专利名称：用于巨噬细胞相关疾病靶向给药的药物载体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及重组轮状病毒Vp6基因的表达及体外组装，尤其涉及利用该组装产 物用于淋巴细胞相关疾病的靶向供药(靶向治疗性供药、靶向造影和巨噬细胞标记等)。
背景技术：
病毒样颗粒(virus like particles, VLP)是一类无复制能力、由病毒蛋白自组装成 的没有基因组的蛋白质。在一定的条件下，蛋白亚基可在体外环境中自组装成笼型结构 或其它形状的病毒样纳米颗粒；它们有规则的结构形态，在纳米范围内不同的病毒具有 不同的尺寸(20nm-200nm);结构有序，单分散性好；许多病毒的三维结构已经在原子水 平被解析；能大量的生产，得到克级甚至是公斤级的病毒粒子；有很大的表面积，内表 面、外表面及亚基与亚基分界面，都可以用化学修饰的方法对这些位点进行修饰，特异 地连接上其它物质，应用于医学或材料科学；重复有序的表面结构修饰上识别配体后， 能在总体上协同增强与细胞受体的亲和力；通过基因重组的方法，可以按照人们的意图 改造外表面或内部结构，使其具有靶向性或能包裹特定的药物，这样可避免药物聚集和 被体内环境降解、增加药物生物相容性、减少药物毒性、增加体内停留时间。所以较之 于合成的纳米粒子，在载体应用方面具有许多优点。轮状病毒(rotavirus RV)是一类消化道感染病毒，主要感染小肠上皮戎毛膜细 胞，然后感染游动的淋巴细胞，并由淋巴细胞经过淋巴循环而把病毒带到身体各个部 位。RV主要的结构蛋白Vp6在天然状态下以三聚体形式存在，其晶体结构已被解析。 在PH4的环境中，真核表达的Vp6可以自组装成70nm左右的病毒样颗粒。但是，真核 表达的蛋白量较少，表达成本较高，大大限制其在商业中的利用。 巨噬细胞活化综合症是由T细胞和巨噬细胞的过度活化及增殖引起的，以发 热，肝脾、淋巴结肿大，全血细胞减少，轻至重度肝功能损害，神经系统受累等为特征 的综合征，又被认为是继发性或反应性噬血细胞性淋巴组织细胞增多(hemophagocytic lymohohistiocymsis， HLH)。 MAS是慢性风湿类疾病，尤其是全身性幼年型特发性关节 炎(systemic onset juvenile idiopathic arthritis, SOJIA)患者中的严重的、潜在危及生命的并 发症。 在肿瘤细胞的诱导下，起源于骨髓的白细胞可分化形成具有独特表型的巨噬 细胞，这些巨噬细胞可促进肿瘤细胞的增殖、抑制T细胞和自然杀伤细胞(natural killer cell, NK)的抗肿瘤活性、支持肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及新生血管形成。这些细胞 被称为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage, TAM)。 在某些情况下，TAM可 构成实体瘤细胞群体的50% 80%，这种TAM的广泛浸润与乳腺癌、宫颈癌及膀胱癌的 不良预后相关。 对于MAS和TAM，目前尚无特异的靶向药物，迫切需要一种安全有效的靶向载 体进行巨噬细胞的特异性治疗。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足和实际药物研制应用中的迫切需求，本发明的目的在 于提供一种用于巨噬细胞相关疾病靶向供药的药物载体及其制法，利用轮状病毒外壳蛋 白体外自组装和巨噬细胞特异性靶向的特性，经化学修饰，可把治疗性药物或示踪性药 物定向到巨噬细胞。
本发明的第一个目的，其实现的技术方案是 用于巨噬细胞相关疾病靶向供药的药物载体，其特征在于该药物载体为对巨 噬细胞有特异识别能力的轮状病毒外壳蛋白Vp6经原核表达、自组装而成的病毒样颗 粒。 进一步地，前述用于巨噬细胞相关疾病靶向供药的药物载体，其中该病毒样颗 粒为中空结构，且其内表面或外表面化学修饰有药物分子，所述药物分子包括治疗性药 物或示踪性药物或两者混合。
本发明的第二个目的，该药物载体制法的技术方案是 用于巨噬细胞相关疾病靶向供药的药物载体的制备方法，其特征在于首先提 取A组轮状病毒的结构蛋白Vp6基因；然后将这些结构蛋白Vp6基因克隆到原核表达载 体；再在大肠杆菌BL21中进行表达；最后把表达的蛋白与药物进行交联、组装成病毒 样颗粒。 进一步地，前述用于巨噬细胞相关疾病靶向供药的药物载体的制备方法，其中 该结构蛋白Vp6的来源包括猴的轮状病毒Vp6基因、猪的轮状病毒Vp6基因和人的轮状 病毒Vp6基因，在实际生产应用中，可以选用这些Vp6基因的其中的一种，也可以选用 多种混合使用。 更进一步地，前述用于巨噬细胞相关疾病靶向供药的药物载体的制备方法，其 中该病毒样颗粒与治疗性药物或示踪性药物的组装为体外组装。 本发明的有益效果体现在利用病毒样颗粒对巨噬细胞的特异性识别能力，把 药物输送到巨噬细胞中实现靶向供药和缓释的功能，能有效降低药物的用量和毒性，避 免体内环境对药物的降解，提高治疗效果；同时，利用原核表达的方法及轮状病毒蛋白 Vp6体外组装的特性，能够实现大批量生产，并降低制造成本。
图1是轮状病毒Vp6蛋白纯化和表达的示意图； 图2是轮状病毒Vp6蛋白复性的示意图； 图3a是轮状病毒Vp6标记阿霉素后的照片示意图； 图3b是对标记后的轮状病毒Vp6通过考马斯亮蓝染色的照片示意图； 图4是对标记后的轮状病毒Vp6采用表面增强拉曼光谱检测示意图； 图5a是本发明病毒样颗粒的电镜照片示意图； 图5b是本发明病毒样颗粒的原子力显微镜照片示意图； 图6A是本发明病毒样颗粒与巨噬细胞孵育后的荧光显微镜示意图； 图6B是图6A的阴性对照示意图； 图7A是本发明病毒样颗粒与A549细胞孵育后的荧光显微镜示意 图7B是图7A的阴性对照示意图。
具体实施例方式
本发明所用的Vp6基因均为A组轮状病毒，分别是来源于猴的轮状病毒Vp6基 因；人的Vp6基因和猪的Vp6基因。这些基因及编码的蛋白分别见序列1、 2、 3，各是 由1356个核苷酸组成，编码397个氨基酸，开放阅读框为24-1217位核苷酸。把这些基 因克隆到原核表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，得到分子量在45KD左右的 蛋白质，再把表达的蛋白与药物进行交联，进行体外组装，得到巨噬细胞的靶向药物载 体。 本发明用于巨噬细胞相关疾病靶向给药的药物载体的详细制法为
—、质粒的构建 培养的病毒经由RT-PCR，获得Vp6的编码基因。操作是
在正向引物(Ps: 5' ATCATATGGATGTT TTGTATTCA-3')禾P3'端反向引物 (PAs: 5' -ATCCGCGGAGCTCCACCGCGGTGGC-3')中分别引入限制性核苷酸内切酶 位点Ndel和Sacl(下划线)。VP6编码基因扩增反应体系为100微升，其中模板DNA(携 带RV VP6基因的质粒pTB-VP6)1微升；10XPCR缓冲液10微升；dNTPs(25mmol/L)2.5 微升；引物Ps(20pmo1/微升)和Pas(20pmo1/微升)各2微升；Taq酶(3U/微升)1.5微升， 灭菌超纯水81微升。PCR反应条件为94。C预变性3分钟；94。C变性30秒，56。C退火 30秒，72t:延伸反应40秒，共30个循环；最后72t:延伸IO分钟。VP6基因的PCR产 物经纯化后，用Nde I/Sac I双酶切，制备插入基因片段。表达质粒pET同样经Nde I/Sac I双酶切，制备载体基因片段。插入基因片段和载体基因片段经T4DNA连接酶连接后， 转化DH5a感受态细胞。经酶切鉴定，筛选阳性菌落，制备携带VP6编码基因的重组表 达质粒pET-VP6，并对重组表达质粒进行核苷酸序列测定。
二、蛋白的表达 经核苷酸序列测定证明准确无误后，将该重组质粒pET-VP6转化BL21(DE3)感 受态细胞，转化细胞涂于含Amp+LB培养基平皿中，37t:过夜培养。挑选阳性菌落接种 于含3ml(含氨苄青霉素)LB培养液试管中培养6h后，取50微升培养液，转于250ml LB 培养液中(含氨苄青霉素200微克/毫升)，于37t:(12 16小时)培养表达。4,000rpm/ min离心收集菌体，加超声裂解缓冲液(200mmol/LNaCl， 50mmoL/L Tris， 5%甘油，5% Triton X-IOO， 2mmol/LEDTA， lmmol/L DTr)悬浮，于冰水浴中超声破碎菌体。裂解液 经12,000rpm/min， 4°C， 30min离心，弃上清，沉淀(主要是包涵体蛋白)用8mol/L尿素 溶解后，分装保存于-20%冰箱。
三、重组表达VP6的SDS PAGE检测 取样品20微升，加5微升5倍样品变性缓冲液，10(TC煮沸5分钟，进行 SDSPAGE凝胶电泳(5X浓縮胶，12%分离胶)，电压60V。当溴酚蓝跑至凝胶底部时， 停止电泳。凝胶用考马斯亮蓝R250染色，脱色液[10% (V/V)醋酸，5X(V/V)乙醇]脱色。 四、VP6蛋白的纯化与复性 VP6蛋白的纯化溶解在8moL/L尿素中的包涵体蛋白经SDS-PAGE凝胶(5X
5的浓縮胶，10%的分离胶)分离，用150mmol/L KC1显色，切胶收集VP6所在位置的胶 条，胶条中的VP6蛋白经15X的SDS-PAGE凝胶柱回收至溶液中，在收集的含VP6蛋 白的溶液中加入20mmol/L的KCI除去SDS，用12%的PAGE检测纯化效果。VP6纯化 蛋白的复性实验将经纯化的VP6蛋白溶液稀释(蛋白浓度40.5mg/ml)，并向其中加入 尿素至浓度为8mol/L，同时加入含100mmol/LTris-Cl(pH8.5)， 10mmol/L GSH， lmmol/L GSSG， 2mmol/LEDTA， 50mmol/LDTT，在室温放置2 3h。将上述蛋白液装入透析袋 内，并置透析袋于装有复性液的烧杯中，4t:磁力搅拌透析。各复性液除尿素浓度分别为 6、 4、 2、 lmol/L不同外，其余各组成成分相同(100mmol/L NaCl、 50mmoL/L Tris-HCl、 lmmol/LGSSG、 lmmol/LGSH。 pH8.5)，每次透析8h，然后用10mmol/LPBS(含lmmo1/ L GSSG， lmmol/L GSH)pH7.4透析8h，之后更换大体积10mmol/L PBS(pH7.4)透析12h。 复性结束后将透析袋放入蔗糖中浓縮，浓縮后的样品离心去除沉淀，复性蛋白用非变性 及非还原凝胶电泳检测。 表达和纯化的蛋白如图l所示，从左往右的方向，第一泳道为蛋白分子量标 准(KD)，从上到下分别是97.4、 66.2、 43、 31、 20.1;第二和第四泳道都为在大肠杆菌 BL21(DE3)中表达的Vp6，可见在43KD附件出现表达的条带。第三泳道为纯化的蛋白； 第五泳道为未加表达质粒的大肠杆菌的对照。 复性的蛋白如图2所示，左边的为纯化的蛋白，右边的复性的蛋白，蛋白在复
性后迁移率降低。五、Western blot检测 蛋白经SDS-PAGE电泳分离后，电转移至(转移条件为恒流160mA， 1.5h)硝 酸纤维膜上；硝酸纤维膜在4。C封闭液[5% (w/V)脱脂奶粉/TBST(20mmol/L Tris-HCl， 150mmol/LNaCl， 0.05% Tween-20)]中封闭过夜；经与一抗豚鼠抗SA11抗血清(1 : 200 稀释)和二抗(山羊抗豚鼠IgG)l : 1,000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗豚鼠IgG反 应；最后用底物DAB(二氨基联苯胺四羟基盐酸)显色。 六、阿霉素通过EDC1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐反应交联 到蛋白Vp6上 复性后的Vp6按摩尔比为Vp6 : NHS(碳二亚胺)EDC :阿霉素=
l:5:2: i的比例，4。c反应48小时，反应后的样品装入透析膜(截留分子量
8000-14000)中进行透析，透析液为pH7.4的磷酸盐缓冲液，4。C透析48小时，其间每隔
12小时换液一次。 1)、阿霉素标记的检测 如图3a和图3b所示，用0.7%的琼脂糖凝胶电泳和表面拉曼增强光谱对标记的 蛋白进行检测。图3a所示的Vp6标记上阿霉素后，由于阿霉素本身带有红色，电泳后可 见Vp6的红色条带(图3左)，图3b所示的为同一块胶经考马斯亮蓝染色后，可见标记了 阿霉素的Vp6电泳比Vp6本身的蛋白电泳速度要稍慢，因为交联后蛋白分子量变大，且 所带负电荷减少。 本申请发明人还利用表面增强拉曼光谱对标记后的Vp6进行了检测。由于Vp6 本身没有拉曼信号，而阿霉素在经纳米银颗粒(20-100纳米)增强后有比较强的拉曼信 号。如图4所示，峰的归属为383 : S (C = 0) ; 453 : S (C = 0) ; 1230 : S (0-H);1266 : S (0-H) ; 1330 : ring stretch ; 1401 : ring stretch。
2)、阿霉素标记后蛋白的组装 透析后的带有阿霉素分子的Vp6蛋白在PBS磷酸盐缓冲液(pH3-PH7)中进行组 装4t:-3(TC， 2-20小时，组装完后在水中充分透析。
3)、组装后的表征 如图5a和图5b所示，分别用电镜和原子力显微镜对组装的病毒样颗粒进行形貌 表征，观察到30-80纳米的病毒样颗粒。 上述方法所制备的药物载体，通过免疫荧光实验检测Vp6-Dox病毒样颗粒在巨 噬细胞RAW和肺上皮细胞A549中的分布。
第一步、细胞的培养和预处理 Raw和A549在六孔板中生长成接近单层时，用PBS洗细胞3次，每次每孔2毫 升，用维持液(不加小牛血清的1640培养基)洗一次，每孔加入2毫升维持液，然后加入 IOO微升的Vp6-Dox病毒样颗粒，孵育3小时后，用25t:的PBS洗细胞，每次每孔2毫 升。 第二步、细胞的固定和复水 预处理好后的细胞在-201:预冷的无水甲醇中固定20分钟，依次在PBS配制的 70%， 30%， 10%预冷的乙醇中各复水10分钟，PBS洗三次，每次每孔2毫升。
第三步、细胞膜的透化处理 复水后的细胞用PBS配制的0.2%的Triton X-100进行透化处理，25。C处理5分 钟，用PBS洗三次，每次每孔2毫升。
第四步、免疫荧光检测 透化处理的细胞每孔加1 : 100(PBS稀释) 一抗(Vp6抗豚鼠血清，自制)200微 升，37t:孵育30分钟，PBS-T(加0.2X的Tween-20)洗5次，每次每孔2毫升，25。C摇床 3分钟，然后每孔加l : 400(PBS稀释)的二抗(FITC标记的山羊抗豚鼠IgG， Santa Cruz Biotechnology)200微升，37。C避光孵育30分钟，PBS-T(加0.2%的Tween-20)洗5次，每
次每孔2毫升，25t:摇床3分钟，荧光显微镜下观察。见图6和7。
观察的结果 图6A: Vp6-Dox病毒样颗粒和巨噬细胞孵育后，经一抗和FITC标记的二抗处
理，荧光显微镜下在细胞质中可见强烈的绿色荧光。图6B为阴性对照，没加Vp6-Dox
病毒样颗粒的巨噬细胞，经和A—样的处理后，荧光显微镜下没见到荧光。 图7A : Vp6-Dox病毒样颗粒和A549细胞孵育后，经一坑和FITC标记的二抗处
理，荧光显微镜下在细胞中没有荧光。图7B为对照，没加Vp6-Dox病毒样颗粒的A549
细胞，经和A—样的处理后，荧光显微镜下没见到荧光。
结论 以上检测及观察结果可知用原核表达体系表达的Vp6蛋白，通过EDC(l-乙 基_3_(3_二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐)反应在Vp6上交联阿霉素，在酸性条件下自 组装成病毒样颗粒。实验显示Vp6-Dox病毒样颗粒可进入巨噬细胞，不能进入A459细 胞，能对巨噬细胞特异性识别，这样的病毒样颗粒能成为优良的MAS和TAM相关疾病 的给药载体
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通过以上介绍可见本发明的靶向供药药物载体及其制法具有突出的优点
1、利用轮状病毒外壳蛋白自组装的特性，用基因工程的方法体外对蛋白进行操 作，并用化学修饰的方法对其进行药物交联，把药物修饰到中空的病毒样颗粒的内表面 和外表面，并利用病毒对巨噬细胞特异识别的能力，把药物输送到巨噬细胞中，这样可 降低药物的毒性，降低药物的用量，避免体内环境对药物的降解，达到靶向和缓释的功 能，降低用药成本，提高治疗效果。 2、现有的组装往往是在昆虫细胞中进行，这样得到的病毒样颗粒的量十分有 限，本发明用原核表达的方法，在大肠杆菌中高效表达了轮状病毒蛋白Vp6，并在体外 自组装成病毒样颗粒，可获得大量的蛋白，降低制造成本。 3、和其它的纳米靶向给药载体(脂质体、树枝状分子、嵌段共聚物、碳纳米管) 等相比，病毒蛋白毒性较小，安全性较高，体内容易降解。 4、利用轮状病毒外壳蛋白体外自组装和巨噬细胞靶向的特性，经化学修饰，可 把治疗性药物或示踪性药物定向到巨噬细胞。
权利要求
用于巨噬细胞疾病靶向供药的药物载体，其特征在于所述药物载体为对巨噬细胞有特异识别能力的轮状病毒外壳蛋白Vp6经原核表达、自组装而成的病毒样颗粒。
2. 根据权利要求1所述的用于巨噬细胞疾病靶向供药的药物载体，其特征在于所 述病毒样颗粒为中空结构，且其内表面或外表面化学修饰有药物分子。
3. 根据权利要求2所述的用于巨噬细胞疾病靶向供药的药物载体，其特征在于所述病毒样颗粒内表面或外表面通过化学修饰的药物为治疗性药物或示踪性药物，或两者 混合。
4. 权利要求1所述用于巨噬细胞疾病靶向供药的药物载体的制备方法，其特征在于首先提取A组轮状病毒的结构蛋白Vp6基因；然后将这些结构蛋白Vp6基因克隆到原核 表达载体；再在大肠杆菌BL21中进行表达；最后把表达的蛋白与药物分子进行交联，并组装成病毒样颗粒。
5. 根据权利要求4所述的用于巨噬细胞疾病靶向供药的药物载体的制备方法，其特征 在于所述结构蛋白Vp6包括猴的轮状病毒Vp6基因、猪的轮状病毒Vp6基因和人的轮 状病毒Vp6基因之一或多种混合。
6. 根据权利要求4所述的用于巨噬细胞疾病靶向供药的药物载体的制备方法，其特征 在于所述病毒样颗粒与药物的组装为体外组装。
全文摘要
本发明公开了一种用于巨噬细胞疾病靶向供药的药物载体及其制备方法，该药物载体为对巨噬细胞有特异识别能力的轮状病毒外壳蛋白Vp6经原核表达、自组装而成的中空病毒样颗粒，其内表面或外表面化学修饰有药物分子。其制法首先提取A组轮状病毒的结构蛋白Vp6基因；然后将这些结构蛋白Vp6基因克隆到原核表达载体；再在大肠杆菌BL21中进行表达；最后把表达的蛋白与药物进行交联，并组装成病毒样颗粒。本发明利用病毒样颗粒对巨噬细胞的特异性识别能力，把药物输送到巨噬细胞中实现靶向供药和缓释的功能，能有效降低药物的用量和毒性，避免体内环境对药物的降解，提高治疗效果；同时也能够实现大批量生产，降低制造成本。
文档编号A61K47/42GK101690822SQ200910183928
公开日2010年4月7日 申请日期2009年8月13日 优先权日2009年8月13日
发明者张智军, 赵庆欢, 黄洁 申请人:苏州纳米技术与纳米仿生研究所