案中，所述药剂结合fctl、Wnt2、Wnt3、Wnt3a和Wnt7b。在本文提供的上述方面以及其它方面中每一方面的某些实施方案中，所述药剂为fct拮抗剂。在某些实施方案中，所述药剂抑制Wnt信号传递。在某些实施方案中，所述药剂抑制Wnt典型的Wnt信号传递。在本文提供的上述方面以及其它方面中每一方面的某些实施方案中，所述肿瘤或癌症为选自由以下组成的组的肿瘤/癌症结肠直肠肿瘤/癌症、胰脏肿瘤/癌症、肺肿瘤/癌症、卵巢肿瘤/癌症、肝肿瘤/癌症、乳房肿瘤/癌症、肾脏肿瘤/癌症、前列腺肿瘤/癌症、胃肠瘤/癌症、黑素瘤、子宫颈肿瘤/癌症、膀胱肿瘤/癌症、胶质母细胞瘤和头颈部肿
瘤/癌症。在本文提供的上述方面以及其它方面中每一方面的某些实施方案中，所述方法进一步包括将肿瘤与第二治疗剂接触，或向受试者施用第二治疗剂。在某些实施方案中，所述第二治疗剂为一种化学治疗剂。在某些实施方案中，所述第二化学治疗剂为一种抗代谢物(例如，吉西他滨(gemcitabine))或抗有丝分裂剂(例如,紫杉烧,诸如太平洋紫杉醇)。在另一方面中，本发明提供包含选自由以下组成的组的序列的多肽SEQ IDNO:I、SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49,SEQ IDNO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:65 和 SEQID NO:66，以及制造多肽的细胞和包含所述多肽的组合物。还提供包含所述多肽和药学上可接受的载体的药物组合物。此外，本发明还提供包含编码以下的多肽的多核苷酸的多核苷酸SEQ ID NO: I、SEQ ID NO:45、SEQ ID N0:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID N0:48、SEQ IDNO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55,SEQ IDNO:65和SEQ ID NO:66，或具有SEQ ID NO:2的序列的多肽。本发明同样提供包含所述多核苷酸的载体和细胞。在另一方面，本发明提供筛选药剂的抗肿瘤活性和/或抗癌干细胞之活性的方法。在某些实施方案中，所述方法包括将已暴露于一种药剂的第一实体肿瘤(例如，一种包含癌干细胞的实体肿瘤)中的一种或多种分化标记和/或一种或多种干细胞性标记的水平与尚未暴露于所述药剂的第二实体肿瘤中的一种或多种分化标记的水平相比较。在一些实施方案中，所述方法包括(a)使第一实体肿瘤暴露于所述药剂，但第二实体肿瘤则不暴露；(b)评估在第一和第二实体肿瘤中的一种或多种分化标记和/或一种或多种干细胞性标记的水平 '及(C)将第一实体肿瘤中的一种或多种分化标记的水平与第二实体肿瘤中的一种或多种分化标记的水平相比较。在某些实施方案中，(a)所述第一实体肿瘤中的一种或多种分化标记相对于所述第二实体肿瘤所增加的水平表示所述药剂的抗肿瘤或抗癌干细胞活性；和/或(b)所述一种或多种干细胞标记相对于所述第二实体肿瘤所降低的水平表示所述药剂的抗肿瘤或抗癌干细胞活性。在某些实施方案中，所述药剂结合一种或多种fct蛋白。在某些实施方案中，所述药剂为可溶性FZD受体。在某些替代实施方案中，所述药剂为一种抗体，诸如抗FZD或抗Wnt杭体。在某些替代实施方案中，所述药剂为小分子。根据马库西(Markush)组或其它替代分组法描述本发明的观点或实施方案时，本发明不仅包含作为一个整体的上列全部组，还单独地包含所述组的各成员以及所述主要组的所有可能的子组，还有缺少一个或多个组成员的主要组。本发明也设想明确排除一个或多个本发明要求保护的任何组的成员。附图简述图I.大鼠中的FZD8-Fc(54R)3)的药物动力学。施用单剂量(10mg/kg)的FZD8_Fc后评估FZDS-Fc的药物动力学性质。在施用后1、24、48、72、96、168、240和336小时测定FZD8-FC的血清浓度。图2.通过FZD8-FC (54F03)治疗来抑制PM胰脏肿瘤增长。将PM胰脏肿瘤细胞皮下注射到N0D/SCID小鼠中。用FZD8-FC (- ▲ _)、吉西他滨(_■_)、FZD8_Fc与吉西他滨的组合(-▲_)或对照抗体(-·_)治疗小鼠。显示的数据为治疗后几天的肿瘤体积(mm3) ο图3.用FZD8-FC (54F03)治疗后PM肿瘤中的CD44hi细胞群体减少。将用对照抗体、FZD8-FC、吉西他滨或FZD8-FC与吉西他滨的组合治疗的肿瘤细胞表面染色来检测ESA和⑶44。对每一治疗组来说，在染色前汇集来自五个肿瘤的单一细胞混悬液。图4.经过FZD8-FC (54F03)治疗的PM胰脏肿瘤的体内限数稀释分析。图5.用FZD8-FC (54R)3)治疗的PM胰脏肿瘤中细胞分化增加。用阿尔新蓝(alcian blue)将经过对照抗体、FZD8_Fc、吉西他滨或FZD8_Fc与吉西他滨的组合治疗的PM肿瘤的石蜡切片染色以便检测表达粘蛋白的细胞。
图6.用FZD8-Fc (54F03)治疗的PN8胰脏肿瘤中细胞分化增加。用阿尔新蓝将经过对照抗体、FZD8-FC、吉西他滨或FZD8-FC与吉西他滨的组合治疗的PN8肿瘤的石蜡切片染色以便检测表达粘蛋白的细胞。图7.用FZD8-Fc (54R)3)治疗后PN13胰脏肿瘤中细胞分化增加而增殖减少。用阿尔新蓝将经过对照抗体或FZD8-FC治疗的PN13肿瘤的石蜡切片染色以便检测表达粘蛋白的细胞。此外，将切片染色以检测Ki67( —种活跃地增殖细胞的标记)。图8.用FZD8-Fc (54F03)治疗后PN13胰脏肿瘤中Muc 16染色增加。将经过对照抗体或FZD8-FC治疗的PN13肿瘤的石蜡切片染色以便检测Mucl6蛋白。图9.用FZD8-FC (54F03)治疗后PN13胰脏肿瘤中CK20染色增加。将经过对照抗体或FZD8-FC治疗的PN13肿瘤的石蜡切片染色以便检测CK20蛋白。
图10.以用FZD8-FC (54R)3)与太平洋紫杉醇的组合治疗后PE13乳房肿瘤生 长受抑制。将PE13乳房肿瘤细胞皮下注射到N0D/SCID小鼠中。用对照抗体(_籲_)、FZD8-FC (- ·-)、太平洋紫杉醇(-▲_)* FZD8-FC与太平洋紫杉醇的组合(_ O _)治疗小鼠。数据显示治疗后几天的肿瘤体积(mm3)。图11. FZD8-Fc (54F03)以剂量依赖方式抑制C28结肠肿瘤生长。将C28结肠肿瘤细胞皮下注射到N0D/SCID小鼠中。用FZD8-Fc I. 5mg/kg,每周两次(-▲ -)，5mg/kg，每周一次(-▼-)，5mg/kg,每周两次(-〇_), 15mg/kg,每周一次(_ □ _)或15mg/kg,每周两次(-Δ -)或对照抗体(_ ■-)治疗小鼠。数据显示治疗后数天的肿瘤体积(_3)(图11A)。用FZD8-Fc与伊立替康(irinotecan)的组合抑制结肠肿瘤生长。用FZD8_Fc (-▲-)、依立替康(-▼-)..FZDS-Fc与依立替康的组合(_ ·-)或对照抗体(_ ■-)治疗小鼠。数据显示治疗后数天的肿瘤体积(mm3)(图I IB)。图12用FZD8-Fc (54F03)治疗后C28肿瘤中CK20染色增加。将经过对照抗体或FZD8-FC治疗的C28肿瘤的石蜡切片染色以便检测CK20蛋白。图13.用FZD8-FC (54F03)治疗后PN21胰脏肿瘤生长受抑制并且癌干细胞发生频率降低。将PN21胰脏肿瘤细胞皮下注射到N0D/SCID小鼠中。用FZD8_Fc (-▼-)、吉西他滨(-▲ -)、FZDS-Fc与吉西他滨的组合(_ ■-)或对照抗体(_ ·-)治疗小鼠。数据显示治疗后数天的肿瘤体积(mm3)(图13A)。经过FZD8_Fc治疗的PN21胰脏肿瘤的体内限数稀释分析(图13B)。图14.用FZD8-FC (54F03)治疗后PN21胰脏肿瘤中细胞分化增加。用阿尔新蓝将经过对照抗体或FZD8-FC治疗的PN21肿瘤的石蜡切片染色以便检测粘蛋白。图15.用FZD8-Fc (54F03)治疗后PN21胰脏肿瘤中细胞分化增加而增殖减少。用阿尔新蓝将经过对照抗体、FZD8-FC、吉西他滨或FZD8-FC与吉西他滨的组合治疗的PN21肿瘤的石蜡切片染色以便检测粘蛋白。此外，将切片染色以检测Ki67 (—种活跃地增殖细胞的标记)。图16.猴体内FZD8-FC变异体的药物动力学。施用单一剂量(30mg/kg)的FZD8_Fc变异体54F15和54F16后评估变异体的药物动力学性质。在施用后的1、6、12、24、48、72、96,168,240 和 336 小时测定 54F15(- O -)和 54F16 (- -)的血清浓度。图17.用FZD8-FC变异体治疗后C28结肠肿瘤生长的抑制情形。将C28结肠肿瘤细胞皮下注射到N0D/SCID小鼠中。用对照抗体(-X-)、54F03(-□ -)、54F09 (-▲-)、54F12 {-▼-)、54F13 (- -)、54F15 (-〇-)或54F16(_A_)治疗小鼠。显示的数据为治疗后数天的肿瘤体积(mm3)。图18.用FZD8-FC变异体治疗后PM胰脏肿瘤生长受抑制。将PM胰脏肿瘤细胞皮下注射到 N0D/SCID 小鼠中。用对照抗体(-· -)、54F03 (- ■ -)、54F09卜▼-)、54F12 (-〇-)、54F13(-▲-)、54F15(-□-)或54F16 (- -)治疗小鼠。显示的数据为治疗后数天的肿瘤体积(mm3) ο图19.用 FZD8-Fc 变异体 54F03 和 54F16 治疗后 PM 肿瘤中 CD44hi 和 CD44+CD201+细胞减少。将用对照抗体、FZD8-FC变异体54F03或变异体54F16治疗的肿瘤细胞表面染色以便检测ESA、⑶44和⑶201并通过FACS分析。图20. FZD8-FC蛋白的N端特征。通过质谱仪分析FZD8-FC变异体并显示54F16 (图20A)、54F26 (图 20B)、54F28 (图 20C)、54F30 (图 20D)以及 54F32 (图 20E)的结果。
图21.用FZD8-FC变异体治疗后C28结肠肿瘤生长的抑制情形。将C28结肠肿瘤细胞皮下注射到N0D/SCID小鼠中。用对照抗体(-■ -)、54F03(- Δ -)、54F23 (-▼-)*54F26 (- O -)治疗小鼠。显示的数据为治疗后数天的肿瘤体积(mm3)。发明详述本发明提供新型药剂，包括但不限于结合一种或多种人Wnts的包含人Frizzled(FZD)受体的Fri结构域、人分泌型Frizzled相关蛋白(SFRPs),或Ror蛋白质的多肽。本发明还提供包含所述fct结合剂的相关多肽和多核苷酸、组合物以及制备Wnt结合剂的方法。本发明进一步提供使用fct结合剂的方法，诸如抑制肿瘤生长、治疗癌症、诱导分化以及减少致瘤性的方法。本发明也提供筛选用于鉴别具有抗肿瘤活性和/或抗癌干细胞的活性的新型Wnt结合剂药剂的方法。制造包含人FZD8的Fri结构域及Fe结构域的Wnt结合剂，本文中称为FZD8-FC或FZD8-FC (54R)3)(实施例I)。产生多种FZD8-FC蛋白的变异体(实施例10)。制造显示出N端具有约95%或更高的同源性的FZD8-FC蛋白(实施例16)。使用数种FZD8-FC变异体在显示出FZD8-FC变异体的半衰期至少为100小时的大鼠中进行药物动力学研究(实施例2和实施例12 ;图I和表4)。以FZD8-FC变异体54F15及54F16在猴子体内进行药物动力学研究，其证明这些蛋白质具有至少100个小时的半衰期(实施例13和表5)。以单独的FZD8-Fc (54F03)或FZD8_Fc与化学治疗剂的组合治疗时显示出可减少胰脏肿瘤、乳房肿瘤和结肠肿瘤的生长(实施例3、5、6和8和图2、10、11B和13A)。此外，治疗显示出可减少胰脏模型中的CD44+细胞的百分比并降低癌干细胞的发生频率(实施例3和实施例8以及图3、4和13B)。以单独的FZD8-Fc(54R)3)或FZD8-FC与化学治疗剂的组合治疗时显示出可增加胰脏肿瘤细胞及结肠肿瘤细胞的细胞分化(实施例4、7和9及图5-9、12、14和15)。以FZD8-FC变异体治疗时显示出可抑制结肠及胰脏肿瘤生长，抑制程度是取决在该变异体(实施例14、15和17及图17、18和21)。以FZD8-FC变异体54F03和变异体54F16治疗时显示出可减少胰脏肿瘤中的⑶44hi细胞以及⑶44+CD202+细胞的百分比(实施例15及图19)。I.定义如本文所用的术语“拮抗剂”包括任何部分或完全阻断、抑制或中和蛋白质(例如癌干细胞标记)的表达或生物活性的分子。阻断、抑制或中和生物活性包括但不限于抑制肿瘤生长。术语“拮抗剂”包括任何部分或完全阻断、抑制或中和fct途径的生物活性的分子。合适的拮抗剂分子包括但不限于天然FZD受体蛋白(包括可溶性FZD受体以及SFRPs的衍生物和Ror蛋白质的衍生物)的片段和/或氨基酸序列变异体。“经过分离”的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物为处于自然界中不存在的形式中的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。经过分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括那些已被纯化到一定程度使其不再为可在自然界中发现的形式。在一些实施方案中，经过分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物为实质上纯的。如本文所用的术语“实质上纯的”是指一种物质，其至少为50%纯的(B卩，不含污染物)，优选至少为90%纯的，更优选至少为95%纯的，更优选至少为98%纯的，再更优选至少为99%纯的。如本文所用的术语“可溶性受体”是指在所述受体的第一跨膜结构域前的受体蛋白的N端胞外片段，其可以可溶性形式从细胞分泌出。在一些实施方案中，所述受体蛋白为一种FZD受体。在一些实施方案中，所述受体蛋白为一种Ror受体。·
如本文所用的术语“FZD可溶性受体”是指在所述受体的第一跨膜结构域前的人FZD受体蛋白的N端胞外片段，其可以可溶性形式从细胞分泌出。包含整个N端胞外结构域伍⑶)(此处称为“FZD E⑶”)以及较小片段的两种FZD可溶性受体均在设想范围内。此处还公开包含Fri结构域的FZD可溶性受体(本文称为“FZD Fri ”)。与包含整个FZD E⑶的可溶性受体相比较，FZD Fri可溶性受体可显示改变的生物活性(例如蛋白质半衰期增加)。蛋白质半衰期可经由以聚乙二醇(PEG)或聚氧化乙烯(PEO)共价修饰来进一步增加。FZD可溶性受体包括FZD E⑶或Fri结构域，其在框构内连接其它功能和结构蛋白，包括但不限于人Fe区(例如来自免疫球蛋白IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgD、IgE的或IgM的人Fe);蛋白标签(例如myc、FLAG、GST);其它内源性蛋白或蛋白片段；或任何其它有用的蛋白质序列，包括介于FZD ECD或Fri结构域与连接的蛋白质之间的任何连接子区。在某些实施方案中，FZD受体的Fri结构域是直接连接人Fe区。在某些实施方案中，所述FZD受体的Fri结构域是连接人IgGlFc (本文称为“FZD Fri. Fe")。在一些实施方案中，FZD受体的Fri结构域是以肽连接子连接人Fe区。FZD可溶性受体也包括含有氨基酸插入、缺失、取代和/或保存性取代的变异体蛋白。如本文所用的术语“连接子”或“连接子区”是指插入第一多肽(例如FZD组分)与第二多肽(例如Fe区)之间的连接子。在一些实施方案中，所述连接子为肽连接子。连接子不应对多肽的表达、分泌或生物活性有不利影响。优选地，连接子不具抗原性并且不引发免疫反应。如本文所用的术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的生理病状，其中细胞群体的特点为细胞生长不受管控。据了解，术语癌症包含fct依赖性癌症。癌症的实例包括但不限在癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。这类癌症更特别的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰脏癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝脏癌症、膀胱癌、肝癌、乳癌、大肠癌、结肠直肠癌、皮肤癌、黑素瘤、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝细胞癌症和各类头颈部癌。术语“增生症”和“增生性疾病”是指与异常细胞增殖相关的疾病，诸如癌症。如本文所用的术语“肿瘤”和“赘瘤”是指由过度细胞生长或增殖(无论是良性(非癌性)或恶性(癌性)，包括癌前病变)产生的任何组织团块。在某些实施方案中，所述肿瘤为一种上皮细胞肿瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤为一种fct依赖性肿瘤。如本文所用的术语“受试者”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、犬、猫、啮齿动物等为特定治疗的接受者。通常，术语“受试者”和“患者”在指人类受试者时可在本文中互换使用。如本文所用的术语“癌干细胞”和“CSC”和“肿瘤干细胞”以及“实体肿瘤干细胞”可互换使用并且是指来自以下的实体肿瘤的细胞群体(I)具有广大的增殖能力；(2)具有不对称细胞分裂的能力以产生一种或多种具有降低的细胞增殖或发展潜力的已分化后代；以及(3)具有自我更新或自我维护的对称细胞分裂的能力。与大多数无法形成肿瘤的肿瘤细胞相比较，这些“癌干细胞”、“CSCs”、“肿瘤干细胞”或“实体肿瘤干细胞”的性质赋予那些癌干细胞在系列移植入免疫功能低下的宿主(例如小鼠)中时形成可触知的肿瘤的能力。相对在以杂乱无章的方式分化，癌干细胞进行自我更新以当突变发生时形成具有可随时间改变的异常细胞类型的肿瘤。
“癌症细胞”和“肿瘤细胞”以及语法等义词是指源自肿瘤的总细胞群体，包括其中包含大量肿瘤细胞群体的非致瘤细胞和致瘤干细胞(本文也称为癌干细胞)。术语“致瘤的”是指实体肿瘤干细胞的功能特性，包括自我更新(产生额外的致瘤性癌干细胞)和增殖以产生所有其它可使实体肿瘤干细胞形成肿瘤的肿瘤细胞(引起分化，因而为非致瘤肿瘤细胞)等性质。与非致瘤性肿瘤细胞相比较(其在系列移植时无法形成肿瘤)，这些自我更新和增殖以生成所有其它肿瘤细胞的性质赋予癌干细胞在系列移植到免疫功能低下的宿主(例如小鼠)时形成可触知的肿瘤的能力。据观察，自实体肿瘤取得肿瘤细胞后，非致瘤性肿瘤细胞可在初次移植入免疫功能低下的宿主(例如，小鼠)时形成肿瘤，但那些非致瘤性肿瘤在系列移植时不会产生肿瘤。如本文所用的术语“可接受的药学载体”或“药学上可接受的载体”是指当与药物组合物的活性成分，诸如治疗性多肽结合时允许所述治疗性多肽(例如)保留其生物活性的任何物质。此外，“可接受的药学载体”不会引发接受的受试者的免疫反应。在一些实施方案中，“药学载剂”可与“药学载体”互换使用。实例包括但不限于任何标准的药学载体，诸如磷酸盐缓冲的盐溶液、水和各种油/水乳剂。用在气溶胶或胃肠道外施用的稀释剂的实例为磷酸盐缓冲的生理盐水或生理(0.9%)盐水。术语“治疗有效量”是指可有效“治疗”受试者或哺乳动物中的疾病或病症的药剂(例如，可溶性受体或其它药物)的量。在癌症的情况中，所述药剂(例如可溶性受体)的治疗有效量可减少癌症细胞的数量；降低肿瘤的大小；降低癌干细胞的发生频率；抑制和/或停止癌症细胞浸润到周围器官；抑制和/或停止肿瘤转移；抑制和/或停止肿瘤生长；和/或缓解一种或多种与癌症相关的症状至一定程度。所述药剂(例如，可溶性受体)防止现存癌细胞生长和/或杀死现存癌细胞的程度可称为抑制细胞生长和/或细胞毒性。如本文所用的术语“抑制肿瘤生长”是指任何可抑制肿瘤细胞生长的机制。在某些实施方案中，肿瘤细胞的生长是经由减缓肿瘤细胞增殖而受抑制。在某些实施方案中，肿瘤细胞的生长是经由停止肿瘤细胞增殖而受抑制。在某些实施方案中，肿瘤细胞的生长是经由杀死肿瘤细胞而受抑制。在某些实施方案中，肿瘤细胞的生长是经由诱导肿瘤细胞凋亡而受到抑制。在某些实施方案中，肿瘤细胞的生长是经由诱导肿瘤细胞分化而受抑制。在某些实施方案中，肿瘤细胞的生长是经由剥夺肿瘤细胞的营养而受抑制。在某些实施方案中，肿瘤细胞的生长是经由防止肿瘤细胞迁移而受抑制。在某些实施方案中，肿瘤细胞的生长是经由防止肿瘤细胞入侵而受抑制。诸如“治疗(treating/treatmet/totreat)” 和“缓解(alleviating/toalleviate) ”的术语是指下列两个意思1)治愈、减缓、减轻诊断的病理学病状或病症的症状和/或停止诊断的病理学病状或病症进展的治疗措施，和2)预防或减缓针对的病理学病状或病症的发展的预防或防止措施。因此，需要治疗的患者包括那些已患有所述病症的患者；那些容易患有所述病症的患者；以及那些希望预防所述病症的患者。在某些实施方案中，如果所述患者显示出一种或多种下列情况，那么所述受试者的癌症被成功地根据本发明的方法“治疗”:癌症或肿瘤细胞的数量减少，或完全不存在；肿瘤尺寸减小；抑制或未出现癌症或肿瘤细胞浸润到周边器官，包括例如癌症扩散到软组织和骨头；抑制或未出现肿瘤转移；抑制或未出现肿瘤或癌症生长；与特定癌症相关的一种或多种症状减轻；发病率和死亡率降低；生活品质改善；致瘤性、致瘤性发生频率或肿瘤的致瘤能力减少；肿瘤中癌干细胞的数量或发生频率减少；致瘤性细胞分化成非致瘤性状态；或这些效果的一些组
口 ο如本文所用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指由数个经由磷酸二酯键链接的核苷酸单位(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或相关的结构变异体)所组成的聚合物，包括但不限于DNA或RNA。这个术语涵盖包含任何具有已知的DNA和RNA碱基类似物的序列，包括但不限于4_乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙啶胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧羟基-甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基胺甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基-胺甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、I-甲基腺嘌呤、I-甲基假尿嘧啶、I-甲基鸟嘌呤、I-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、β D-甘露糖基Q核苷(que0Sine)、5’-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基醋酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基醋酸、氧基丁氧核苷(butoxosine)、假尿喃唳、Q核苷、2_硫胞喃唳、5-甲基_2_硫尿喃唳、2-硫尿喃啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧基醋酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基醋酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶及2，6-二氨基嘌呤。所述核苷酸的序列可由非核苷酸组分打断。 多核苷酸可在聚合化后被进一步修饰，诸如与标签组分共轭结合。其它类型的修改包括例如“封端以类似物取代一种或多种天然产生的核苷酸；核苷酸间修改，诸如不带电荷的键联(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、氨基甲酸酯等)和带电键联(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)；悬挂部分，诸如蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等);嵌入物(例如吖啶、补骨脂内酯等);螯合物(例如金属、放射活性金属、硼、氧化金属等)；烷化剂；修饰的键联(例如，α异位性核酸等);以及未经过修饰的多核苷酸形式。此外，任何通常存在于糖中的羟基均可由例如膦酸基、磷酸基所取代，用标准的保护基保护，或经过活化来制备对额外核苷酸的额外键联，或可共轭结合固相支撑物。5’和3’端OH可被磷酸化或由胺或具有I至20个碳的有机封端基团部分所取代。其它羟基也可衍生成标准保护基。多核苷酸还可含有本领域中众所周知的类似形式的核糖或脱氧核糖，包括(例如)2’ -O-甲基_、2’ -O-烯丙基、2’ -氟或2，-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α -异位糖、差向异构糖类，诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖(Iyxoses)、批喃糖、呋喃糖、庚酮糖(heptuloses)、无环类似物和无碱基核苷类似物，诸如甲基核糖苷。一个或多个磷酸二酯键联可由替代键联基团来取代。这些替代键联基团包括但不限于其中磷酸化物由P(O)S (“硫代酸酯”)、P (S) S (“二硫代酸酯”)、(0)NR2 (“酰胺化物”)、？(0)1 、？(0)( ’、0)或012 (“甲缩醛”)所取代的实施方案，其中各个R或R’是独立地由H、或取代或未取代的烷基(1-20C)，其可选择地含有醚(-0-)键联、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。并非需要所有在多核苷酸中的键联均相同。如本文所用的术语“载体”是指将DNA段从一个细胞转移至另一个细胞的核酸分子。术语“载体”是指一种构建物，其可递送并优选表达一种或多种对宿主细胞重要的基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、噬菌质粒、粘性质粒或噬菌体载体、与阳离子性冷凝剂相关的DNA或RNA表达载体，以及囊封在脂质体中的DNA或RNA表达载体。如本文所用的术语“多肽”和“肽”以及“蛋白质”和“蛋白质片段”等可互换使用以指任何长度的氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中所述聚合物中的一个或多个氨·基酸残基为对应的天然氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，并且术语还适用于天然氨基酸聚合物和非天然氨基酸聚合物。所述聚合物可为直链型或分支型，其可包含经过修饰的氨基酸，并且其可由非氨基酸中断。这些术语也包含已经过天然或介入方式修饰的氨基酸聚合物；这些修饰方式，为例如形成二硫键、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化，或任何其它操作或修饰，诸如与标记组分共轭结合。定义还包括(例如)含有一种或多种氨基酸类似物(包括，例如非天然氨基酸，等)以及本领域已知的其它修饰的多肽。据了解，由于本发明的多肽是以抗体为基础(至少部分)，在某些实施方案中，所述多肽可能以单链或联结链的形式出现。“氨基酸” 一词是指天然和合成氨基酸，以及功能类似在天然氨基酸的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸为由遗传密码编码，以及那些稍后被修饰的氨基酸，例如，羟基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸酯和邻磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然氨基酸相同的基础化学结构(例如，结合氢的α碳、羧基、氨基和R基的化合物)，例如，丝氨酸、正白氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这类的类似物可具有经过修饰的R基(例如正白氨酸)或经过修改的肽骨架，但保留与天然氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但功能类似于天然氨基酸的化学化合物。多肽或其它药剂“特异结合”一种蛋白质是指与替代物质(包括不相关的蛋白质)相比较，所述多肽或其它药剂更频繁地、更迅速地、持续更久地、亲和力更强地，或以上述各项的一些组合的方式与所述蛋白质反应或结合。在某些实施方案中，“特异结合”是指(例如)一种药剂以约O. ImM或更小，但更常为小于约I μΜ的KD结合一种蛋白质。在某些实施方案中，“特异结合”是指一种药剂通常以至少约O. 01 μ M或更小，至少约O. 01 μ M或更小，并且其它时间以至少约InM或更小的KD结合一种蛋白质。由在不同物种中的同源蛋白间的序列一致性，特异结合可包括能辨识超过一种物种中的特定蛋白质(诸如fct蛋白)的药齐U。同样地，由在不同fct蛋白在Wnts序列的某些区中的同源性，特异结合可包括能辨识超过一种Wnt蛋白的多肽(或其它药剂)。据了解，特异结合第一个标靶的药剂可能会或可能不会特异结合第二个标靶。因此，“特异结合”并不一定需要(虽然可包括)唯一结合，即，结合单一标靶。因此，在某些实施方案中，药剂可能特异结合超过一个目标(例如多种不同的人Wnts)。一般而言，但不一定，提及的结合意指特异性结合。在两种或更多种核酸或多肽的情形下，“一致”或“一致性百分比”是指当比较和对准(如果必要时，引进沟隙)最大一致性时，在不考虑任何保存性氨基酸替代为序列一致性的一部分下，两个或更多个序列或子序列彼此相同或具有特定百分比的核苷酸或氨基酸残基彼此相同。一致性百分比可使用序列比较软件或演算法或通过目视检查测量。可用于对准氨基酸或核苷酸序列的各种演算法和软件是本领域已知的。一种这类序列对准演算法的非限制性实例为描述于Karlin等，1990, Proc. Natl. Acad. Sci.，87:2264-2268中的演算法，在Karlin等，1993，PNAS 90; 5873-5877中有所修改并被并入NBLAST和XBLAST程序中(Altschul 等 1991，Nucleic Acids Res.，25:3389-3402)。其它可用于对准序列的可公开取得的软件程序包括但不限于Gapped BLAST、BLAST-2、WU-BLAST-2 (Altschul等，1991, Methods in Enzymology, 266:460-480)、ALIGN、ALIGN-2 (加州南旧金山，Genentech 公司)、Megalign(DNASTAR)及Bestfit程序(威斯康辛序列分析包，Unix第8版，遗传学电脑集团(Genetics Computer Group),威斯康辛州，麦迪逻市，University ResearchPark, 575Science Drive, Madison, WI 53711)。在一些实施方案中，当使用序列比较演算法或通过目视检查来测量时，本发明的两个核酸或多肽实质上相同，意思是其具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%并且在一些实施方案中，具有至少95%、96%、97%、98%、99%的核苷酸或氨基酸残基一致性。在一些实施方案中，一致性出现在长度为至少约10、至少约20、至少约40-60、至少约60-80或介于其间的整数的残基的序列区中。在某些实施方案中，一致性是出现在超过60-80个残基长的较长区域(诸如至少约90-100残基)中。在一些实施方案中，在相比较的序列的全长(诸如核苷酸序列的编码区)中，所述序列实质上一致。“保存性氨基酸取代”为其中一个氨基酸残基由另一个具有类似侧链的氨基酸残基替换。具有类似侧链的氨基酸残基族群已在本领域中鉴别出，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天门冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天门冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、白氨酸、异白氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β -支链型侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异白氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如苯丙氨酸取代酪氨酸为一种保存性取代。优选地，多肽序列中的保存性取代和本发明的其它药剂不会终止含有所述氨基酸序列的多肽结合标靶(即，所述多肽或其它药剂结合的一种或多种Wnts)。鉴别不排除标靶结合的核苷酸和氨基酸保存性取代的方法为本领域所众所周知的(参见，例如 Brummell 等,1993, Biochem. , 32:1180-87 ；Kobayashi 等,1999, ProteinEng. 12:879-84 ;和 Burks 等，1997 PNAS,94:412-17)。如本文所用的术语“约”是指所指明的数字加或减10%。例如，“约10%”指明9%至11%的范围。除非另有明确规定，本公开内容和权利要求书中所使用的单数形式“一 (a/an) ”和“所述(the)”包括复数形式。要了解，凡是本文中以措辞“包含”描述的实施方案也提供以“由...组成”和/或“主要由..·组成”等术语描述的类似实施方案。
如短语中使用的“和/或”，诸如“A和/或B”中，意指同时包括A和B ;A或B ;A(单独)和B (单独)。同样地，如短语中使用的“和/或”，诸如“A、B和/或C”，是意图涵盖以下每一实施方案A、B和C ;A、B或C ;A或C ;A或B ;B或C ;A和C ；A和B ;B和C ；A (单独)；B (单独)和C (单独)。II. Wnt 结合剂本发明提供结合(例如特异结合)一种或多种人Wnt蛋白(Wnts)的药剂。这些药剂在本文中称为“fct结合剂”。在某些实施方案中，所述药剂特异结合一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个fct蛋白。以非限制性实例说明，所述Wnt结合剂可能结合 fctl、Wnt2> Wnt2b> Wnt3> Wnt3a> Wnt7a> Wnt7b> Wnt8a> Wnt8b> WntlOa 和 /或WntlOb。在某些实施方案中，所述fct结合剂结合Wntl、Wnt2、Wnt3、Wnt3a和Wnt7b。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂为一种Wnt拮抗剂。在某些实施方案中，所述药剂抑制Wnt信号传递。在一些实施方案中，所述药剂抑制典型的fct信号传递。 在某些实施方案中，所述Wnt结合剂为一种多肽。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂为一种可溶性受体。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含FZD受体的胞外结构域。在一些实施方案中，所述fct结合剂包含FZD受体的Fri结构域。在某些实施方案中，所述FZD受体为一种人FZD受体。在某些实施方案中，所述人FZD受体为FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9或FZD10。在一些替代实施方案中，所述Wnt结合剂包含一部分SFRP。在一些实施方案中，所述fct结合剂包含SFRP的Fri结构域。在某些实施方案中，所述SFRP为人SFRP。在一些实施方案中，所述人SFRP为SFRP1、SFRP2、SFRP3、SFRP4或SFRP5。在其它替代实施方案中，所述Wnt结合剂包含Ror蛋白的胞外结构域。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂包含Ror蛋白的Fri结构域。在某些实施方案中，所述Ror为人Ror。在一些实施方案中，所述人Ror为Rorl或Ror2。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂为一种可溶性受体。在一些实施方案中，所述Wnt结合剂为一种可溶性蛋白。在某些实施方案中，所述fct结合剂为一种可溶性FZD受体。可溶性FZD受体的非限制性实例可在美国专利第7，723，477号中找到，其全部内容以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，所述fct结合剂为可溶性SFRP或可溶性Ror受体。FZD I的Fri结构域包括SEQ ID NO:27的约氨基酸87-237。FZD2的Fri结构域包含SEQ ID NO:28的约氨基酸24-159。FZD3的Fri结构域包括SEQ ID N0:29的约氨基酸23-143。FZD4的Fri结构域包括SEQ ID NO: 22的约氨基酸40-170。FZD5的Fri结构域包括SEQ ID NO:23的约氨基酸27-157。FZD6的Fri结构域包括SEQ ID NO:24的约氨基酸19-146。FZD7的Fri结构域包括SEQ ID NO:25的约氨基酸33-170。FZD8的Fri结构域包括SEQ ID NO:30的约氨基酸28-158。FZD9的Fri结构域包括SEQ ID N0:31的约氨基酸23-159。FZDlO的Fri结构域包括SEQ ID NO: 26的约氨基酸21-154。每一人FZD受体的相对应、预测的Fri结构域序列是以SEQ ID N0:32_41提供。每一人FZD受体(FZDl-IO)的最小、核心Fri结构域序列是以SEQ ID N0:3_12提供。每一人SFRPs (SFRP1-5)的最小、核心Fri结构域序列是以SEQ ID NO: 13-17提供。人Rorl和Ror2的最小、核心Fri结构域序列是以SEQ ID N0:58和SEQ ID N0:59提供。本领域技术人员对与每一个Fri结构域对应的确切氨基酸可能会有不同的理解。因此，以上和此处概述的结构域的N端或C端可延长或缩短1、2、3、4、5、6、7、8、9或甚至10个氨基酸。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含结合一种或多种人Wnt蛋白的人FZD受体的Fri结构域或所述Fri结构域的片段或变异体。在某些实施方案中，所述人FZD受体为 FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9*FZD10。在某些实施方案中，所述人FZD受体为FZD4。在某些替代实施方案中，所述人FZD受体为FZD5。在某些其它替代实施方案中，所述人FZD受体为FZD8。在某些实施方案中，所述FZD为FZD4并且所述Wnt结合剂包含SEQ ID NO: 6或包含SEQ ID NO: 19的约氨基酸40至170。在某些实施方案中，所述FZD为FZD5并且所述Wnt结合剂包含SEQ ID NO: 7或包含SEQ ID NO: 20的约氨基酸27-157。在某些实施方案中，所述FZD为FZD7并且所述Wnt结合剂包含SEQ ID NO: 9或包含SEQ ID NO: 25的约氨基酸33至170。在某些实施方案中，所述FZD为FZD8并且所述Wnt结合剂包含SEQ ID NO: 10或包含SEQ ID NO:21的约氨基酸28-158。在某些实施方案中，所述FZD为FZDlO并且所述Wnt结合剂包含SEQ ID NO: 12或包含SEQ ID N0:26的约氨基酸 21-154。 在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含选自由SEQ ID NO: 3_12组成的组的最小Fri结构域序列。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含选自由SEQ ID N0:13_17组成的组的最小Fri结构域序列。在某些实施方案中，所述fct结合剂包含选自由SEQ IDNO: 58和SEQ IDNO: 59组成的组的最小Fri结构域序列。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含任一前述FZD Fri结构域序列的变异体，所述变异体含有一个或多个(例如一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等)保存性取代并且能够结合fct。在某些替代实施方案中，所述Wnt结合剂包含人SFRP的Fri结构域，或结合一种或多种人Wnt蛋白的这类Fri结构域的片段或变异体。例如，在某些实施方案中，所述药剂包含选自由SEQ ID NO: 13-17组成的组的最小SFRP Fri结构域序列。在某些实施方案中，所述fct结合剂包含任一前述SFRP Fri结构域序列的变异体，所述变异体含有一个或多个(例如一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等)保存性取代并且保持结合fct的能力。在某些替代实施方案中，所述Wnt结合剂包含人Ror蛋白的Fri结构域,或结合一种或多种人fct蛋白的Fri结构域的片段或变异体。例如，在某些实施方案中，所述药剂包含选自由SEQ ID NO: 58和SEQ ID NO: 59组成的组的最小Ror Fri结构域序列。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂包含任一前述Ror Fri结构域序列的变异体,所述变异体含有一个或多个(例如一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等)保存性取代并且保持结合Wnt的能力。在某些实施方案中，所述Wnt结合剂(诸如包含人FZD受体或其它可溶性FZD受体的药剂的最小Fri结构域)进一步包含人Fe区(例如人IgGl Fe区)。所述Fe区可从任何类别的免疫球蛋白，IgG、IgA、IgM、IgD和IgE取得。在一些实施方案中，所述Fe区为野生型Fe区。在一些实施方案中，所述Fe区为突变的Fe区。在一些实施方案中，所述Fe区是在N端由1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸(例如，在绞链区)截断。在一些实施方案中，绞链区中的一个氨基酸被改变以阻挡形成不良的二硫键。在一些实施方案中，半胱氨酸由丝氨酸取代以阻挡形成不良的二硫键。在某些实施方案中，所述Fe区包含SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 42 或 SEQ ID NO: 43，或是由 SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 42 或 SEQ ID NO: 43 组成。在某些实施方案中，Wnt结合剂为包含至少一种FZD受体、SFRP或Ror蛋白和Fe区的最小Fri结构域的融合蛋白。如本文所用的“融合蛋白”为一种由核酸分子表达的杂交蛋白，所述核酸分子包含具有至少两个基因的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第一多肽的C末端是连接所述免疫球蛋白Fe区的N端。在一些实施方案中，所述第一多肽(例如，FZD Fri结构域)是直接连接Fe区(即，无插入的肽连接子)。在一些实施方案中，所述第一多肽是经由肽连接子连接Fe区。如本文所用的术语“连接子”是指插入第一多肽(例如，FZD组分)和第二多肽(例如，Fe区)之间的连接子。在一些实施方案中，所述连接子为肽连接子。连接子不应对多肽的表达、分泌或生物活性有不利的影响。连接子不应有抗原性并且不应该引起免疫反应。本领域技术人员已知合适的连接子，其通常包括甘氨酸和丝氨酸残基的混合物，并且通常包括立体上未被遮蔽的氨基酸。可被纳入有用的连接子中的其它氨基酸包括苏氨酸和丙氨·酸残基。连接子的长度可在(例如)1-50个氨基酸、1-22个氨基酸、1-10个氨基酸、1-5个氨基酸或1-3个氨基酸的范围内。连接子可包括但不限于SerGly、GGSG、GSGS、GGGS、S(GGS)η (其中 η 为 1-7)、GRA、聚(Gly)、聚(Ala)、ESGGGGVT(SEQ ID NO:60)、LESGGGGVT(SEQ IDNO :61)、GRAQVT(SEQ ID NO:62)、WRAQVT(SEQ ID NO:63)和 ARGRAQVT(SEQ ID NO:64) 如本文所用的连接子为一种不包括来自第一多肽(例如，FZD Fri结构域)的C端或第二多肽(例如Fe区)的N端的氨基酸残基的插入肽序列。FZD受:体、SFRPs和Ror蛋白含有指导蛋白质运送的/[目号序列。/[目号序列(又称为信号肽或前导序列)是位于新生多肽的N端。信号序列将多肽靶向内质网并将蛋白质归类到其目标位置，例如到达细胞器的内部空间、到内膜、到细胞外膜，或经由分泌到达细胞外。大多数信号序列是在蛋白质被运送到内质网后通过信号肽酶从蛋白质分裂出来。信号序列从多肽裂解通常是发生在氨基酸序列中的特定部位并且是取决于信号序列中的氨基酸残基。虽然通常具有一个特定裂解位点，信号肽酶可能辨识和/或使用超过一个裂解位点，而产生异源多肽N端。例如，使用信号序列内的不同裂解位点可能产生具有不同N端氨基酸的多肽。因此，在一些实施方案中，本文所述的多肽可能包含具有不同N端的多肽的混合物。在一些实施方案中，所述N端的长度相差1、2、3、4或5个氨基酸。在一些实施方案中,所述多肽实质上同质，即，所述多肽具有相同的N端。在一些实施方案中，所述多肽的信号序列包含一个或多个(例如一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等)氨基酸取代和/或缺失。在一些实施方案中，所述多肽的信号序列包含的氨基酸取代和/或缺失可容许一个裂解位点占主导地位，从而产生具有一个N端的实质上同源的多肽。在一些实施方案中，所述信号序列为SEQ ID NO:67 (SEQ ID NO 30的氨基酸1_27)。在一些实施方案中，SEQ ID N0:67的氨基酸25和/或26由不同氨基酸所取代。在一些实施方案中，SEQID N0:67的氨基酸17、18、19、23、24、25和/或26由不同氨基酸所取代。在一些实施方案中，SEQ ID N0:67的氨基酸17、23、24、25和26由不同氨基酸所取代。在一些实施方案中，SEQ ID N0:67的氨基酸17由苯丙氨酸或白氨酸所取代。在一些实施方案中，SEQ ID NO:67的氨基酸23由脯氨酸所取代。在一些实施方案中，SEQ ID NO: 67的氨基酸24由异白氨酸和苯丙氨酸所取代。在一些实施方案中，SEQ ID N0:67的氨基酸25由缬氨酸、异白氨酸或丙氨酸所取代。在一些实施方案中，SEQ ID N0:67的氨基酸26由组氨酸、酪氨酸或组氨酸所取代。在一些实施方案中，SEQ ID NO:67的氨基酸25由缬氨酸所取代。在一些实施方案中，SEQ ID NO:67的氨基酸26由白氨酸所取代。在一些实施方案中，所述多肽的信号序列包含选自表I中所列的组的序列或由表I中所列的组所组成。表I
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGAAASEQ ID NO:67
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGALASEQ ID NO:68
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGVLASEQ ID NO:69
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPIVHASEQ ID NO:70
MEWGYLLEVTSLLAALFLLQRSPIVHASEQ ID NO:71
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPFVHASEQ ID NO:72
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPIIYASEQ ID NO:73
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPIAHASEQ ID NO:74表2
第一多肽第二多肽
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 25-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 I-232
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 25-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 I-231
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 25-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 2-232
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 25-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 2-231
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 25-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 3-232
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 25-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 3-231
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 25-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 4-232
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 25-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 4-231
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 25-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 5-232SEQ ID NO: 30 的氨基酸 25-158 ~SEQ ID NO:43 的氨基酸 5-231
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 25-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 6-232
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 25-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 6-231
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 26-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 I-232
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 26-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 I-231
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 26-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 2-232
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 26-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 2-231
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 26-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 3-232 SEQ ID NO: 30 的氨基酸 26-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 3-231
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 26-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 4-232
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 26-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 4-231
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 26-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 5-232
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 26-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 5-231
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 26-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 6-232
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 26-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 6-231
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 27-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 I-232
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 27-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 I-231
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 27-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 2-232
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 27-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 2-231
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 27-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 3-232
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 27-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 3-231
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 27-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 4-232
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 27-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 4-231
SEQ ID NO: 30 的氨基酸 27-158SEQ ID NO:43 的氨基酸 5-23权利要求
1.一种Wnt结合剂，其包含 (a)第一多肽，其主要由选自由以下组成的组的氨基酸组成SEQID N0:27的Xl至Y1、SEQ ID N0:28 的 X2 至 Y2、SEQ ID NO:29 的 X3 至 Y3、SEQ ID NO:22 的 X4 至 Y4、SEQ IDNO: 23 的 X5 至 Y5、SEQ ID NO: 24 的 X6 至 Y6、SEQ ID NO: 25 的 X7 至 Y7、SEQ ID NO: 30 的X8 至 Y8、SEQ ID NO: 31 的 X9 至 Y9 和 SEQ ID NO: 26 的 XlO 至 YlO ;和 (b)第二多肽，其主要由SEQID NO:43的氨基酸A至B组成； 其中所述第一多肽直接连接所述第二多肽；且 其中 Xl=氨基酸 69、70、71、72、73、74、75 或 76 Yl=氨基酸 236、237、238、239、240、241、242 或 243 X2=氨基酸 22、23、24、25、26、27 或 28Y2=氨基酸 158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171 或 172 X3=氨基酸 18、19、20、21、22、23、24 或 25 Y3=氨基酸 141、142、143、144、145、146、147、148 或 149 X4=氨基酸 38、39、40、41 或 42 Y4=氨基酸 168、169、170、171、172、173、174、175 或 176 X5=氨基酸 25、26、27、28 或 29 Y5=氨基酸 155、156、157、158、159、160、161、162、163 或 164 X6=氨基酸 19、20、21、22、23 或 24 Y6=氨基酸 144、145、146、147、148、149、150、151 或 152 X7=氨基酸 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33 或 34 Y7=氨基酸 178、179、180、181、182、183、184、185 或 186 X8=氨基酸 25、26、27、28、29、30 或 31 Y8=氨基酸 156、157、158、159、160、161、162、163 或 164 X9=氨基酸 21、22、23 或 24 Y9=氨基酸 137、138、139、140、141、142、143、144、145 或 146 XlO=氨基酸 20、21、22、23、24 或 25 YlO=氨基酸 152、153、154、155、156、157、158、159 或 160 A=氨基酸1、2、3、4、5或6 B=氨基酸231或232。
2.—种Wnt结合剂，其包含 (a)第一多肽，其主要由SEQID NO: 30的氨基酸X至Y组成；和 (b)第二多肽，其主要由SEQID NO:43的氨基酸A至B组成； 其中所述第一多肽直接连接所述第二多肽；且 其中 X=氨基酸 25、26、27、28、29、30 或 31 Y=氨基酸 156、157、158、159、160、161、162、163 或 164 A=氨基酸1、2、3、4、5或6 B=氨基酸231或232。
3.如权利要求I或2所述的Wnt结合剂，其中所述第一多肽的C端连接所述第二多肽的N端。
4.如权利要求I至3中任一项所述的Wnt结合剂，其中所述第一多肽主要由SEQIDNO:30的氨基酸25-158组成。
5.如权利要求I至3中任一项所述的Wnt结合剂，其中所述第一多肽主要由SEQIDNO:30的氨基酸28-158组成。
6.如权利要求I至5中任一项所述的Wnt结合剂，其中所述第二多肽主要由SEQIDNO:43的氨基酸1-232组成。
7.如权利要求I至5中任一项所述的Wnt结合剂，其中所述第二多肽主要由SEQIDNO:43的氨基酸3-232组成。
8.如权利要求I至5中任一项所述的Wnt结合剂，其中所述第二多肽主要由SEQIDNO:43的氨基酸6-232组成。
9.如权利要求I至3中任一项所述的Wnt结合剂，其中所述第一多肽为SEQIDNO: 39 ；和/或所述第二多肽为SEQ ID NO:43。
10.如权利要求I至3中任一项所述的Wnt结合剂，其中所述第一多肽为SEQIDNO: 39 ；和/或所述第二多肽为SEQ ID NO:42。
11.一种Wnt结合剂，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列SEQ ID NO: 53,SEQ IDNO:50,SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:51和 SEQ ID NO: I。
12.一种Wnt结合剂，其包含SEQ ID NO: 50。
13.一种Wnt结合剂，其包含SEQ ID NO: 53。
14.如权利要求I至13中任一项所述的Wnt结合剂，其为可溶性受体。
15.如权利要求I至14中任一项所述的Wnt结合剂，其为Wnt的拮抗剂。
16.如权利要求I至15中任一项所述的Wnt结合剂,其结合选自由以下组成的组的一种或多种人 Wnt 蛋白Wntl、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wntl0a和 Wnt10b。
17.如权利要求16所述的Wnt结合剂，其结合选自由以下组成的组的两种或多于两种人 Wnt 蛋白￥]11:1、￥1^2、￥1^213、￥1^3、￥1^33、￥1^73、￥1^713、￥1^83、￥1^813、￥111:103和 Wnt 10b。
18.如权利要求17所述的Wnt结合剂，其结合1社1、1社2、11^3、11^33和11^713。
19.如权利要求I至18中任一项所述的Wnt结合剂，其抑制Wnt信号传递。
20.如权利要求19所述的Wnt结合剂，其中所述Wnt信号传递为典型的Wnt信号传递。
21.如权利要求I至20中任一项所述的Wnt结合剂，经由尾静脉以约10mg/kg的剂量施用时，所述fct结合剂在大鼠中的半衰期为至少约100小时。
22.如权利要求I至21中任一项所述的Wnt结合剂，其抑制肿瘤或肿瘤细胞的生长。
23.如权利要求I至22中任一项所述的Wnt结合剂，其诱导肿瘤中的分化标记的表达。
24.如权利要求I至23中任一项所述的Wnt结合剂，其诱导细胞在肿瘤中进行分化。
25.如权利要求I至24中任一项所述的Wnt结合剂，其降低肿瘤中癌干细胞的发生频率。
26.如权利要求I至11或14至25中任一项所述的Wnt结合剂，其中包含SEQIDNO: 46的药剂抑制肿瘤生长的程度超过包含SEQ ID NO: I的药剂。
27.如权利要求I至11或14至25中任一项所述的Wnt结合剂，其中包含SEQIDNO: 48的药剂抑制肿瘤生长的程度超过包含SEQ ID NO: I的药剂。
28.如权利要求I至11或14至25中任一项所述的Wnt结合剂，其中包含SEQIDNO: 50的药剂抑制肿瘤生长的程度超过包含SEQ ID NO: I的药剂。
29.如权利要求I至11或14至25中任一项所述的Wnt结合剂，其中包含SEQIDNO: 53的药剂抑制肿瘤生长的程度超过包含SEQ ID NO: I的药剂。
30.如权利要求I至29中任一项所述的Wnt结合剂，其抑制肿瘤生长的程度超过第二Wnt结合剂,其中所述第二 Wnt结合剂包含FZD结构域组分、Fe结构域组分和连接子组分，其中所述连接子组分为插入肽连接子。
31.如权利要求22至30中任一项所述的Wnt结合剂，其中所述肿瘤具有Wnt依赖性。
32.如权利要求22至31中任一项所述的Wnt结合剂，其中所述肿瘤为选自由以下组成的组的肿瘤结肠直肠瘤、结肠瘤、胰脏瘤、肺肿瘤、卵巢瘤、肝脏瘤、乳房肿瘤、肾肿瘤、前列 腺瘤、胃肠瘤、黑素瘤、子宫颈瘤、膀胱瘤、胶质母细胞瘤以及头颈部肿瘤。
33.如权利要求32所述的Wnt结合剂，其中所述肿瘤为结肠直肠瘤。
34.如权利要求32所述的Wnt结合剂，其中所述肿瘤为乳房肿瘤。
35.如权利要求32所述的Wnt结合剂，其中所述肿瘤为胰脏瘤。
36.一种多肽，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列SEQ ID NO:53, SEQ IDNO:50,SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:51和 SEQ ID NO: I。
37.一种多肽，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列SEQ ID NO:53, SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48 和 SEQ ID NO: I。
38.一种多肽，其包含SEQ ID N0:50的氨基酸序列。
39.一种多肽，其包含SEQ ID N0:53的氨基酸序列。
40.一种基本纯化的多肽，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列SEQ ID N0:53、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48 和 SEQ ID NO: I，其中所述多肽至少 90% 具有ASA的N端序列。
41.一种多肽，其由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成SEQ ID NO:53, SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48 和 SEQ ID NO: I。
42.一种多肽，其由SEQ ID N0:50组成。
43.一种多肽，其由SEQ ID N0:53组成。
44.一种细胞,其制造如权利要求I至43中任一项所述的Wnt结合剂或多肽。
45.一种组合物,其包含如权利要求I至43中任一项所述的Wnt结合剂或多肽。
46.一种包含如权利要求I至43中任一项所述的Wnt结合剂或多肽的组合物，其中所述Wnt结合剂或所述多肽至少80%具有ASA的N端序列。
47.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求I至43中任一项所述的Wnt结合剂或多肽以及药学上可接受的载体。
48.一种多核苷酸，其包含编码如权利要求I至43中任一项所述的Wnt结合剂或多肽的多核苷酸。
49.一种包含如权利要求48所述的多核苷酸的载体。
50.—种分离的细胞，其包含如权利要求48所述的多核苷酸或如权利要求49所述的载体。
51.一种抑制受试者的肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求I至43中任一项所述的Wnt结合剂或多肽。
52.一种诱导受试者的肿瘤细胞分化的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求I至43中任一项所述的Wnt结合剂或多肽。
53.一种降低肿瘤中的癌干细胞的发生频率的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求I至43中任一项所述的Wnt结合剂或多肽。
54.如权利要求51至53中任一项所述的方法，其中所述肿瘤为选自由以下组成的组的肿瘤结肠直肠瘤、胰脏瘤、肺肿瘤、卵巢瘤、肝脏瘤、乳房肿瘤、肾肿瘤、前列腺瘤、胃肠瘤、黑素瘤、子宫颈瘤、膀胱瘤、胶质母细胞瘤以及头颈部肿瘤。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述肿瘤为结肠直肠瘤。
56.如权利要求54所述的方法，其中所述肿瘤为胰脏瘤。
57.如权利要求54所述的方法，其中所述肿瘤为乳房肿瘤。
58.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求I至43中任一项所述的Wnt结合剂或多肽。
59.一种治疗受试者的疾病的方法，其中所述疾病与Wnt信号传递活化有关，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求I至43中任一项所述的Wnt结合剂或多肽。
60.一种治疗受试者的病症的方法，其中所述病症的特征为干细胞和/或祖细胞水平提高，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求I至43中任一项所述的Wnt结合剂或多肽。
61.如权利要求51至60中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用第二治疗剂。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述第二治疗剂为化学治疗剂。
63.如权利要求61所述的方法，其中所述第二治疗剂为血管生成抑制剂。
64.—种降低包含癌干细胞的肿瘤中的癌干细胞的发生频率的方法，所述方法包括将所述肿瘤与有效量的结合一种或多种人fct蛋白的药剂接触。
65.一种诱导肿瘤中的细胞分化的方法，所述方法包括将所述肿瘤与有效量的结合一种或多种人fct蛋白的药剂接触。
66.如权利要求64或65所述的方法，其中所述药剂为Wnt的拮抗剂。
67.如权利要求64或65所述的方法，其中所述药剂包含人FZD受体的Fri结构域、或所述Fri结构域的结合一种或多种人Wnt蛋白的片段。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述人FZD受体为FZD4。
69.如权利要求67所述的方法，其中所述人FZD受体为FZD5。
70.如权利要求67所述的方法，其中所述人FZD受体为FZD8。
71.如权利要求64-70中任一项所述的方法，其中所述药剂包含选自由以下组成的组的序列SEQ ID NO:3-12。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述药剂包含序列SEQID NO: 10。
73.如权利要求64-66中任一项所述的方法，其中所述药剂包含SEQID NO:21的氨基酸 28-158。
74.如权利要求64-66中任一项所述的方法，其中所述药剂包含人SFRP的Fri结构域、或所述Fri结构域的结合一种或多种人Wnt蛋白的片段。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述药剂包含选自由以下组成的组的序列SEQID NO:13-17。
76.如权利要求64-75中任一项所述的方法，其中所述药剂进一步包含人Fe区。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述Fri结构域直接连接所述Fe区。
78.如权利要求76所述的方法，其中所述Fri结构域和所述人Fe区的接合处的序列不含有插入肽连接子。
79.如权利要求76-78中任一项所述的方法，其中所述人Fe区为人IgGlFc区。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述Fe区选自由以下组成的组SEQID NO: 18,SEQ ID NO:42 或 SEQ ID NO:43。
81.如权利要求64-66中任一项所述的方法，其中所述药剂不包含FZD受体的Fri结构域。
82.如权利要求64-81中任一项所述的方法，其中所述药剂结合选自由以下组成的组的一种或多种人 fct 蛋白Wntl、Wnt2> Wnt2b> Wnt3> Wnt3a> Wnt7a> Wnt7b> Wnt8a> Wnt8b>WntlOa和 WntlOb。
83.如权利要求82所述的方法，其中所述药剂结合选自由以下组成的组的两种或多于两种人 Wnt 蛋白ffntl> Wnt2> Wnt2b> Wnt3> Wnt3a> Wnt7a> Wnt7b> Wnt8a> Wnt8b> WntlOa 和WntlObo
84.如权利要求82所述的方法，其中所述药剂结合1社1、1社2、1社3、1社3&和1社713。
85.如权利要求64-84中任一项所述的方法，其中所述药剂抑制Wnt信号传递。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述Wnt信号传递为典型的Wnt信号传递。
87.如权利要求64-67、70或76至86中任一项所述的方法，其中所述药剂包含选自由以下组成的组的序列SEQ ID NO: I、SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51和 SEQ ID NO:53。
88.如权利要求64-67、70或76至86中任一项所述的方法，其中所述药剂包含选自由以下组成的组的序列SEQ ID N0:USEQ ID NO:46,SEQ ID NO:48,SEQ ID N0:50和SEQ IDN0:53。
89.如权利要求64-88中任一项所述的方法，其为一种体内方法。
90.如权利要求89所述的方法，其中所述接触包括向具有所述肿瘤的人施用有效量的所述药剂。
91.如权利要求64-90中任一项所述的方法，其中经由尾静脉以约10mg/kg的剂量施用时，所述药剂在大鼠中的半衰期为至少约100小时。
92.如权利要求64-88中任一项所述的方法，其为一种体外方法。
93.如权利要求64-92中任一项所述的方法，其中所述肿瘤具有Wnt依赖性。
94.如权利要求64-93中任一项所述的方法，其中所述肿瘤为选自由以下组成的组的肿瘤结肠直肠瘤、胰脏瘤、肺肿瘤、卵巢瘤、肝脏瘤、乳房肿瘤、肾肿瘤、前列腺瘤、胃肠瘤、黑素瘤、子宫颈瘤、膀胱瘤、胶质母细胞瘤以及头颈部肿瘤。
95.如权利要求94所述的方法，其中所述肿瘤为结肠直肠瘤。
96.如权利要求94所述的方法，其中所述肿瘤为乳房肿瘤。
97.如权利要求94所述的方法，其中所述肿瘤为胰脏瘤。
98.如权利要求64-97中任一项所述的方法，其进一步包括使所述肿瘤与化学治疗剂接触。
99.一种抑制受试者的胰脏瘤或结肠直肠瘤的生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含人FZD8受体的Fri结构域的药剂。
100.一种治疗受试者的胰脏癌或结肠直肠癌的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含人FZD8受体的Fri结构域的药剂。
101.一种抑制受试者的胰脏瘤的生长或治疗受试者的胰脏癌的方法，其包括 向所述受试者施用治疗有效量的包含人FZD8受体的Fri结构域的药剂；和 向所述受试者施用化学治疗剂。
102.如权利要求101所述的方法，其中所述化学治疗剂为抗代谢剂。
103.如权利要求101所述的方法，其中所述化学治疗剂为吉西他滨。
104.一种抑制受试者的结肠瘤的生长或治疗受试者的结肠癌的方法，所述方法包括 向所述受试者施用治疗有效量的包含人FZD8受体的Fri结构域的药剂；并且向所述受试者施用化学治疗剂。
105.如权利要求104所述的方法，其中所述化学治疗剂为伊立替康。
106.一种抑制受试者的乳房肿瘤的生长或治疗受试者的乳癌的方法，所述方法包括 向所述受试者施用治疗有效量的包含人FZD8受体的Fri结构域的药剂；和 向所述受试者施用抗有丝分裂剂。
107.如权利要求106所述的方法，其中所述抗有丝分裂剂为紫衫烷。
108.如权利要求107所述的方法，其中所述紫衫烷为太平洋紫杉醇。
109.如权利要求99-108中任一项所述的方法，其中所述药剂进一步包含人Fe结构域。
110.如权利要求99-109中任一项所述的方法，其中所述药剂包含多肽，所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列SEQ ID NO: I、SEQ ID NO:45、SEQ ID N0:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51 和 SEQ ID NO:53。
111.一种针对抗肿瘤活性来筛选结合一种或多种fct蛋白的药剂的方法，其包括 将已暴露于所述药剂的第一实体肿瘤中的一种或多种分化标记和/或一种或多种干细胞性标记的水平与尚未暴露于所述药剂的第二实体肿瘤中的所述一种或多种分化标记的水平相比较。
112.—种针对抗肿瘤活性来筛选结合一种或多种Wnt蛋白的药剂的方法，其包括 (a)使第一实体肿瘤暴露于所述药剂，但第二实体肿瘤则不暴露； (b)评估在所述第一实体肿瘤和第二实体肿瘤中的一种或多种分化标记和/或一种或多种干细胞性标记的水平；以及 (C)将所述第一实体肿瘤中的所述一种或多种分化标记的水平与所述第二实体肿瘤中的所述一种或多种分化标记的水平相比较。
113.如权利要求112所述的方法，其中 (a)所述第一实体肿瘤中的所述一种或多种分化标记相对于所述第二实体肿瘤中的所述一种或多种分化标记的水平所增加的水平表示所述药剂的抗肿瘤活性；以及 (b)所述一种或多种干细胞性标记所降低的水平表示所述药剂的抗肿瘤活性。
114.一种针对抗癌干细胞活性来筛选结合一种或多种Wnt蛋白的药剂的方法，其包括 将已暴露于所述药剂的第一实体肿瘤中的一种或多种分化标记和/或一种或多种干细胞性标记的水平与尚未暴露于所述药剂的第二实体肿瘤中的所述一种或多种分化标记的水平相比较。
115.一种针对抗癌干细胞活性来筛选结合一种或多种fct蛋白的药剂的方法，其包括 (a)使包含癌干细胞的第一实体肿瘤暴露于所述药剂，但包含癌干细胞的第二实体肿瘤则不暴露； (b)评估在所述第一实体肿瘤和第二实体肿瘤中的一种或多种分化标记和/或一种或多种干细胞性标记的水平；以及 (C)将所述第一实体肿瘤中的所述一种或多种分化标记的水平与所述第二实体肿瘤中的所述一种或多种分化标记的水平相比较。
116.如权利要求115所述的方法，其中 (a)所述第一实体肿瘤中的所述一种或多种分化标记相对于所述第二实体肿瘤中的所述一种或多种分化标记的水平所增加的水平表示所述药剂的抗肿瘤活性；以及 (b)所述一种或多种干细胞标记所降低的水平表示所述药剂的抗肿瘤活性。
117.如权利要求111-116中任一项所述的方法，其中所述实体肿瘤为胰脏瘤。
118.如权利要求117所述的方法，其中所述一种或多种分化标记包含 (a)一种或多种粘蛋白或(b)嗜铬粒蛋白A(CHGA)。
119.如权利要求118所述的方法，其中所述一种或多种分化标记包含粘蛋白16(Muc 16)。
120.如权利要求111-116中任一项所述的方法，其中所述实体肿瘤为结肠肿瘤。
121.如权利要求120所述的方法，其中所述一种或多种分化标记包含细胞角蛋白7。
122.如权利要求111-121中任一项所述的方法，其中所述药剂为抗体。
123.如权利要求111-121中任一项所述的方法，其中所述药剂不是抗体。
124.如权利要求111-121中任一项所述的方法，其中所述药剂包含人FZD8受体的Fri结构域。
125.如权利要求111-121中任一项所述的方法，其中所述药剂包含多肽，所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列SEQ ID NOiUSEQ ID NO:45,SEQ ID NO:46,SEQ IDNO:47,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50, SEQ ID N0:51 和 SEQ ID N0:53。
126.如权利要求125所述的方法，其中所述药剂包含SEQID N0:51。
127.如权利要求125所述的方法，其中所述药剂包含SEQID N0:53。
128.如权利要求I至13中任一项所述的Wnt结合剂，其进一步包含选自由以下组成的组的氨基酸序列SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73 和 SEQ ID NO:74。
129.如权利要求I至13中任一项所述的Wnt结合剂，其进一步包含选自由以下组成的组的氨基酸序列SEQ ID NO:70,SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:73 和 SEQ IDNO:74。
130.如权利要求36-39中任一项所述的多肽，其进一步包含选自由以下组成的组的氨基酸序列SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:69,SEQ ID NO:70,SEQ ID NO:71、SEQID NO:72、SEQ ID NO:73 和 SEQ ID NO:74。
131.如权利要求36-39中任一项所述的多肽，其进一步包含选自由以下组成的组的氨基酸序列SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73 和 SEQ ID NO: 74。
132.—种分离的多核苷酸，其包含编码如权利要求128-131中任一项所述的Wnt结合剂或多肽的多核苷酸。
133.—种分离的多核苷酸，其包含编码具有SEQ ID NO:75的序列的多肽的多核苷酸。
134.一种分离的多核苷酸,其包含编码多肽的多核苷酸,所述多肽包含 (a)选自由以下组成的组的信号序列SEQID NO:71, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73 和 SEQ ID NO:74 ； (b)人FZD8的Fri结构域；以及 (c)人Fe区。
135.—种包含如权利要求132至134中任一项所述的多核苷酸的载体。
136.—种细胞,其包含如权利要求132至134中任一项所述的多核苷酸或如权利要求135所述的载体。
137.—种Wnt结合剂，其由如权利要求44或权利要求136所述的细胞制造。
138.—种包含可溶性Wnt结合剂的组合物，所述可溶性Wnt结合剂包含人FZD8的Fri结构域，其中所述Wnt结合剂至少约80%具有ASA的N端序列。
139.如权利要求138所述的组合物，其中所述Wnt结合剂至少约90%具有ASA的N端序列。
140.如权利要求138所述的组合物，其中所述Wnt结合剂至少约95%具有ASA的N端序列。
141.如权利要求138-140中任一项所述的组合物，其中所述Wnt结合剂包含人Fe区。
142.如权利要求138-141中任一项所述的组合物，其中所述Wnt结合剂包含选自由以下组成的组的氨基酸序列SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48 和SEQ ID NO:I。
143.如权利要求138-141中任一项所述的组合物，其中所述Wnt结合剂包含SEQIDNO:53。
144.如权利要求138-141中任一项所述的组合物，其中所述Wnt结合剂包含SEQIDN0:50。
145.如权利要求138-141中任一项所述的组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。
146.一种抑制受试者的肿瘤生长的方法，其包括施用治疗有效量的如权利要求138至145中任一项所述的组合物。
147.—种诱导受试者的肿瘤细胞分化的方法，其包括施用治疗有效量的如权利要求138至145中任一项所述的组合物。
148.一种降低肿瘤中的癌干细胞的发生频率的方法，其包括施用治疗有效量的如权利要求138至145中任一项所述的组合物。
149.如权利要求146-148中任一项所述的方法，其中所述肿瘤为选自由以下组成的组的肿瘤结肠直肠瘤、胰脏瘤、肺肿瘤、卵巢瘤、肝脏瘤、乳房肿瘤、肾肿瘤、前列腺瘤、胃肠瘤、黑素瘤、子宫颈瘤、膀胱瘤、胶质母细胞瘤以及头颈部肿瘤。
150.如权利要求149所述的方法，其中所述肿瘤为结肠直肠瘤。
151.如权利要求149所述的方法，其中所述肿瘤为胰脏瘤。
152.如权利要求149所述的方法，其中所述肿瘤为乳房肿瘤。
153.—种治疗受试者的癌症的方法，其包括施用治疗有效量的如权利要求138至145中任一项所述的组合物。
154.如权利要求153所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组结肠直肠癌、胰脏癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、肾脏癌、前列腺癌、胃肠癌、黑素瘤、子宫颈癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤以及头颈部癌。
155.—种治疗受试者的疾病的方法，其中所述疾病与Wnt信号传递活化有关，其包括施用治疗有效量的如权利要求138至145中任一项所述的组合物。
156.—种治疗受试者的病症的方法，其中所述病症的特征为干细胞和/或祖细胞水平提高，所述方法包括施用治疗有效量的如权利要求138至145中任一项所述的组合物。
157.如权利要求146-156中任一项所述的方法,其进一步包括向所述受试者施用第二治疗剂。
158.如权利要求157所述的方法，其中所述第二治疗剂为化学治疗剂。
159.如权利要求62或158所述的方法，其中所述化学治疗剂为太平洋紫杉醇。
160.如权利要求62或158所述的方法，其中所述化学治疗剂伊立替康。
161.如权利要求62或158所述的方法，其中所述化学治疗剂为吉西他滨。
162.如权利要求157所述的方法，其中所述第二治疗剂为血管生成抑制剂。
163.如权利要求63或162所述的方法，其中所述血管生成抑制剂为抗VEGF抗体。
164.一种制造可溶性Wnt结合剂的细胞，所述可溶性Wnt结合剂包含人FZD8的Fri结构域，其中所述Wnt结合剂至少约80%具有ASA的N端序列。
165.如权利要求164所述的细胞，其中所述Wnt结合剂至少约90%具有ASA的N端序列。
166.如权利要求164所述的细胞，其中所述Wnt结合剂至少约95%具有ASA的N端序列。
167.如权利要求164所述的细胞，其中所述Wnt结合剂至少约98%具有ASA的N端序列。
168.如权利要求164-166中任一项所述的细胞，其为哺乳动物细胞。
169.如权利要求164-168中任一项所述的细胞，其中所述Wnt结合剂包含人Fe区。
170.如权利要求164-169中任一项所述的细胞，其中所述Wnt结合剂包含选自由以下组成的组的氨基酸序列SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48和 SEQID NO:I。
171.如权利要求164-169中任一项所述的细胞，其中所述Wnt结合剂包含SEQIDN0:53。
172.如权利要求164-169中任一项所述的细胞，其中所述Wnt结合剂包含SEQIDN0:50。
173.如权利要求164所述的细胞，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码具有SEQID N0:75的序列的多肽的多核苷酸。
174.—种制造可溶性Wnt结合剂的方法，所述可溶性Wnt结合剂包含细胞中的人FZD8的Fri结构域，其中所述Wnt结合剂至少约80%具有ASA的N端序列，所述方法包括使用选自由以下组成的组的信号序列来制造所述Wnt结合剂SEQ ID NO:7U SEQ ID NO:70, SEQID NO:72、SEQ ID NO:73 和 SEQ ID NO:74。
175.如权利要求174所述的方法，其中所述信号序列为SEQID NO:71。
176.如权利要求174或175所述的方法，其中所述Wnt结合剂至少约90%具有ASA的N端序列。
177.如权利要求174或175所述的方法，其中所述Wnt结合剂至少约95%具有ASA的N端序列。
178.如权利要求174或175所述的方法，其中所述Wnt结合剂至少约98%具有ASA的N端序列。
179.如权利要求174-178中任一项所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
180.如权利要求174-179中任一项所述的方法，其中所述Wnt结合剂包含人Fe区。
181.如权利要求174-180中任一项所述的方法，其中所述Wnt结合剂包含选自由以下组成的组的氨基酸序列SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:46,SEQ ID N0:48和SEQID NO:I。
182.如权利要求174-180中任一项所述的方法，其中所述Wnt结合剂包含SEQIDNO:53。
183.如权利要求174-180中任一项所述的方法，其中所述Wnt结合剂包含SEQIDN0:50。
184.如权利要求174所述的方法，其中所述细胞包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码具有SEQ ID NO:75的序列的多肽的多核苷酸。
全文摘要
本发明涉及包含Wnt拮抗剂的组合物和治疗与Wnt相关的疾病和病症(诸如癌症)、诱导分化以及减少癌干细胞的发生频率的方法，以及筛选此类Wnt拮抗剂的新型方法。具体来说，本发明公开可溶性FZD、SFRP和Ror受体及其用途。
文档编号C07K1/00GK102917721SQ201180011687
公开日2013年2月6日 申请日期2011年1月12日 优先权日2010年1月12日
发明者桑吉维·H·萨蒂亚尔, 萨蒂亚吉特·苏伊特·库马尔·米特拉, 奥斯丁·L·格尼 申请人:昂考梅德药品有限公司