专利名称：用于治疗疾病的靶向补体因子h的制作方法
技术领域：
00021 本申请涉及治疗牵涉补体旁路的疾病的组合物和方法。具体地，本
申请涉及治疗牵涉补体旁路的疾病的CR2-FH分子及其用途。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明00031 本申请是在由美国国立卫生研究院(the National Institutes of Health)
授予的授权(合同)号AI47469、 AI31105和EY13520的政府支持下进行的。
背景技术：
0004
补体是一系列血液蛋白质的总称，并且是免疫系统的主要效应子机
制。补体在许多自身免疫、炎症和缺血性疾病的病理学上起着重要作用，并且也 是造成许多与生物不相容性相关的疾病状态的原因。不适当的补体激活及其在宿 主细胞上的沉积由于产生强有力的炎症介质可导致补体介导的靶结构细胞溶解以 及组织破坏。 本文所引用的所有出版物、专利、专利申请和公布的专利申请的公
开内容通过引用以其全部在此被并入。
发明内容
00091 本发明一方面提供CR2-FH分子，其包括a)包含CR2或其片段的
CR2部分，和b)包含FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供CR2-FH 分子，其包括a)包含CR2或其片段的CR2部分，和b)包含FH或其片段的 FH部分，其中CR2-FH分子能结合CR2配体并且其中CR2-FH分子能抑制旁路途 径的补体激活。在一些实施方式中，提供的是分离的CR2-FH分子。在一些实施 方式中，提供的是包括CR2-FH分子的组合物(例如药物组合物)。在一些实施方式中，所述CR2部分和所述FH部分以融合蛋白的形式直接或间接地相互融合。 在一些实施方式中，所述CR2部分和所述FH部分通过化学交联剂被连接。在一 些实施方式中，所述CR2部分和所述FH部分是非共价连接的。OOlOj 在一些实施方式中，提供的是CR2-FH融合蛋白，其包括a)包括
CR2或其片段的CR2部分以及b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式 中，提供CR2-FH分子，其包括a)包含CR2或其片段的CR2部分以及b)包含 FH或其片段的FH部分，其中CR2-FH分子能结合CR2配体并且其中CR2-FH分 子能抑制旁路途径的补体激活。在一些实施方式中，所述CR2部分和所述FH部 分直接相互融合(即连接的)。在一些实施方式中，所述CR2部分和所述FH部 分通过氨基酸连接体序列连接。在一些实施方式中，所述CR2部分的C-末端与所 述FH部分的N-末端连接(直接或间接地)。在一些实施方式中，所述CR2部分 的N-末端与所述FH部分的C-末端连接(直接或间接地)。 在另一方面，提供的是药物组合物，其包括CR2-FH分子和药学上
可接受的载体。在一些实施方式中，所述药物组合物包括CR2-FH分子和适合于 给人施用的药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述药物组合物包括 CR2-FH分子和适合于眼内注射的药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述 药物组合物包括CR2-FH分子和适合于局部施用于眼睛的药学上可接受的载体。 在一些实施方式中，所述药物组合物包括CR2-FH分子和适合于静脉注射的药学 上可接受的载体。在一些实施方式中，所述药物组合物包括CR2-FH分子和适合 于注射到动脉(例如肾动脉)、肝或肾的药学上可接受的载体。
图8提供小鼠CR2的氨基酸序列(SEQ ID NO: 15)和小鼠FH的氨
基酸序列(SEQIDNO:16)。
0036] 图9提供示例性小鼠CR2-FH融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID
NO:17)和编码小鼠CR2-FH加上所述信号肽的示例性多核苷酸序列(SEQ ID NO:18)。
图15A提供如通过血清尿素氮(SUN)所测量的CR2-fH对肾功能
影响的图示。图15B提供CR2-fH对肾形态的影响的图示。图15C和15D提供用 小鼠C3的FTIC结合抗体温育的对照小鼠(15C)和CR2-fH治疗小鼠(15D)的 肾切片的免疫荧光染色结果。
0043
图16提供在用或没用CR2-fH治疗的小鼠中a-和b-波视网膜应答结果。
变体包括由于诱变的缘故氨基酸序列不同的融合蛋白。此外，
CR2-FH分子(例如融合蛋白)的生物等价类似物还可以通过对CR2部分和/或FH 部分中的残基或序列进行各种置换而构建。
10104
在一些实施方式中，CR2-FH分子，尤其是CR2-FH融合蛋白，在其
N-末端融合于信号肽。这样的信号肽用于CR2-FH分子的分泌。合适的信号肽包 括例如CD5蛋白质的信号(诸如人类CD5蛋白的信号肽 MPMGSLQPLATLYLLGMLVAS， SEQIDNO:ll)。在一些实施方式中，使用的 是CR2蛋白质的信号肽。例如，在一些实施方式中，使用的是人类CR2蛋白质的 信号肽 (MGAAGLLGVFLALVAPG ， SEQ ID NO:13 ， 或者 MGAAGLLGVFLALVAPGVLG， SEQIDNO:25)。
0 2-尸//分子游劍备 在一些实施方式中，宿主细胞是非人类宿主细胞。在一些实施方式
中，宿主细胞是CHO细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是293细胞。0114
CR2-FH分子可通过本领域中已知的各种方法进行分离。在一些实施
方式中，当CR2-FH分子是分泌到生长培养基中的融合蛋白时，该分子可直接从 该培养基中提纯。如果融合蛋白不是分泌的，它从细胞裂解物分离。细胞破碎可 以通过任何常规方法进行，包括冷冻-融循环、声波处理、机械破碎或使用细胞裂 解剂。CR2-FH分子能够通过各种方法获得。这些方法包括但不限于免疫亲和层析、 反相层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水作用层析、凝胶过滤层析和 HPLC。例如，CR2-FH分子可以使用识别CR2部分的抗体或者识别FH部分的抗 体或者两者通过免疫亲和层析进行提纯。在一些实施方式中，识别CR2的前两个 N-末端SCR结构域的抗体被用于提纯CR2-FH分子。在一些实施方式中，CR2-FH 分子通过离子交换层析进行提纯。 肽当被表达为融合蛋白时，可能或者可能没有被正确折叠。这些因
素决定了融合蛋白是否必须被变性和重折叠，以及如果这样的话，在切割之前或 之后这些方法是否被应用。当变性和重折叠是需要的时候，典型地肽用离液剂诸 如盐酸胍进行处理，然后在合适的比例、pH和温度下用氧化还原缓冲液进行处理， 所述氧化还原缓冲液含有例如还原的和氧化的二硫苏糖醇或谷胱甘肽，这样肽被 重折叠成其天然结构。
01161 本文所述的CR2-FH分子还可包含提纯用的标记(例如可切割的标
记)。该标记可被融合于CR2部分或FH部分的C-末端或N-末端，并且可用于帮 助蛋白质提纯。 CR2-FH分子可以釆用体外或体内试验测定它们的期望特性。例如，
CR2-FH与CR2配体的结合可以通过表面等离子共振法测定。举例来说，CR2-FH 与C3dg-生物素的相互作用的动力学分析可以采用在BIAcore 3000仪器(Biacore AB, Uppsala, Sweden)上进行的表面等离子共振(SPR)测量方法进行。人C3dg-生物素可以结合到BIAcore链霉抗生物素蛋白传感器芯片的表面上，这是通过将 C3dg-生物素注射在该芯片的一个液体池(flow cell)表面上而实现的。结合可以 在CR2-FH浓度范围内进行评价。CR2-FH分子与配体的联合可以监视一段时间(例 如120秒)，之后让该复合物在缓冲液的存在下解离仅仅另外的一点时间(例如 20秒)。CR2融合蛋白片段与C3dg-固定的液体池的结合可以根据与对照液体池 的结合进行校正。结合数据可以釆用BIA评价版本3.1软件(BIAcore)拟配(fit) 成1:1 Langmuir结合模型，并且对最佳拟配进行评价。所获得的动力学解离曲线 可用于借助BIA评价版本3.1程序(BIAevaluation Version 3.1 program)计算结合 和解离速率(on and off rates) (ka和kd)以及亲和常数(KD)。配体结合的其它试 验方法在本领域中是已知的并且也可以使用。
01191 体外酵母聚糖补体试验可用于测定CR2-FH分子的补体抑制活性。
兔红细胞在Mg-EGTA中被血清裂解是可以使用的另一种活性测量法。已经去除唾 液酸的人或羊红细胞在Mg-EGTA中的裂解提供另外的活性测量法。 在一些实施方式中，药物组合物包括CR2-FH分子以及适合于给人
施用的药学上可接受的载体。在一些实施方式中，药物组合物包括CR2-FH分子 以及适合于眼内注射的药学上可接受的载体。在一些实施方式中，药物组合物包 括CR2-FH分子以及适合于外部施用于眼睛的药学上可接受的载体。在一些实施 方式中，药物组合物包括CR2-FH分子以及适合于静脉内注射的药学上可接受的 载体。在一些实施方式中，药物组合物包括CR2-FH分子以及适合于注射到动脉 (例如肾动脉)内的药学上可接受的载体。 在一些实施方式中，提供的是治疗个体中涉及补体旁路的疾病(诸
如黄斑变性，例如AMD)的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH 分子的组合物，所述CR2-FH分子包括a)包括CR2或其片段的CR2部分和b) 包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供的是在具有其中涉及补体 旁路的疾病(诸如黄斑变性，例如AMD)的个体中抑制补体激活的方法，其包括 给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，所述CR2-FH分子包括a) 包括CR2或其片段的CR2部分和b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施 方式中，提供的是在具有其中涉及补体旁路的疾病(诸如黄斑变性，例如AMD) 的个体中抑制炎症的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的 组合物，所述CR2-FH分子包括a)包括CR2或其片段的CR2部分和b)包括 FH或其片段的FH部分。 在一些实施方式中，提供的是治疗(例如减少、延迟、消除或预防)
个体眼睛中玻璃疣形成的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，所述CR2-FH分子包括a)包括CR2或其片段的CR2部分和b)包 括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供的是治疗(例如减少、延迟、 消除或预防)个体眼睛中炎症的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括 CR2-FH分子的组合物，所述CR2-FH分子包括a)包括CR2或其片段的CR2部 分和b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供的是治疗(例如 减少、延迟、消除或预防)个体中感光细胞丧失的方法，其包括给所述个体施用 有效量的包括CR2-FH分子的组合物，所述CR2-FH分子包括a)包括CR2或其 片段的CR2部分和b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供的 是治疗(例如减少、延迟、消除或预防)个体中感光细胞丧失的方法，其包括给 所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，所述CR2-FH分子包括a)包 括CR2或其片段的CR2部分和b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方 式中，提供的是治疗(例如减少、延迟、消除或预防)与AMD相关的新血管形成 的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物,所述CR2-FH 分子包括a)包括CR2或其片段的CR2部分和b)包括HH或其片段的FH部分。 在一些实施方式中，提供的是治疗(例如减少、延迟、消除或预防)与AMD相关 的视网膜脱落的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合 物，所述CR2-FH分子包括a)包括CR2或其片段的CR2部分和b)包括FH或 其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供的是提高(包括例如减少、延迟或阻 止)个体眼睛中视力或视野丢失的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括 CR2-FH分子的组合物，所述CR2-FH分子包括a)包括CR2或其片段的CR2部 分和b)包括FH或其片段的FH部分。 在一些实施方式中，要治疗的疾病是缺血再灌注。缺血再灌注(I/R)
损伤涉及低氧组织再灌注后内皮和下面的软组织的炎性损伤。它是造成对各种组 织急性和慢性损伤的原因的常规综合症，所述各种组织包括例如心肌、中枢神经 系统、后(下)肢和肠。缺血再灌注可导致坏死和不可逆转的细胞损伤。补体途 径(包括补体旁路)是I/R损伤的主要介质。本文提供的方法因此可用于治疗发生 在任何器官或组织的缺血再灌注，其包括但不限于肠缺血-再灌注损伤、肾缺血-再灌注损伤、心脏缺血-再灌注损伤、其它内部器官诸如肺或肝缺血-再灌注损伤、 中枢神经系统缺血-再灌注损伤、肢或趾缺血-再灌注损伤、外伤引起的血容量不足 或者任何移植的器官或组织缺血-再灌注损伤。缺血-再灌注损伤也可与各种其它病 症一起发生，所述其它病症括但不限于中风、脊髓损伤、外伤引起的低血容量性 休克、以及自身免疫疾病诸如类风湿性关节炎(例如其可能由于滑膜的缺血性损伤而极大恶化)或者各种其它炎性疾病(炎症介导的疾病或者其中炎症是可能导 致或涉及缺血事件和再灌注的症状的疾病)。其中发生缺血再灌注损伤的其它病 症和疾病将是本领域技术人员所知的。 组合物的最佳有效量可凭经验确定并且将取决于疾病的类型和严重 性、给药途径、疾病进展以及个体的健康、质量和身体面积。该确定方法在本领 域技术人员的技能内。有效量也可基于体外补体激活试验确定。本文所述方法可 用的CR2-FH分子剂量的实例包括但不限于在下列之一的剂量范围内的有效量 约0.01 pg/kg至约300 mg/kg、或者约0.1 pg/kg至约40 mg/kg、或者约1 pg/kg至 约20mg/kg、或者约1 pg/kg至约10mg/kg。例如，当眼内给药时，组合物可以在 低微克范围内给药，包括例如约0.1 pg/kg或以下、约0.05 pg/kg或以下或者约0.01 Hg/kg或以下。在一些实施方式中，CR2-FH施用于个体的量为每剂量约lOpg至 约500 mg,包括例如下列之一每剂量约10 ng至约50 pg、约50 至约100吗、 约100 |xg至约200 pg、约200 至约300 ng、约300 (ig至约500吗、约500 至约1 mg、约1 mg至约10 mg、约10 mg至约50 mg、约50 mg至约100 mg、约 100 mg至约200 mg、约200 mg至约300 mg、约300 mg至约400 mg或者约400 mg 至约500 mg。0157
CR2-FH组合物可以以单一日剂量给药，或者总日剂量可以以每天两
次、三次、或四次的分剂量给药。组合物也可以比每天一次更少频率地给药，例 如一周六次、 一周五次、 一周四次、 一周三次、 一周两次、 一周一次、每两周一 次、每三周一次、 一月一次、每两月一次、每三月一次或每六月一次。组合物也 可以以持续释放的制剂给药，诸如植入物，其在一段时间内逐渐释放组合物使用， 并且其允许组合物以较少的频率给药，诸如一月一次、每2-6个月一次、每年一次 或者甚至一次性给药。持续释放装置(诸如小球、纳米颗粒、微粒、纳米球、微 球等)可以通过注射给予或手术移植在眼睛或与眼睛相关组织中的不同位置，诸 如眼内、玻璃体内、视网膜下、眼周、结膜下或眼球筋膜下(sub-Tenons)。
药物组合物可以单独或与其它分子一起给药，所述其它分子已知对
视网膜连接或损坏的视网膜组织具有有益作用，其包括能进行组织修复和再生和/ 或抑制炎症的分子。有用的辅因子的实例包括抗VEGF剂(如抗VEGF的抗体)、 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、睫状节神经细胞营养因子(CNTF) 、 axokine (CNTF的突变蛋白质)、白血病抑制因子(LIF)、向神经素3 (NT-3)、向神经 素-4(NT-4)、神经生长因子(NGF)、胰岛素样生长因子II、前列腺素E2、 30 kD存 活因子、牛磺酸和维生素A。其它有用的辅因子包括减轻症状的辅因子，其包括 杀菌剂、抗生素、抗病毒和抗真菌剂以及镇痛药和麻醉剂。
纖浙 因此，本发明包括治疗个体中本文所述的一种或多种疾病的方法，
其包括在允许CR2-FH分子发挥抑制补体激活作用的条件下在体外 (extracoporeally)(即在身体外部或者离体(e;c v/vo))用包括CR2-FH分子的 组合物处理个体的血液，并且将该血液返回到个体中。
单位剂量、制品及试剂盒
0171
还提供的是CR2-FH分子组合物的单位剂型，每剂包含约0.01 mg
至约50 mg的CR2-FH分子，其包括例如下列之一约0.1 mg至约50 mg、约1 mg 至约50 mg、约5 mg至约40 mg、约10 mg至约20 mg、或者约15 mg的CR2-FH 分子。在一些实施方式中，CR2-FH分子组合物的单位剂型包括大约下列任一 0.01 mg-0.1mg、 0.1 mg-0.2mg、 0.2 mg-0.25 mg、 0.25 mg-0.3 mg、 0.3 mg-0.35 mg、 0.35 mg-0.4 mg、0.4 mg-0.5 mg、0.5 mg-l.O mg、 10 mg-20 mg、20mg -50 mg、50 mg-80 mg、 80mg掘mg、 100mg-150mg、 150mg-200mg、 200mg-250mg、 250mg-300 mg、 300mg-400mg或者400mg-500mg的CR2-FH分子。在一些实施方式中，单 位剂型包括大约0.25 mg CH2-FH分子。术语"单位剂型"是指对于个体而言适合作 为单一剂量的物理上离散的单位，每一单位含有经计算产生期望治疗效果的预定 量的活性物质以及合适的药物载体、稀释剂或赋形剂。这些单位剂型可以以单个 或多个单位剂量储存在合适的包装中，并且还可进一步进行灭菌和密封。 图11提供CR2LFHFH——含有通过连接体序列连接到两个FH部分
的CR2部分的小鼠CR2-FH融合蛋白——的DNA序列(SEQ ID NO:20)。 [0179
图20提供人类CR2-FH融合蛋白(被称为人类CR2-fH或CR2fH)
的氨基酸序列(SEQ ID NO:21)和编码人类CR2-ffl加上信号序列的多核苷酸(SEQ ID NO:22)。 图13提供采用小鼠的带有连接体的CR2-FH融合蛋白(CR2LFH)、
不带连接体的CR2-FH融合蛋白(CR2NLFH)、带有连接体的CR2-FH-FH (CR2LFHFH)和CR2-Crry在体外酵母聚糖补体实验中获得的数据的图示。如该图 所示，CR2-FH在抑制旁路途径的补体激活方面比CR2-Crry更有效。CR2LFH和 CR2NLFH在抑制旁路途径的补体激活方面同等有效。CR2LFHFH比CR2LFH和 CR2NLFH有效得更多。
实施例3.通过CR2-FH治疗肠缺血和再灌注损伤
01861 该试验显示在小鼠模型中治疗肠缺血和再灌注损伤。
0187
厲欽i^"蘑注銜伤。三只8周龄且体重20-25g的成年雄性小鼠通过
腹腔注射用10mg/kg氯胺酮和6mg/kg甲苯噻嗪进行麻醉。动物自然呼吸并且整个
试验采用加热垫保持体温。进行中间剖腹术(medial laparotomy)并且将肠小心移动
以允许接近肠系膜上动脉。肠系膜上动脉用显微手术夹钳(Fine Instruments, USA)
夹住。缺血通过小肠的palor证实。假治疗的小鼠经历剖腹术，而没有夹住肠系膜
上动脉。30分钟缺血后，去除动脉夹允许肠系膜脉管系统再灌注。动物采用6.0爱惜邦缝合线(ethicon suture)进行缝合并且让其再灌注2小时。再灌注30分钟 后经静脉注射施用0.1 mg或0.05 mg CR2-fH或对照(PBS)，并且在总共2小时 的再灌注之后90分钟将动物处死。 蕴一织学。用于组织染色的组织样品取自肠，并且在4'C下固定在10%
福尔马林中过夜并且随后处理到石蜡中，或者在液氮中冷冻，进行免疫荧光分析。 来自每个动物的肠切片用苏木精和伊红进行染色，并且对粘膜损伤和绒毛重量进 行打分，如前所述(46)。简单地说，0分定为正常绒毛；末端畸变的绒毛为1分； 缺乏杯状细胞并且含有Gugenheims空间的绒毛为2分；上皮细胞鳞片状碎裂的绒 毛为3分；固有层暴露但完整且上皮细胞脱落的绒毛为4分；固有层渗出的绒毛 为5分；并且，最后，呈现出血的绒毛或者脱落的绒毛为6分。所有的组织学评 价是以盲式的方式进行的。 免;^^为。对于免疫荧光来说，肾的矢状切面在OCT化合物(Sakura
Finetek)中骤冷。4pm切片用低温恒温器切下并且储存在-7(TC下。载玻片随后用 丙酮固定，并且与小鼠C3的FITC结合抗体(Cappel)温育。与该抗体在室温下 杂交一小时后，载玻片用苏木精(Vector Laboratories, Inc.)复染色。试验结果显 示在图15C和15D中。如该图所示，相对于小鼠CR2-fH治疗的小鼠(15D)，更 多的C3沉积到假治疗的小鼠(15C)的肾上。
实施例5.通过CR2-FH治疗年龄相关性黄斑变性 用下列三个参数测量CR2-FH的作用机能活性(ERG和DC潜能，
即光感受器和RPE应答)、组织学和炎症测定(例如通过RT-PCR的基因表达以 及通过免疫组织化学的蛋白质表达)。 对于CNV损坏的评价，CNV大小在用同工凝集素B (其在内皮细胞
的表面上结合于末端B-D-半乳糖残基并且选择性地标记小鼠血管系统)染色的 RPE/脉络膜的平铺片制备物中进行测定。采用共聚焦显微术在2 pm切片上获取的 荧光测量被用于大小测定。简而言之，全部试验采用相同的激光强度设置获得整 个CNV损坏的Z堆积图像。对于每个切片，测定总荧光并相对于深度进行绘图。 [0207
对于视网膜电描记术，动物用甲苯噻嗪(20 mg/kg体重)和氯胺酮
(80 mg/kg体重)进行麻醉。瞳孔用一滴盐酸去氧肾上腺素(2.5%)和托吡卡胺 (1%)进行扩大。体温通过保持在37'C的DC驱动的加热垫进行稳定。所用的ERG 设置先前由Rohrer等，J. Neurosci.， 1999, 19(20): 8919-30描述，并且根据Lyubarsky 和Pugh Lyubarsky等，J. Neurosci.， 1996, 16(2):563-571构建。剌激光强度釆用中性 密度过滤器进行控制。刺激范例。让动物暗适应过夜并且将记录ERG。分析视网 膜杆(Rods)对增加光强度的单闪光刺激的应答。单闪光应答是平均至少三次闪 光，其中刺激间时间间隔(ISI)为15s至2min (分别从最低强度至最高)。不同 的ISI保证第一次和最后一次闪光之间给定强度下的ERG振幅是相同的。数据分析。对于所有ERG记录，a-波振幅是从基线至波谷测量；b-波振幅是从a-波波谷 或基线至b波的波峰测量；并且内隐时间(implicit times)从刺激开始至a-波波谷 或b-波波峰测量。 图16显示在用或没用CR2-fH治疗的小鼠中a-和b-波视网膜应答。
如图16所示，相对于PBS治疗，视网膜应答的a-和b-波被CR2-fH治疗行保护。 图17A和17B显示激光烧伤后6天损伤的同工凝集素-b染色。图17C显示基于同 工凝集素-b染色损伤大小的量化。如图17A-C所示，与用PBS治疗的动物相比， 用CR2-fH治疗的小鼠表现出损伤大小的显著降低。 小鼠CR2-fH对急性血管排斥的作用显示在图21中。如该图所示，
相比11.U1.6天(单剂量组)和10.7±1.3天(多剂量组)，对照心脏移植受者存 活7.1±1天。当与对照比较时，用小鼠CR2-fH治疗的小鼠的存活率有显著提高 (p=0.02)。
02151 在收获时任意组之间病理排斥特性或者抗供体的抗体水平方面没有 明显差别。令人感兴趣的是，当与单剂量组比较时，与施用多剂量小鼠CR2-fH相 关的存活率似乎没有明显提高(p<0.05)。实施例8.通过人类CR2-FH抑制补体旁路
0216
不包括信号肽的人类CR2-FH(SEQIDNO:21,也被称为CR2fH)和人
类CR2-FH2 (SEQ ID NO:23，也被称为CR2fH2)的蛋白质序列分别显示在图20和 21中。包括信号肽的核苷酸序列的人类CR2-FH(SEQIDNO:22)和人类CR2-FH2 (SEQIDNO:24)的核酸序列分别显示在图20和21中。 为了进一步证实采用CR2-FH所观察到的C3b沉积的抑制是由于补
体旁路的抑制所致，我们研究了在不存在经典途径(C4VC4-小鼠)下CR2-FH对 C3b沉积的作用。钙抑制了凝集素补体途径。图24显示了釆用来自C4VC4-基因 敲除小鼠的血清，小鼠CR2-FH在钙足量缓冲液中的滴定曲线。如该图所示，在 0.5吗~1浓度下CR2-FH明显抑制C3b沉积。
[02231 尽管为了清楚理解的目的，前述发明已经通过说明和实施例的方式
被详细地描述，进行某些微小的变化和修饰对本领域技术人员来说是明显的。因 此，说明和实施例不应当理解为对本发明范围的限制。
权利要求
1.CR2-FH分子，其包括a)包含CR2或其片段的CR2部分，和b)包含FH或其片段的FH部分，其中所述CR2-FH分子能结合CR2配体，并且其中所述CR2-FH分子能抑制旁路途径的补体激活。
2. 权利要求1的CR2-FH分子，其中所述CR2部分包括CR2的至少前两个 N-末端SCR结构域。
3. 权利要求1的CR2-FH分子，其中所述CR2部分包括CR2的至少前四个 N-末端SCR结构域。
4. 权利要求1的CR2-FH分子，其中所述FH部分包括FH的至少前四个SCR 结构域。
5. 权利要求1的CR2-FH分子，其中所述FH部分包括FH的至少前五个SCR 结构域。
6. 权利要求1的CR2-FH分子，其中所述CR2-FH分子包括两个或更多个FH部分。
7. 权利要求1的CR2-FH分子，其中所述CR2部分包括CR2的前四个N-末 端SCR结构域，并且所述FH部分包括FH的前五个SCR结构域。
8. 权利要求7的CR2-FH分子，其中所述CR2部分包括SEQ ID NO:l的氨 基酸23至271,并且所述FH部分包括SEQ ID NO:2的氨基酸21至320。
9. 权利要求l的CR2-FH分子，其中所述CR2-FH分子是融合蛋白。
10. 多核苷酸，其编码权利要求9所述的融合蛋白。
11. 载体，其编码权利要求10所述的多核苷酸。
12. 宿主细胞，其包含权利要求11所述的多核苷酸。
13. 药物组合物，其包括权利要求1的CR2-FH分子和药学上可接受的载体。
14. 权利要求13的组合物，其中所述组合物适于眼内、静脉内、动脉内、皮 下、气管内或吸入给药。
15. 治疗在个体中涉及补体旁路的疾病的方法，所述方法包括给所述个体施 用有效量的权利要求13所述的药物组合物。
16. 权利要求15的方法，其中所述涉及补体旁路的疾病是下列中任一种黄 斑变性、类风湿性关节炎、缺血再灌注、器官移植排斥、MPGN II、 HUS和狼疮 肾炎。
17. 权利要求16的方法，其中所述涉及补体旁路的疾病是年龄相关性黄斑变性。
18. 权利要求16的方法，其中所述涉及补体旁路的疾病是缺血再灌注。
19. 权利要求16的方法，其中所述涉及补体旁路的疾病是器官移植排斥。
全文摘要
本发明提供CR2-FH分子，其包括包含CR2蛋白质或其片段的CR2部分以及包含因子H蛋白质或其片段的FH部分，以及包括CR2-FH分子的药物组合物。还提供的是使用该组合物治疗疾病的方法，其中涉及补体旁路，例如年龄相关性黄斑变性、类风湿关节炎和缺血再灌注。
文档编号C07K14/435GK101563363SQ200780029458
公开日2009年10月21日 申请日期2007年6月21日 优先权日2006年6月21日
发明者B·罗雷尔, G·吉尔克森, S·汤姆林森, V·M·霍尔勒斯 申请人:南卡罗来纳医疗大学研究发展基金会;科罗拉多大学校董事会