专利名称：：内切糖苷酶EndoS用于治疗免疫球蛋白G介导的疾病的用途的制作方法内切糖苷酶EndoS用于治疗免疫球蛋白G介导的疾病的用途发明领域本发明涉及用于治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或疾患(例如自身免疫性疾病、移植排斥、手术后治疗和获得性血友病)的方法。
背景技术：
：IgG是包括通过二硫键结合在一起的两个重链和两个轻链的异四聚体，形成被柔性并对蛋白酶敏感的铰链区隔开的三蛋白结构域。两个相同的Fab部分结合抗原而单独的Fc部分负责效应功能，包括结合并活化补体因子Clq和白细胞上的Fc受体。除了多肽主链之外，Fc部分在每个重链上含有与Asn-297相连的保守的聚糖。这一寡糖具有以核心岩藻糖与最深处的W-乙酰葡糖胺(GlcNAc)相连的复杂二天线型。这些聚糖位于CH2结构域(重链的第二恒定结构域)间的界面上。EndoS是由人类病原体化脓性4连球菌(>S^e/7toco6n'/7少ogt7")分泌的内切糖苷酶。EndoS在两个核心GlcNAc残基间特异性地水解IgG上天冬酰胺连接的聚糖。与许多相关的需要糖蛋白底物变性或被糖蛋白底物变性加强的内切糖苷酶相比，EndoS只水解天然IgG。迄今没有发现EndoS的其他底物。发明概述本发明人表明了EndoS在治疗和预防由IgG抗体介导的疾病中是有用的。尤其是发明人表明了EndoS在人类血液中以及兔体内有效地水解IgG，经由EndoS的IgG的去糖基化取消了其在小鼠中引起关节炎的能力，以及EndoS在致死的TgG促使的特发性血小板减少性紫癜(TTP)的小鼠模型中具有保护性作用。病原抗体的EndoS预处理抑制这一疾病的发展，而且所述酶还在已出现严重的血小板减少和皮下出血时从已确定的疾病中解救小鼠。根据本发明，因此提供了EndoS多肽或编码EndoS多肽的多核苷酸在制备用于治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或疾患的药物中的用途。本发明还提供了-EndoS肽，或编码EndoS多肽的多核苷酸，以用于治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或疾患的方法中；-在需要其的受治疗者中治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或疾患的方法，所述方法包括对受治疗者施用治疗有效量的EndoS多肽，或编码EndoS多肽的多核苷酸；以及-离体处理采自患有由IgG抗体介导的疾病或疾患的患者的血液的方法，包括将所述血液与EndoS多肽接触。附图简述图1A是人类IgGl的结构模型。括号标明IgG的结合抗原的Fab部分和Fc效应子部分。箭头标明与重链的Asn-297相连的两个保守的聚糖。图IB是完全取代的IgG重链聚糖的图示。S2标明完全唾液酸化的糖形，GO和括号标明GO糖形的范围。LCA标明用于凝集素(lectin)实验的扁豆(o//z""m)凝集素(agglutinin)的结合位点而EndoS标明所述酶的切割位点。图2是来自不同化脓性链球菌血清型(马链球菌(Xe《M,)和兽疫链球菌(S.M(^/7,A/w,a^))的EndoS同系物的ClustalW氨基酸序列比对。抹系名称、种和M血清型示于左边。氨基酸同一性和相似性以灰色表示而共有序列在比对下方表示。框出了保守的几丁质酶基序并用比对下方的星号标记活性必需的谷氨酸。图3是EndoS的a结构i或和来自五/iza/)e^h力g7力附ew^2gYwe/7〃ca的EndoF2以及来自々1纟*斗袭才奉状斥干菌(CV^y"e6a"en'w淤/wew<iort//)en:M/^7、)的CP40的ClustalW氨基酸序列比对。蛋白名称示于左边。以灰色表示氨基酸同一性和相似性而共有序列在比对下方表示。框出了保守的几丁质酶基序并用比对下方的星号标记活性必需的谷氨酸。图4显示了EndoS的结构域组织。全长EndoS(SEQIDNO:2)的995个氨基酸的图示。Ss标明信号肽，标明了a-结构域中几丁质酶家族18活性位点基序并用箭头标明了产生两个结构域的SpeB切割位点。图5显示了对人类血液中EndoS活性的分析。图5A显示了对来自与逐渐增加浓度的重组EndoS(rEndoS)—起孵育的人类血液的纯化的IgG的SDS-PAGE分析。图5B显示了对来自与逐渐增加浓度的rEndoS—起孵育的人类全血的纯化的IgG的LCA凝集素印迹分析。图5C显示了对从与逐渐增加浓度的rEndoS—起孵育的人类血液纯化的IgG的凝集素印迹的光密度分析。图6显示了对兔中EndoS体内活性的分析。图6A显示了对来自在第一次静脉内注射500昭的rEndoS后于标明的时间点从兔采集的血清样品的纯化的IgG的SDS-PAGE(染色)和凝集素印迹分析(LCA印迹)。图6B显示了对来自在第二次施用rEndoS后于标明的时间点从兔采集的血清样品的纯化的IgG的SDS-PAGE(染色)和凝集素印迹分析(LCA印迹)。图6C显示了对来自在第三次施用rEndoS后于标明的时间点从兔采集的血清样品的纯化的IgG的SDS-PAGE(染色)和凝集素印迹分析(LCA印迹)。图7显示了兔抗体对rEndoS的反应。在第一次、第二次和第三次注射rEndoS后于标明的时间点从兔采集血清样品。在蛋白质印迹中，将所述血清作为第一抗血清，用于具有SDS-PAGE分离的纯化的rEndoS的不同的膜条上。图7A也显示了兔抗体对rEndoS的反应。血清样品与图7的相同。插图如图7中的使用第一次注射后的血清样品作为第一抗血清的蛋白质印迹。主图第一次、第二次和第三次注射后的血清样品用作使用固定EndoS进行的ELISA实验中的第一抗血清。抗EndoS的IgG的浓度(ng/ml)与第一次注射前的浓度相比出现增加。展示了一个代表性实验。图8显示了对与和不与EndoS孵育并通过10%的SDS-PAGE分离的IgG单克隆抗体(CIIC1和M2139)的SDS-PAGE(染色)和凝集素印迹分析(印迹)。通过考马斯蓝染色(染色)或通过对用GNL凝集素探测的膜的印迹(印迹)分析凝胶。CIICl(IgG2a)单克隆抗体与EndoS(泳道l)以及不与EndoS(泳道2)孵育；M2139(IgG2b)单克隆抗体与EndoS(泳道3)以及不与EndoS(泳道4)孵育。图9显示了来自用正常的和EndoS处理的CII结合抗体(a)M2139、(b)M2139D、(c)CIICl、(d)CIIC1D和(e)对照处理的大鼠的并染色的关节切片(10pm)。；改大倍率为x10。用EndoS去糖基化的抗体标明为"D"。对1-2日龄的新生大鼠腹膜内注射]mg的CII结合抗体(正常的和EndoS处理的)。抗体传输二十四小时后将爪解剖并在OCT化合物中用异戊烷和干;水迅速冷冻。用生物素化的抗小鼠k(187.1)抗体和HRP辄合的第二抗体作为检测系统用标准实验方案进行免疫组织化学分析。图10显示了接受未处理的或EndoS处理的抗CII单克隆抗体的小鼠中关节炎的发生率(a)和严重度(b)。在0天用9mg未处理的(n-7)或EndoS处理的(11=5)抗CIT单克隆抗体(M2139和CIICl)注射雄性(BALB/cXB10.Q)Fl小鼠组。在第5天用50貼的大肠杆菌(7丄Y//)LPS腹膜内注射所有小鼠。将所有小鼠用于计算。误差条线标明平均值土SEM。图11显示了接受未处理的或EndoS处理的抗CII单克隆抗体的小鼠中关节炎的发生率(a)和严重度(b)。在0天用9mg未处理的(11=11)或EndoS处理的(11=12)抗CII单克隆抗体(M2139和CIIC1)注射雄性B10.RIII小鼠。在第5天用50吗的大肠杆菌LPS腹膜内注射所有小鼠。将所有小鼠用于计算。误差条线标明平均值士SEM。图12显示了补体成分Clq在(a)使用不同浓度的正常(BALB/cxB10.Q)Fl血清的CII包被的抗体结合板上；和(b)以0.25。/。的正常(BALB/cxB10.Q)Fl血清直接抗体包被的板上的沉积。误差条线标明平均值土SD。图13显示了补体成分C3b在(a)使用不同浓度的正常(BALB/cxB10.Q)F1血清的CII包^皮的抗体结合板上；和(b)以0.125。/。正常(BALB/cxB10.Q)F1血清直接抗体包被的板上的沉积。误差条线标明平均值士SD。图14显示了单克隆抗体的去糖基化对嗜中性粒细胞(PMNL)氧化猝发的影响。将正常的(M2139或CIIC1)或去糖基化的(M2139-D或CIIC1-D)单克隆抗体包被在羧化聚苯乙烯微粒(lpm)上。在将来自肝素化的全血样品的PMNL与抗体包#皮的珠孵育后使用FACS测定它们的氧化猝发能力。结果是来自每组中5只小鼠的平均值。使用了具有三种不同基因型的B10.Q小鼠(FcgR+/+、FcgRV-和FcgR+/-)。"培养基，，和"珠"组构成两组不同的阴性对照。PMA组是阳性对照。用RB6-APC辄合物识别PMNL。图15显示了在静脉内(第1天和第5天)传输9mg的单克隆抗体混合物(M2139和CIICl或M2139D和CIIC1D)的B10.RIII小鼠的血清中通过ELISA测量的抗CII抗体的水平。使用多标记计数仪(VICTOR1420，Wallac)测量平均铕荧光单位。图16显示了病原IgG抗体的EndoS预处理抑制了小鼠中抗体介导的血小板减少。图片A:雌性BALB/c小鼠(11=3)接受腹膜内注射的兔抗小鼠血小板IgG(aPLT-IgG)。每隔一定间隔采集血液样品并用流式细胞术测定血小板计数。图片B:用已用GST-EndoS(11=4)或GST(11=4)预处理的aPLT-IgG注射的BALB/c小鼠的存活标绘图。图片C:通过流式细胞术对来自已接受GST-EndoS预处理的aPLT-IgG的小鼠的血液样品测定的随时间的血小板计凄t。图17显示了EndoS从致死的IgG介导的血小板减少解救小鼠。图片A:用aPLT-IgG注射并且随后在施用aPLT-IgG3小时后用GST-EndoS(n=8)或GST0=8)处理的BALB/c小鼠的存活标绘图。图片B:从注射aPLT-Ig24、48或72(仅GST-EndoS处理)小时后GST-EndoS或GST-处理的小鼠纯化的IgG的SDS-PAGE分析(染色)和LCA凝集素印迹分析(LCA印迹)。图片C:在接受GST-EndoS处理的小鼠中每隔一定间隔采集血液样品并用流式细胞术测定血小板计数。图片D:注射aPLT-Ig并随后在出现明显的腹内出血迹象时(施用aPLT-Ig后5-7h)用GST-EndoS(>=7)或GST0=7)处理的BALB/c小鼠的存活标绘图。序列筒述SEQIDNO:1是从化脓性链球菌API分离的EndoS的氨基酸序列。SEQIDNO:2是从化脓性链球菌API分离的EndoS的氨基酸序列，包括信号序列。SEQIDNO:3是从化脓性链球菌API分离的编码EndoS的核酸序列，包括信号序列。发明详述法包括对受治疗者施用EndoS多肽或编码EndoS多肽的多核苷酸。本发明人发现EndoS在人类血液中以及兔体内水解IgG,经由EndoS的IgG的去糖基化取消了其在小鼠中引起关节炎的能力，以及EndoS在致死的IgG促使的特发性血小板减少性紫癜(FTP)的小鼠模型中具有保护性作用。病原抗体的EndoS预处理抑制了这一疾病的发展，而且所述酶还在已出现严重的血小板减少和皮下出血时从已确定的疾病中解救了小鼠。因此，EndoS可用于治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或疾患。多肽EndoS多肽优选为化脓性链球菌EndoS或保留了IgG内切糖苷酶活性的化脓性链球菌EndoS的变体或片段。所述变体可是来自另一生物体例如另一细菌的EndoS多肽。所述细菌优选为链球菌例如马链球菌、兽疫链球菌或优选地化脓性链球菌。可选地，所述变体可来自假结核棒状杆菌例如CP40蛋白；粪肠球菌(7"teracoccw/i7eca/"')例如EndoE蛋白；或五/^^^/汝/"g/amem"gm'ep/,ca(以前称为月亩月莫脓毒性黄杆菌(^7av(/)t7c&nww2mem'"gosepO'CMW))例"^口EndoF2蛋白。来自不同4匕脓'f生链球菌血清型以及来自马链球菌和兽疫链球菌的EndoS变体的序列示于图2。图3显示了EndoS的a结构i或和来自￡7/za6w//h"g,'aww'"go,s'e/〃c;a的EndoF2以及来自假结核棒状杆菌的CP40的比对。EndoS多肽可含有(a)SEQIDNO:1的氨基酸序列；(b)与SEQTDNO:1的氨基酸序列具有至少50%的同一性并具有IgG内切糖苦酶活性的其变体；或(c)具有IgG内切糖苷酶活性的其任一片段。优选地，所述多肽含有或由SEQIDNO:1的序列组成。SEQIDNO:1是没有信号序列的成熟形式的EndoS的序列，并相应于SEQIDNO:2的氨基酸37至995。此外多肽可包含信号序列。因此EndoS多肽可含有(a)SEQIDNO:2的氨基酸序列；(b)与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少50%的同一性并具有IgG内切糖苷酶活性的其变体；或(c)具有IgG内切糖苷酶活性的其任一片段。EndoS多肽可由SEQIDNO:2中所示的序列组成。变体多肽是氨基酸序列与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2中的序列不同但保留了与EndoS相同的本质特征或基本功能性的那些多肽。因此变体多肽可显示出IgG内切糖苷酶活性。通常，与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列具有大于约50%、55%或65%的同一性，优选至少70%、至少80%、至少90%并尤其优选至少95%、至少97%或至少99%的同一性的多肽被认为是所述蛋白的变体。只要所述肽保留了EndoS的基本功能性，这些变体可包含等位基因的变体和蛋白序列中单个氨基酸或氨基酸组的缺失、修饰或添加。可在SEQIDNO:1或SEQIDNO:2中所示序列的至少100、至少250、至少500、至少750、至少800、至少850、至少900、至少950、至少955或更多连续氨基酸的区域上或更优选地在SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的全长上测量SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的变体的同一性。可使用任何适合的算法计算氨基酸同一性。例如UWGCG包提供了可用来计算同源性(例如在其默认设置上使用)的BESTFIT程序(Devereux等人(1984)WMc/e,c^c/AWewar/12，387-395)。PILEUP和BLAST算法可用于计算同源性或比对(lineup)序列(例如鉴定相等或相应的序列(通常在他们的默认设置上))，例如，如AltschulS.F.(1993)JMolEvol36:290-300;Altschul,S，F等人(1990)JMolBiol215:403-10中所描述的。进行BLAST分析的软件是可通过NationalCenterforBiotechnologyInformation(美国国家生物技术信息中心)(http:〃丽w.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得的。这一算法包括首先在查询序列中通过鉴定长度W的短字(其在与数据库序列中同等长度的字比对时匹配或满足某个正值的阈值分T)鉴定高分序列对(HSP)。T被称为相邻字得分阈值(Altschul等人，同上)。这些最初的相邻字匹配(hits)起到用于开始搜索以找到含有它们的HSP的种子的作用。只要累积的比对得分可增加就将字匹配沿每一个序列向两个方向延伸。当累积的比对得分从其达到的最大值下降数量X;由于一个或多个负分残基比对的积累，累积得分变为零或以下；或到达任一个序列的末端时，停止字匹配在每个方向上的延伸。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的敏感度和速度。BLAST程序使用字长(W)11,BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1992)Prac.Ato/./JcW.USA89:10915-10919)比对(B)50，期望值(E)10，M=5,N=4和对比两条链为默认值。BLAST算法在两序列间进行相似性的统计分析；参见，例如Karlin和Altschul(1993)7>oc.爿cadUSA90:5873-5787。由BLAST算法提供的一个相似性尺度是最小和概率(P(N)),其提供了在两个多核苷酸或氨基酸序列之间的匹配随机发生的概率的标示。例如，如果在一序列和另一序列的比较中最小和概率小于约1，优选地小于约O.l，更优选地小于约0.01并且最优选地小于约0.001，那么认为第一序列与第二序列相似。通常变体序列相差至少l、2、3、5、10、20、30、50、100或更多突变(其可是氨基酸的取代、缺失或插入)。例如，可形成从1至100、2至50、3至30或5至20个氨基酸的取代、缺失或插入。修饰的多肽通常保留作为IgG特异性内切糖苷酶的活性。取代优选地是(例如依照下表的)保守的取代。第二列中同一区中的氨基酸以及优选地第三列中同一行中的氨基酸可互相取代<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>SEQIDNO:1的氨基酸序列的变体优选地含有SEQIDNO:1的残基191至199,即SEQIDNO:1的Leu-191、Asp-192、Gly-193、Leu-194、Asp-195、Val-196、Asp-197、Val-198和Glu-199(其对应于SEQIDNO:2的残基227至235，即SEQIDNO:2的Leu-227、Asp-228、Gly-229、Leu-230、Asp隱231、Val-232、Asp隱233、Val-234和Glu-235)。这些氨基酸构成了以谷氨酸结尾的完美的几丁质酶家族18活性位点。几丁质酶活性位点中的谷氨酸对酶促活性来说是必须的。因此最优选地，SEQIDNO:1的变体含有SEQIDNO:1的Glu-199而SEQIDNO:2的变体含有SEQIDNO:2的Glu-235。假如SEQIDNO:1的变体含有SEQTDNO:1的Glu-199,那么所述变体可含有具有一个或多个保守性耳又代的SEQIDNO:1的残基191至199。可选择地，假如SEQIDNO:2的变体含有SEQIDNO:2的Glu-235,那么所述变体可含有具有一个或多个保守性取代的SEQIDNO:2的残基227至235。用于本发明的EndoS多肽的片段通常为至少10例如至少20、30、40、50或更多个氨基酸长度直至100、200、250、300、500、750、800、850、900、950或955个氨基酸长度，只要其保持EndoS的IgG内切糖苷酶活性。优选地，用于本发明的EndoS多肽的片段包含SEQIDNO:1的残基191至199，即SEQIDNO:1的Leu-191、Asp-192、Gly-193、Leu画194、Asp-195、Val匿196、Asp-197、Val-198和Glu-199(SEQIDNO:2的残基227至235，即SEQIDNO:2的Leu-227、Asp-228、Gly-229、Leu-230、Asp-231、Val-232、Asp-233、Val-234和Glu-235)。SEQIDNO:2的优选片段由SEQIDNO:2的氨基酸37至995即SEQIDNO:1组成，其相应于去除信号肽后的由化脓性链球菌分泌的EndoS形式。本发明的另一个优选片段由SEQIDNO:1的氨基酸1至409(SEQIDNO:2的氨基酸37至445)组成，其相应于通过链球菌半胱氨酸蛋白酶SpeB切割产生的EndoS的酶学活性a结构域。用于本发明的多肽可被化学修饰，例如翻译后修饰。例如它们可一皮糖基化、磷酸化或含有修饰的氨基酸残基。它们可通过添加组氨酸残基以帮助它们纯化或通过添加信号序列以促进对细胞膜的插入来修饰。这些修饰的多肽属于本文所用的术语"多肽"的范围。通常，依照本发明使用的多肽表现出免疫球蛋白内切糖苷酶活性尤其是IgG内切糖苷酶活性。优选地，所述多肽水解IgG的天冬酰胺连接的聚糖的P-l,4-二-7V-乙酰壳二糖核。优选地，所述活性是对IgG特异性的。内切糖普酶活性可通过适当的测定方法测定。例如可将测试多肽与IgG在适当的温度例如37。C醉育。之后可通过SDSPAGE分析起始材料和反应产物。通常如果测试多肽具有IgG内切糖普酶活性，则IgG重链的分子量被减少约3kDa。另一种用于测定测试多肽是否具有IgG内切糖苷酶活性的测定是经由使用扁豆凝集素(LCA),可选择地使用辣根过氧化物酶和过氧化物酶底物的糖基化IgG的检测。通常，如果测试多肽具有IgG内切糖苷酶活性，则糖类信号被减小。另一种用于测定测试多肽是否具有IgG内切糖苷酶活性的测定是通过将测试多肽与纯化的IgG的Fc片段孵育，之后用lOmM二硫苏糖醇还原样品并用质i普法(MALDI-TOF)分析。通常如果测试多肽具有IgG内切糖普酶活性，则单体IgG的Fc的质量被减少1417±14Da。多肽的内切糖苷酶活性可通过抑制研究被进一步表征。多肽的内切糖苷酶活性通常是IgG特异性的，因为当与这些免疫球蛋白在允许切割IgG的条件下孵育时，所述多肽不能降解其他类型的Ig,即IgM、IgA、IgD和IgE。EndoS多肽具有水解待治疗的受治疗者中存在的IgG分子的能力。因此，当受治疗者是人类时，EndoS多肽能够水解人类IgG。EndoS能够水解所有四个亚类的人类IgG(IgGw)。在优选的实施方案中，EndoS多肽具有水解人类、猕猴、小鼠、大鼠、兔、马、山羊、犬和猪IgG的能力。用于本发明的多肽可以M本上分离的形式。应当理解的是多肽可与不千扰所述多肽的预期作用的载体或稀释剂混合并依旧被认为是基本上分离的。用于本发明的多肽还可以是大致纯化的形式，在这种情况下其将通常在制品中含有所述多肽，其中制品中多于50%,例如多于80%、90%、95%或99%重量的多肽是本发明的多肽。用于本发明的多肽可从表达EndoS多肽或EndoS多肽变体的任何适当的生物体中分离。通常，EndoS多肽从适当的链球菌的EndoS表达菌林，优选地化脓性链球菌的菌抹中分离。适当的生物体和菌林可通过许多技术鉴定。例如，最初可测试化脓性链球菌菌抹的m/必基因的存在。可以例如SEQIDNO:1、2或3为基础设计多核苷酸引物或探针。之后可通过使用了这样的引物的PCR或通过探针与所述化脓性链球菌菌林的基因组DNA杂交证实"基因的存在。可通过测定培养物上清液中IgG内切糖香酶活性或通过使用针对EndoS的抗体进行免疫检测来鉴定表达活性EndoS或其变体的链球菌菌林。已被证实为表达活性EndoS的链球菌菌抹是化脓性链球菌Ml血清型菌林AP1和SF370、马链球菌菌抹4047和兽疫链球菌菌抹H70。此外，在下列化脓性链球菌菌抹中发现了m/^V基因Ml血清型菌抹SSI-1和MGAS5005、M2血清型菌4朱MGAS10270、M3血清型菌4朱MGAS315、M4血清型菌抹MGAS10750、M5血清型菌抹Manfredo、M6血清型菌抹MGAS10394、M12血清型菌抹MGAS9429、M18血清型菌抹MGAS8232、M28血清型菌抹MGAS6180和M49血清型菌林591。从表达的化脓性链球菌培养物或从表达EndoS的其他细胞的培养物分离和纯化EndoS通常是以IgG内切糖苷酶活性为基础的。优选地纯化方法包括^J臾铵沉淀步骤和离子交换层析步骤。根据一种方法，通过加入逐渐增加量的石充酸铵分级培养基。硫酸铵的量可为10%至80%。优选地用50%的硫酸铵分级培养基，并将所得上清液用70%的硫酸铵进一步沉淀。之后粒状沉淀的多肽可经历离子交换层析，例如通过MonoQ柱上的FPLC。可测定洗脱级分的IgG内切糖苷酶活性并收集峰值活性的级分。可通过SDSPAGE分析级分。可将级分贮存于-80。C。在可选择的纯化EndoS的方法中，使用GST基因融合系统(Amersham-PharaiaciaBiotech,Uppsala，Sweden)在大肠杆菌中表达没有信号序列的EndoS(即，具有SEQIDNO:1的序列)。使用具有5awHI位点(下划线的)的引物5'-ACT-GGG-ATC-CCG-GAG-GAG-AAG-ACT-3'和具有ZZoI位点(下划线的)引物5'隱TTA-ATC隱TCG-AGG-TTG-CTA隱TCT-AAG-3'从化脓性链球菌基因组DNA扩增覆盖mf必序列的碱基304至3232的2929碱基对的PCR产物。将这一片段用SawHI和消化并连接至pGEX-5X-3产生用于转化大肠杆菌BL21(DE3)pLys的质粒pGEXwfoS。用O.lmM异丙基卩-D-硫代半乳糖吡喃糖苷诱导pGEXwcfo57BL21(DE3)pLys。诱导后，用BugBusterTM(Novagen)裂解细菌并在谷胱甘肽-琼脂糖凝胶(Glutathione-Sepharose)上纯化GST-EndoS融合蛋白。才艮据实验方案(Amersham-PharmaciaBiotech)使用因子Xa去除GST标记并用Xarrest琼脂糖(Novagen)去除剩余的因子Xa。这产生了均质的重组EndoS(rEndoS)的制品，如通过SDS-PAGE和使用EndoS特异性抗体的蛋白质印迹所估定的。体内实马全之前通过0.2的过滤器(Millipore)灭菌过滤蛋白样品。将纯化的EndoS蛋白于-8(TC贮存于磷酸盐緩沖盐水中。本发明使用的多肽还可被制备为这些分离的多肽的片段。此外，还可合成性地或通过重组的方法制得所述EndoS多肽。例如，可通过用含有与适当的控制序列可操作地相连的编码所述多肽的核苷酸序列的表达载体转染培养中的哺乳动物细胞，培养细胞，提取并纯化由细胞产生的EndoS多肽来生产重组EndoS多肽。用于本发明的多肽的氨基酸序列可被修饰以含有非天然存在的氨基酸或增加化合物的稳定性。当通过合成的方法生产多肽时，可在生产过程中引入这些氨基酸。多肽还可在合成或重组生产后被修饰。还可用D-氨基酸生产用于本发明的多肽。在这样的情况中，氨基酸将以C至N的反向的顺序连接。对于生产这种多肽来说，这在本领域中是常规的。在本领域中许多侧链修饰是已知的而且可用于EndoS多肽的侧链，只要多肽保留IgG内切糖苷酶活性。多核苷酸编码EndoS多肽或变体的多核苷酸可用于治疗或预防由病原IgG抗体介导的疾病或疾患。特别地，多核苷酸可包括或由下列物质组成(a)SEQIDNO:3的编码序列；(b)由于遗传密码而对于如(a)中所定义的序列为简并的序列；(c)与如(a)或(b)中所定义的序列具有至少60%同一性并编码具有IgG内切糖苷酶活性的多肽的序列；或(d)如(a)、(b)或(c)中所定义的序列中的任何一个的片段，其编码具有TgG内切糖苷酶活性的多肽。通常，多核苷酸是DNA。但多核苷酸可以是RNA多核苷酸。多核苷酸可以是单链或双链并可包括合成的或修饰的核苷酸。本发明的多核苷酸通常可与SEQIDNO:3的编码序列或编码序列的互补序列在显著高于背景的水平上杂交。例如，由于DNA文库中存在的其他DNA，可发生背景杂交。本发明的多核苷酸和SEQIDNO:3的编码多核苷酸和SEQIDNO:3的编码序列之间相互作用强度的至少10倍，优选地至少100倍。可通过例如放射性标记探针(诸如用32P)测量相互作用强度。通常可使用中至高严格度的条件实现选择性的杂交。但可在本领域已知的任何适合的条件下进行这种杂交(参见Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆实验室手册)，1989)。例如，如果需要高严格度，那么适合的条件包括于60'C直到65。C下从0.1至0.2xSSC。如果需要较低的严格度，那么适合的条件包括于6(TC下2xSSC。可通过核苦酸耳又代(例如/人1、2或3至10、25、50、100、200、500或750个取代)》务饰SEQIDNO:3的编码序列。可通过一个或多个插入和/或缺失和/或通过任一或两端的延伸可选择地或另外地修饰SEQIDNO:3的多核香酸。还可包括附加序列例如信号序列。修饰的多核苦酸通常编码具有IgG特异性内切糖苷酶活性的多肽。如例如上文表中所示，可进行简并取代和/或进行当修饰的序列被翻译时产生保守性氨基酸取代的取代。能够与SEQIDNO:3的DNA编码序列的互补序列选择性地杂交的核香酸序列通常与SEQIDNO:3的编码序列在至少20，优选地至少30,例如至少40、至少60、至少100、至少200、至少500，更优选地至少750个相连核苷酸的区域中或最优选地在SEQIDNO:3的全长或编码具有SEQIDNO:1或2中所示序列的多肽的SEQIDNO:3长度中具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性。可通过任何适合的方法(例如如前文描述的)测定序列同一性。可用上文提及的序列同一性程度和最小大小的任何组合定义本发明的多核香酸，同时更严格的组合(即在较长的长度上较高的序列同一性)是优选的。因此，例如和在500个核苷酸上具有至少95%序列同一性的多核苷酸一样，在60,优选地100个核苷酸上具有至少90%序列同一性的多核苷酸形成本发明的一个方面。多核苷酸片段优选地为至少20，例如至少25、至少30或至少50个核苷酸长度。通常它们将多达100、150、250或500个核苷酸长度。片段可长于500个核普酸长度，例如多达600、700、800、900、1000、1500、2000、2500或3000个核苷酸长度，或者甚至直到缺少SEQIDNO:3编码序列的很少的核苷酸例如5、10或15个核苷酸。用于本发明的多核苷酸。还可通过标准技术克隆它们。多核苷酸通常以分离和/或纯化的形式提供。通常，通过合成的方法生产短的多核苷酸，所述方法包括一次一个核香酸的逐步制备所需核酸序列。在本领域中，使用自动化技术完成这一方法的技术是很容易获得的。通常使用重组方法例如用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术生产较长的多核苷酸。这包括制备需要克隆的基因区域的一对引物(例如约15-30个核香酸)，将引物与从细菌细胞获得的DNA相接触，在发生所需区域的扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)并回收扩增的DNA。可将引物设计为含有适当的限制性酶识别位点，以便可将扩增的DNA克隆至适合的克隆载体中。这些技术可被用来获得本文描述的m/oS基因序列的全部或部分。尽管通常本文所提及的技术是本领域熟知的，还是特别引用了Sambrook等人(1989)。如本文所描述的EndoS多核苷酸在用于本发明的多肽的生产中有用，其可在体外、体内或离体进行。多核苷酸本身可用作治疗剂或可用于重组蛋白合成。通常将用于本发明的多核苷酸并入重组的可复制载体中。载体可用于在相容的宿主细胞中复制核酸。因此可通过将EndoS多核苷酸引入可复制载体，将所述载体引入相容的宿主细胞并在发生载体复制的条件下培养宿主细胞来制备用于本发明的多核苷酸。宿主细胞可以是例如大肠杆菌细胞。优选地载体是含有编码EndoS多肽的核酸序列的表达载体。这种表达载体通常在分子生物学领域中被常规地构建并可例如包括使用质粒DNA和适当的起始密码子、启动子、增强子和其他元件，例如诸如加A信号，它们为使蛋白表达所必需的并以正确方向安置。对本领域的技术人员来说其他适合的载体是清楚的。作为这一方面进一步的实例我们引用Sambrook等人(1989)。优选地，载体中用于本发明的多核香酸被可操作地连接于能够提供通过宿主细胞表达编码序列的控制序列，即载体是表达载体。术语"可操作地连接"意指毗邻，其中所描述的组分所处的关系允许它们以它们预期的安置"可操作地连接"于编码序列的调节序列例如启动子。载体可以是例如具有复制起点、可选择地表达所述多核苷酸的启动子和可选择地所述启动子的调节子的质粒、病毒或噬菌体载体。载体通常适应于体内使用。启动子和其他表达调节信号可选择为与针对其设计表达的宿主细胞相容。可使用哺乳动物启动子例如P-肌动蛋白启动子。组织特异性启动子是尤其优选的。还可使用病毒启动子例如莫洛尼氏鼠白血病病毒长末端重复序列(MMLVLTR)、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、SV40启动子、人类巨细胞病毒(CMV)IE启动子、腺病毒、HSV启动子(诸如HSV正启动子)或HPV启动子，尤其是HPV上游调节区(URR)。本领域中可容易地获得病毒启动子。载体可进一步包括侧翼于所述多核苷酸的序列，产生含有与真核基因组序列优选哺乳动物基因组序列同源的序列的多核苷酸。这将允许将本发明的多核苷酸通过同源重组引入真核细胞的基因组。特别是，含有具有侧送至哺乳动物细胞的病毒载体。适合的病毒载体的其他实例包括单纯疱疹病毒载体和包括慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒和HPV病毒的逆转录病毒。使用这些病毒的基因转移技术是本领域技术人员已知的。逆转录病毒载体例如可用于稳定地整合多核普酸，导致多核苷酸进入宿主基因组。相比之下复制缺陷型腺病毒载体保持游离并因此允许瞬时表达。疾病和疾患EndoS多肽或多核苦酸可用于治疗或预防由病原IgG抗体介导的疾病或疾患。本领域中所熟知的是许多不同的疾病和疾患的发病机理涉及IgG抗体。本发明人发现可使用EndoS多肽或多核苷酸抑制这类疾病中病原IgG抗体的作用。所述疾病或疾患可以是自身免疫性疾病。这类疾病包括艾迪生病、斑壳、强直性脊柱炎(ankylosingspondilitis)、抗磷脂综合征、再生障碍性贫血、自身免疫性胃炎、自身免疫性听力丧失、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性甲状旁腺功能减退症、自身免疫性垂体炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴增生综合征、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性多内分泌腺病、白塞氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、丘-施二氏综合;f正(Churg-Strausssyndrome)、腹月空疾病(coeliacdisease)、克罗恩病、CREST综合征、德戈斯病(Degosdisease)、获得性大疱性表皮松解症、原发性混合型冷球蛋白血症、巨细胞动脉炎、肾小球肾炎、古德帕斯丘综合征、格雷夫斯病、格林-巴利综合征(Guillan-Barresyndrome)、桥本曱状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、炎症性肠病、川崎病、梅尼埃综合征、混合性结締组织病、莫伦氏溃疡、多发性硬化、重症肌无力、落叶型天疱疮、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、1型多腺体自身免疫性综合征(PAS-1)、2型多腺体自身免疫性综合征(PAS-2)、3型多腺体自身免疫性综合征(PAS-3)、多肌炎/皮肌炎、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、雷诺氏综合征、赖特尔综合征、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、舍格伦综合征(Sj6gren'ssyndrome)、亚急性甲状腺炎、交感性眼炎、系统性红斑狼疾、高安氏动脉炎(Takayasu'sarteritis)、1型糖尿病、白癜风、伏格特-'J、柳-原田疾病(Vogt-Koyanagi證Haradadisease)或韦格纳氏肉芽肿病。优选地，所述自身免疫性疾病是类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮或特发性血小板减少性紫癜。疾病或疾患可是哮喘。哮喘可是急性或慢性哮喘。IgG活化补体系统中的经典途径。因此EndoS多肽和多核苷酸可用于治疗其中补体活化对患者有害的疾病和疾患。例如EndoS多肽和多核苷酸可用于治疗移植引起的病症例如移植排斥(诸如急性或慢性的同种异体移植物排斥或异种移植物排斥)和移植物抗宿主病。移植引起的病症可由于患者中组织或器官的移植而发生。EndoS多肽和多核苷酸也可用于手术后治疗，例如经历过心脏旁路手术的患者的治疗中。此外，EndoS多肽和多核苷酸可用于治疗获得性血友病，即除去已产生对凝血因子的自身抗体的血友病患者中的IgG。通常受治疗者是哺乳动物受治疗者例如小鼠、大鼠或灵长类动物(例如绒猴或猴)。受治疗者可以是人类或非人类的动物。当受治疗者是实验室动物例如小鼠、大鼠或灵长类动物时，可处理动物以诱导由病原IgG抗体介导的疾病或疾患。例如可使用Nandakumar等人描述的小鼠抗CII抗体诱导的关节炎(CAIA)模型(Am.J.Pathol.163(5):1827-1837，2003)或这种模型的修饰形式。治疗和预防本发明提供了EndoS多肽和多核苷酸治疗或预防由病原IgG抗体介导的疾病或疾患的用途。治疗可以是治疗性或预防性的。为预防所述疾病或疾患的一种或多种症状的发作，可对个体施用EndoS多肽或多核香酸。在这一实施方案中，受治疗者可是无症状的。受治疗者可具有对所述疾病的遗传易感性。将预防有效量的多肽或多核苷酸施用于这样的个体。预防有效量是预防疾病或疾患的一种或多种症状的发作的量。EndoS多肽或多核普酸的治疗有效量是对改善疾病或疾患的一种或多种症状有效的量。优选地，待治疗的个体是人类。可通过任何适合的方法对受治疗者施用EndoS多肽或多核苷酸。可通过肠内或肠胃外的途径例如经由口、口腔、胆门、肺、静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜内、关节内、局部或其他适当的施用路线施用所述多肽或多核芬酸。可以诸如对特定部位的靶向治疗的方式对受治疗者施用EudoS多肽或多核苷酸。例如可将EndoS多肽直接施用于器官移植的部位。可将EndoS多肽局部地例如在关节内或一个或多个关节注射。对于类风湿性关节炎(RA)的预防或治疗来说，对关节局部施用EndoS是尤其优选的。可将EndoS多肽与特异性结合软骨的试剂轭合。对于EndoS多核苷酸来说，可使用编码EndoS多肽的表达载体直接将EndoS表达于特定的组织，例如通过使用组织特异性启动子或RNAi。本文提及的任何多肽和多核普酸的制剂将取决于例如多肽或多核苦酸的性质和待治疗的疾患的因素。可以不同的剂型施用多肽或多核苷酸。它可是口服(例如片剂、糖锭(troche)、锭剂(lozenge)、水性或油状悬浮液、可分散的粉剂或粒剂)、肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、胸骨内、经皮或通过输注技术施用的。还可将多肽或多核苷酸作为栓剂施用。医生能够确定每个特定的患者所需要的施用路线。通常将多肽或多核苷酸与药学上可接受的载体或稀释剂一起配制以便使用，而且这可使用制药领域中的常规方法实现。药物载体或稀释剂可是例如等渗溶液。例如固体口服形式可含有(与活性化合物一起的)稀释剂，诸如乳糖、葡萄糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉；润滑剂，诸如硅石、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸4丐和/或聚乙二醇；粘合剂，诸如淀粉、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧曱基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂(disaggregatingagent),诸如淀粉、海藻酸、海藻酸盐或淀粉乙醇酸钠；泡腾混合物；着色剂；甜味剂；润湿剂诸如卵磷脂、聚山梨醇酯、十二烷基^5危酸盐(laurylsulphate);以及通常无毒并且药理上无活性的用于药物制剂的物质。可以已知的方法，例如通过混合、粒化、压片、包糖衣或薄膜包衣过程制备这样的药物制品。用于口服施用的液体分散体可是糖浆、乳剂和悬浮液。糖浆可含有作为载体的例如蔗糖或蔗糖与甘油和/或甘露醇和/或山梨醇。悬浮液和乳剂可含有作为载体的例如天然树胶、琼脂、海藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧曱基纤维素或聚乙烯醇。用于肌肉内注射的悬浮液或溶液可含有(与活性化合物一起的)药学上可接受的载体，例如无菌水、橄榄油、油酸乙酯、二醇诸如丙二醇以及如果需要，适量的盐酸利多卡因。用于静脉内或输注的溶液可含有作为载体的例如无菌水或优选地它们可是无菌的、含水的、等渗的盐水溶液的形式。对于栓剂，传统的粘合剂和载体可包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酸酯；这种栓剂可从含有0.5°/。至10%、优选地1%至2%范围内的活性组分的混合物形成。口服制剂包括像例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁以及类似物这样的通常使用的赋形剂。这些组合物采取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉剂的形式并含有冻干燥时，冷冻千燥的材料可在施用前复原为例如悬浮液。优选地在緩冲液中实现复原。用于对患者口服施用的胶嚢、片剂和丸剂可具有肠溶包衣，包括例如Eudragit"S"、Eudragit"L'，、醋酸纤維素、醋酸邻苯二甲酸纤维素或羟丙基曱基纤维素。还可使用适于通过无针注射(例如经皮)递送的药物组合物。施用治疗有效量的多肽或多核苷酸。可根据不同的参数，尤其是根据所使用的多肽或多核苷酸；待治疗的患者的年龄、体重和疾患；施用路线和所需的治疗方案确定剂量。再一次地，医生能够确定任何特定患者所需的施用路线和剂量。依照特异性抑制剂的活性，待治疗的受治疗者的年龄、体重和疾患，疾病的类型和严重度以及施用的频率和路线，典型的日剂量是从约0.1至50mg/kg体重，优选地从约0.1mg/kg至10mg/kg体重。优选地日剂量水平为5mg至2g。上文描述的EndoS核苷酸序列和含有这样的序列的表达载体也可用作如上文概括的药物制剂。优选地，以可在待治疗个体的细胞中表达的表达栽体的形式提供核酸，例如RNA或DNA,尤其是DNA。疫苗可含有棵露的核苷酸序列或与阳离子的脂质、聚合物或靶向系统结合的核苷酸序列。可通过任何可用的技术递送疫苗。例如可通过针注射，优选地皮内、皮下或肌肉内地引入核酸。可选择地，可使用核酸递送设备例如粒子介导的基因递送直接穿过皮肤递送核酸。可对皮肤或通过例如鼻内、口、阴道内或直肠内施用对粘膜表面局部地施用核酸。可通过几种已知的转染技术(例如包括使用转染剂的那些)增强核酸构建体的摄入。这些剂的实例包括阳离子剂例如磷酸4丐和DEAE-Dextran(DEAE-葡聚糖)以及脂质转染剂例如lipofectam和transfectam。可改变待施用的核酸的剂量。通常以lpg至lmg,优选地对粒子介导的基因递送来说lpg至10貼以及对其他路线来说10吗至lmg的核酸范围施用核酸。本发明还提供了离体处理采自患有由病原IgG抗体介导的疾病或疾患的患者的血液的方法，其包括将血液与EndoS多狀接触。因此EndoS可被用于血液的体外处理。EndoS可用于处理血液的一种或多种组分例如血浆或血清。本文描述的离体方法可对已从患者身体取出的血液实施。在与EndoS多肽接触后可将血液或血液产品可选择地返回到患者。下列实施例示例性说明本发明实施例1:在人类血液中EndoS有效地水解IgG为了在作为抗病理IgG的治疗剂时有效，在人类全血环境中EndoS需要在低浓度时有活性。为了研究这一点，如以前所描述的生产并纯化没有信号序列(即具有SEQIDNO:1的序歹'J)的重组EndoS(rEndoS)(Collin&Ols纽，2001,Infect.Immun.69:7187-7189)。将逐渐增加纟冬浓度的(0、0.31、0.63、1.25、2.5、5、10和20吗/ml)的rEndoS在500^1的来自健康志愿者的肝素化的人类血液中于37t:翻滚(endoverend)旋转孵育1小时。将样品于4。C以720xg离心10分钟，之后用蛋白G琼脂糖凝胶依照制造商的使用说明(GEHealthcareBiosciences,Uppsala，Sweden)纯化血浆中的IgG。与之前关于IgG结合蛋白蛋白H(来自化脓性链球菌)和蛋白A(来自金黄色葡萄5求菌(5V"//7少/o"x:a"m/reRV))的发现(Collin&Ols^n2001，EMBOJ.20:3046-3055)—致，完全糖基化的IgG和EndoS处理的IgG在对蛋白G的结合效力上没有差别。在10%的SDS-PAGE上分离纯化的IgG,用考马斯染色或电印迹至PVDF(Tmmobilon-P,Millipore，Bedford,MA)上。用5貼/ml生物素化的扁豆凝集素(LCA)和l昭/ml的链霉抗生物素-，束才艮过氧4b物酶(VectorLaboratories,Burlingame,CA)禾口SuperSignalWestPico过氧化物酶底物(Pierce,Rockford，IL)检测糖基化的IgG。用ChemidocXRS成像系统和QuantityOne图像分析软件(Bio-Rad,Hercules,CA)分析膜。这些实验显示逐渐增加浓度的EndoS逐渐将IgG重链转变为小了约3kDa的表观分子量并且在2.5-5吗/ml以上浓度的rEndoS时几乎看不到完整大小的重链(图5A)。对同样的样品进行的LCA凝集素印迹实验显示逐渐增加浓度的rEndoS逐渐产生较低的糖信号并且事实上在2.5-5吗/ml以上浓度的rEndoS时没有信号(图5B)。先前显示过缺乏凝集素信号与如由质谱法分析的完全的IgG聚糖水解很好地对应(Collin&Fischetti,2004，J.Biol.Chem.279:22558-22570)。此外峰密度分析显示在大约5將/ml的rEndoS浓度的背景水平时变平的剂量响应曲线(图5C)。这些结果表明5ng/ml的rEndoS在1小时内完全水解了人类血液中的IgG库。假定IgG血浆浓度为10mg/ml，这将意味着以1:2000的rEndoS:IgG比率在1小时内完全水解IgG。因此，在如人类血液这样复杂的环境中，rEndoS显示出对功能上重要的IgG聚糖的显著有效的水解。实施例2:在兔中EndoS有效地水解IgG为了进一步证实EndoS作为治疗剂的用途，研究了在活体动物的循环中EndoS的IgG聚糖水解活性。相应于约1:2000的rEndoS:IgG比率(假定rEndoS仅在血液中分布)，用lmg的rEndoS静脉内注射体重约3kg的Swedishlo叩兔。动物没有显示疾病迹象。在0、1、2、4、6、8和12小时以及第1、2、3、4、5、6、8和10天采集血清样品。如前文对人类血液描述过的用SDS-PAGE和凝集素印迹分析来分析血清IgG的糖基化状况。这些实验显示，在注射前，IgG重链的表观分子量与完全糖基化完整的兔IgG相当(图6A，染色、0小时以及IgG)。相比之下，rEndoS注射后1小时已经有IgG重链向小约3kDa的蛋白条带的部分转变。rEndoS注射后4小时IgG重链被完全转变为较小表观分子量形式并且这一结果被维持直到注射后第10天的最后的样品(图6A,染色，4小时至第10天)。相同样品的凝集素印迹分析显示在rEndoS注射后6-8小时IgG重链糖信号几乎消失并且这一结果被维持直到第10天，此时凝集素信号只有轻微增力口(图6A，LCA印迹)。为了了解rEndoS在已经暴露于酶的动物中是否有活性，在第一次注射后第35天用lmg的rEndoS进行第二次注射。再一次地，动物看起来没有受注射影响并且如上文采集并分析血清样品。SDS-PAGE显示在第二次注射前IgG重链变为与完全糖基化的对照兔IgG重链一样(图6B，0小时，IgG)。l小时后，IgG重链部分地向小3kDa的表观分子量转变，而6-8小时后TgG重链被完全转变并且这一转变被维持直到这一第二次施用后的第10-14天(图6B,染色，1小时至第14天)。凝集素印迹分析显示在rEndoS注射后1-2小时IgG重链糖信号几乎消失并且这一结果被维持直到笫8天，此时凝集素信号有轻微增加并在第10和14天之间进一步轻微增加(图6B，LCA印迹，第1-14天)。为了研究rEndoS在已经两次静脉内暴露于rEndoS的动物中是否仍然有活性，在第一次注射后130天用lmg的rEndoS进行第三次注射。再一次地，动物没有受注射影响并且如上文采集并分析血清样品。SDS-PAGE显示在第三次注射前，IgG重链变为与完全糖基化的对照兔IgG重链一样(图6C，O小时，IgG)。l小时后，IgG重链部分地向小3kDa的分子量转变，并且这一转变被维持直到这一第三次施用后的第8-10天(图6C，染色，1小时至第14天)。凝集素印迹分析显示在第三次rEndoS注射后一小时IgG重链糖信号消失并且这一结果被维持直到第5天，此时凝集素信号有轻微增加并在第6和14天之间进一步增加(图6C，LCA印迹，第1-14天)。总体来看，这些结果表明低浓度的EndoS于体内有效地水解了全兔IgG库上的重链聚糖。此外，之前静脉内暴露于EndoS没有显著影响EndoS的体内酶促活性。实施例3:尽管有针对EndoS酶的抗体但EndoS在兔中是有活性的由于在注射第二次和第三次时EndoS具有完全的活性，因此确定这是由于对酶的免疫应答是没有或低水平的还是具有不干扰酶促活性的抗EndoS的特异性抗体是令人感兴趣的。自从已知健康个体和用化脓性链球菌感染的那些个体都有抗EndoS的抗体(Akesson等人，2004,J.Infect.Dis.189:797-804)以来，这是尤其令人感兴趣的。为了研究这一点，在10%SDS-PAGE上分离纯化的rEndoS并电印迹至被切割为1.5mn的条的PVDF上。将条与来自第一次、第二次和第三次注射的所有血清样品的1:500的稀释液孵育，之后用过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体(Pierce)孵育。如上文对凝集素印迹描述过的将条用化学发光显影。这一实验显示在第一次注射前已有与rEndoS反应的抗体(图7，第一次注射，0小时)。注射后10天对rEndoS的反应性上仅有轻微增加(图7，第一次注射和图7A插图)，但是在注射后6和8小时之间有个反应性缺口(图7，第一次注射)。这一发现的一种可能的原因是结合于rEndoS的特异性抗体被复合并被网状内皮组织系统从循环中除去。恰好在第二次注射rEndoS前，抗rEndoS的反应性与第一次注射前相当或略高，并且在注射后的最初3天中反应性没有增加(图7，第二次注射，0小时-第3天)。第二次注射后从第4天到第14天，抗rEndoS的反应性逐渐增加(图7，第二次注射，第4天-14天)。第三次注射rEndoS前，抗rEndoS的反应性比第二次注射前略高，并且反应性在注射后的第一天中没有增加(图7，第三次注射，0小时-1天)。第三次注射后从第2天到第14天，抗rEndoS反应性增加(图7,第三次注射，第2-14天)，尽管高信号水平使测定增加的水平变得困难。考虑到来自第二次和第三次注射后获得的样品的蛋白质印迹中的非常高的信号水平，还通过ELISA分析了全部三次注射之前和之后的样品。对于ELISA实验，用2昭的EndoS包被微量滴定板(Nunc,Roskilde，Denmark)，之后用溶于PBS中的20mg/ml的牛血清白蛋白封闭。将来自EndoS注射前和注射后0.5、1、5和10天的动物的血清以1:100至1:200,000的系列稀释用作第一抗血清。过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体(Pierce)用作第二抗体而ABTS(Roche,IN)作为过氧化物酶底物。通过用系列稀释的多克隆兔1gG(Sigma)如上文包被微量滴定板并用过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体为第二抗体生成兔IgG的标准曲线。在Victor3多标记读数器(Perkin-Elmer，Waltham，MS)中于405nm分析板。ELISA实验证实了恰好在第二次注射EndoS前，抗EndoS反应性与第一次注射前相当或略高，并在注射后5天时反应性仍旧没有增加(图7A，第一次和第二次注射)。第二次注射后从第5至10天，抗EndoS反应性逐渐增加(图7A，第二次注射，第5-10天)。在第三次注射EndoS前，ELISA数据证实抗EndoS反应性比第二次注射前略高，并且在注射后第一天中反应性没有增加(图7A,第三次注射，第0-1天)。第三次注射后从第5至10天，ELISA数据显示抗EndoS反应性显著增加(图7A，第三次注射，第5-10天)。这些结果表明在未暴露的动物中存在针对EndoS的抗体并且在兔中重复静脉内暴露时rEndoS产生免疫应答。但是在三次连续的施用期间这些抗体没有千扰rEndoS在循环中的活性。此外重复的施用没有影响酶的大约12小时的循环时间(定义为检测EndoS的能力)，如通过对来自兔血清样品的EndoS的免疫沉淀和蛋白质印迹分析所分析的。实施例4:EndoS切割CII特异性单克隆抗体进行了与和不与EndoS孵育的并用10%的SDS-PAGE分离的IgG单克隆抗体(CIICl和M2139)的SDS-PAGE和凝集素印迹分析并将结果示于图8。EndoS特异性地水解免疫球蛋白(IgG)的天冬酰胺连接的聚糖的P-1,4-二-N-乙酰壳二糖核。用EndoS除去糖侧链之后，IgG分子量降低。在染色的凝胶图片中可清楚地看到用EndoS处理的IgG样品和未处理的IgG之间Y-链大小的差异。为了证实IgG的大小变化是由EndoS活性而不是由蛋白水解性的降解导致的并且产生Y-链上的聚糖部分的去除，进行了凝集素印迹分析。来自雪花莲(Ga/朋A仏vwrafc)(GNL)的凝集素优先识别存在于y-链上二天线型聚糖中的a-1,3甘露糖残基。当与EndoS孵育时，使用GNL凝集素的相同样品的凝集素印迹分析显示出显著下降的信号。相比之下，在不存在EndoS的情况下孵育时，y-链依旧是糖基化的。这些数据表明EndoS具有从小鼠IgG的Y-链除去含有a-1,3甘露糖的结构的能力。实施例5:去糖基化的抗体在体内结合于软骨进行这一实验以了解从II型胶原蛋白(CII)特异性IgG单克隆抗体(mAb)除去糖部分是否影响其在体内对n型胶原蛋白的结合能力。用lmg的CII结合抗体(正常的和EndoS处理的)腹膜内注射1-2日龄的新生大鼠。抗体传输二十四小时后将爪解剖并在OCT化合物中用异戊烷和千冰迅速冷冻。用生物素化的抗小鼠k(187.1)抗体和HRP轭合的第二抗体作为检测系统用标准实验方案进行免疫组织化学分析。结果示于图9。EndoS处理和未处理的抗体在体内对关节软骨的结合模式上没有差别。实施例6:通过抗CII单克隆抗体的去糖基化的关节炎致病力(arthritogenicitv)丧失CII特异性单克隆抗体在小鼠中诱导了急性型关节炎，即Nandakumar等人(2003)中描述的所谓的胶原蛋白抗体诱导的关节炎(CAIA)。CAIA类节炎耳又决于补体成分，FqR，效应细胞因子TNF-a和IL-ip以及取决于嗜中性粒细胞和巨噬细胞。CAIA用于本研究中以了解通过EndoS处理将IgG去糖基化的重要性。使用含有两种抗体结合于Jl表位(551-564;GERGAAGIAGPK)的M2139mAb(IgG2b)和结合于II型胶原蛋白的Cl1(359-363;ARGLT)的CTICl(TgG2a)的单克隆抗体混合物诱导急性型关节炎，CAIA。为了测定去除糖侧链是否影响n型胶原蛋白的病原单克隆抗体诱导关节炎的能力，将用EndoS处理或或未处理的这一单克隆抗体的混合物注射入小鼠中。在0天用9mg未处理(11=7)或EndoS处理的(『5)抗CII单克隆抗体(M2139和CIIC1)注射雄性(BALB/cXB10.Q)Fl小鼠组。第5天时用50叱的大肠杆菌LPS腹膜内注射所有小鼠。关节炎发生率(a)和平均关节炎得分(b)示于图10。如可从图10a和10b见到的，在早期显示为对胶原蛋白抗体诱导的关节炎(CATA)高度易感的(BALB/cXB10.Q)Fl小鼠中出现了临床关节炎的完全抑制。因此，明显是通过EndoS从IgG的Y-链去除糖取消了其关节炎诱导能力(关节炎致病力)。为了证实通过除去IgG的糖侧链的单克隆抗体的关节炎致病力的丧失，在具有另一种遗传背景BIO.RIII的小鼠中诱导了CAIA。在0天用9mg的未处理的(n=ll)或EndoS处理的(n=12)的抗CII单克隆抗体(M2139和CIIC1)注射雄性B10.RIII小鼠。在第5天时用50吗的大肠杆菌LPS腹膜内注射所有小鼠。关节炎发生率(a)和平均关节炎得分(b)示于图11。如从图ll所看到的，在B10.RIII小鼠中，与未处理的mAb混合物相比，由EndoS处理的mAb混合物诱导的关节炎的发生率和严重度显著下降。实施例7:体外经由CH反应性单克隆抗体的补体活化为了了解为什么从IgG的Y-链除去糖降低或取消了mAb的临床关节炎诱导能力，用EndoS处理或未处理的抗体进行体外实验以评估它们诱导补体活化的能力。图12显示了在与I型胶原蛋白(a)或直接与塑料表面(b)结合的mAb上沉积的第一补体成分Clq。在通过EndoS处理(M2139D)和未处理(M2139)的抗体的补体系统的活化之间没有差别。C1IC(EndoS处理和未处理的)mAb根本没有活化补体。Gll(IgG2b)和L243(IgG2a)是结合于无关抗原的对照单克隆抗体。图13显示了补体成分C3的切割产物(C3b)在与II型胶原蛋白(a)或直接与塑料表面(b)结合的mAb上的沉积。在通过EndoS处理(M2139D)和未处理(M2139)的抗体的补体系统的活化之间没有差别。CIIC1(EndoS处理和未处理的)mAb根本没有活化补体。Gll(IgG2b)和L243(IgG2a)是结合于无关抗原的对照单克隆抗体。实施例8:CII特异性单克隆抗体的去糖基化对嗜中性粒细胞(PMNL)氧化猝发的影响为了测定在糖基化和去糖基化抗体在诱导多形核白细胞PMNL(嗜中性粒细胞)的氧化猝发的能力上是否有功能性差异，将聚苯乙烯微粒用EndoS处理和未处理的抗体包被并和来自具有三种不同基因型(FcgR+/+、FcgR-A和FcgR+/-)的小鼠的全血孵育。之后用FACS(荧光激活细胞分选术)分析进行氧化猝发测定。用RB6抗体识别PMNL。结果示于图14。糖基化和去糖基化的抗体之间的氧化猝发的活化没有差别。实施例9:小鼠爪的组织学为了检查来自接受糖基化或EndoS处理的mAb的小鼠的爪的关节的组织学状态，用标准的苏木精-伊红染色给来自用9mg未处理的、去糖基化的或未处理和EndoS处理的抗体混合物的等量混合物注射的(BALB/cxB10.Q)F1小鼠(n二3-4)的福尔马林固定的脱钙关节的6pm切片染色。结果表明在来自用糖基化抗体注射的小鼠的关节中出现大量的细胞浸润以及软骨和骨的糜烂。相比之下，用EndoS处理的抗体注射的小鼠爪仅显示较小的骨糜烂并且没有大量的细胞浸润。在这些小鼠中软骨看上去是正常的。实施例10:体内正常和去糖基化抗体的清除率为了测定去糖基化抗体的减小的关节炎致病力是否是由于这些抗体与糖基化抗体相比从小鼠中早期并且提高的清除率，用在第1和5天从B10.RITI小鼠收集的血清进行通过ELTSA(酶联免疫吸附测定)的II型胶原蛋白结合抗体的分析。结果示于图15。用糖基化和EndoS处理的mAb注射的小鼠的血清中存在的抗体水平之间没有差异，表明去糖基化的抗体从小鼠的正常的清除率水平。实施例11:通过去糖基化抗体的免疫复合体的形成我们想要确定除对FcyR分子的结合差异之外，糖基化和EndoS处理的抗体之间是否存在任何的显著差异。最有可能的是在抗体传输关节炎模型中最初的触发事件中的第一步骤是软骨表面上或滑膜中胶原蛋白-IgG免疫复合体的形成。胶原蛋白表位位于在软骨表面上形成的重复结构中，因此可能的是两种不同的抗体可在关节表面上形成多体复合体，以通过最佳的补体活化或通过与FcyR负载细胞结合来促进关节炎致病力。为了研究稳定的免疫复合体形成的问题，在琼脂糖上进行抗体的单向免疫扩散。将以lmg/ml溶于含有0.05%叠氮钠的PBS的大鼠CII浸润至1%的琼脂糖(低成胶温度琼脂糖26-3CTC)凝胶中。将25ul的lmg/ml浓度的抗体对每孔上样。用考马斯蓝对凝胶染色。结果显示去糖基化的抗体与糖基化的mAb相比没有形成稳定的免疫复合体。对形成稳定免疫复合体的这种无能力可能是对去糖基化抗体丧失关节炎致病力的另一种解释。实施例12:EndoS从致死的抗体介导的血小板减少中解救小鼠证实EndoS在体内有效地水解IgG聚糖并且动物耐受所述酶的施用之后，我们研究了EndoS治疗严重的TgG介导的疾病的用途。所选择的疾病模型是免疫性血小板减少性紫癜(ITP)的小鼠模型。在这一模型中，腹膜内注射对抗小鼠血小板的多克隆兔IgG(aPLT-IgG)，导致严重的血小板减少、出血和在较高剂量的IgG时的最终的死亡。抗小鼠血小板的兔抗血清是从Inter-CellTechnologies(J叩iter,FL)购得。使用蛋白G琼脂糖凝胶从这一血清分离IgG级分。通过SDS-PAGE分析确认蛋白纯度并用AdvancedProteinAssayReagent(高级蛋白测定试剂)(Cytoskeleton，Denver,CO)测定蛋白浓度。对使用预处理的IgG的实验，将纯化的兔抗小鼠血小板lgG(aPLT-lgG)以1:500的酶比底物比率用纯化的GST-EndoS或GST于37。C粹育24小时，之后在谷胱甘肽-琼脂糖凝胶(GEHealthcare)上除去GST-EndoS和GST。如上文所述通过SDS-PAGE和使用LCA的凝集素印迹确认IgG聚糖的水解。在标准的光照和温度条件下安置雌性BALB/c小鼠(约重20g)并用标准的实验室食物和水随意喂食。将溶于0.25mlPBS的1.2mg抗小鼠血小板IgG(未处理、EndoS处理或GST处理的)通过腹膜内注射(i.p.)施用于动物。监测动物粘膜与皮肤的出血、身体活动、从组中的孤立并记录存活时间。在即将注射兔抗小鼠血小板IgG之前以及在实验过程中每隔一定间隔从小鼠收集血液样品。从预热的尾静脉将5^1全血收集至含有45卩l1溶于PBS的0.1M柠檬酸钠/柠檬酸(pH6.5)的管中。用流式细胞术确认这些血液样品中的血小板群。用仓鼠抗小鼠CD-61PE(BDBiosciences,SanJose，CA)于室温标记样品10分钟。将lO^il的SPHEROa彩色校准粒子(BDBiosciences)加至每一个试管以使得能够计数。用Utilysea(DakoCytomation,Glostr叩，Denmark)裂解红细胞群并在FacsCalibur流式细胞计(BDBiosciences)上以对数模式分析样品。通过在Neubauer室中人工计数来延续红细胞裂解后血液样品中的血小板数目计算。在预实验(pilotexperiment)中，用1.2mg的aPLT-IgG注射三只雌性BALB/c小鼠并如上文描述的用流式细胞术和显微镜方法观察随时间的血小板计数。这显示出所有三只小鼠迅速发生血小板减少并在aPLT-Ig施用后24小时内发生死亡(图16A)。接下来，我们测试了在对小鼠施用前用GST-EndoS或作为对照的GST预处理aPLT-IgG是否对疾病的发生和存活率有任何影响。用GST-EndoS处理的aPLT-IgG注射的所有动物(n=4)没有发生疾病的任何征兆都存活了，而用GST处理的aPLT-Ig注射的所有动物(n=4)发生严重的皮下出血并在24小时内死亡(图16B)。这代表在两组动物中统计学上显著的差异(p二0.0082)。此外，通过流式细胞术的每日血小板计数分析显示GST-EndoS处理的aPLT-IgG对小鼠血小板计数没有明显的影响，而GST处理的aPLT-IgG导致了血小板计数的迅速下降(图16C)。这些实验证明aPLT-IgG的离体EridoS处理取消了IgG抗体的致病力，这一结果与EndoS的体内活性一起促使我们去研究是否可在疾病发作后对小鼠施用EndoS以阻止致死的血小板减少的发展。用1.2mg的aPLT-IgG注射小鼠(n=8只/组)，之后在施用aPLT-lg后3小时腹膜内注射100|ig的GST-EndoS或GST。所有用GST处理的动物(8/8)在两天内死亡，而只有2/8的用GST-EndoS处理的动物死亡(图17A)。这代表了在组之间存活率的统计学上的显著差异(p=0.003)。来自GST-EndoS或GST处理的小鼠的总IgG的SDS-PAGE和凝集素印迹分析显示在GST-EndoS处理的动物中aPLT-IgG处理后24、48和72小时重链聚糖被完全水解，而GST处理的动物中的IgG是完全糖基化的直到在24小时死亡发生(图17B)。此外如流式细胞术所分析的血小板计数显示aPLT-IgG的施用诱导了血小板计数的迅速下降，但是在GST-EndoS处理的小鼠中血小板计数开始稳步上升并在2-3天后达到正常值(图17C)。为了进一步质询我们的假设，我们试图模拟ITP患者的临床情况。当这些患者寻求医疗帮助时，血小板计数常常非常低并且已显露出皮下和其他的出血并发症。因此我们在小鼠(11=14)中用oPLT-IgG诱导疾病但直到在aPLT-IgG注射后5-7小时动物表现出明显可见的皮肤血肿才开始用GST-EndoS或GST处理。在这些实验中，5/7的用GST-EndoS处理的小鼠存活并恢复，而所有(7/7)用GST处理的小鼠在两天内死亡，再次代表了在两组之间存活率的统计学上显著的差异(p=0.0015)(图17D)。总之我们的结果证明了小鼠中aPLT-IgG的致病特性取决于抗体的糖基化状态，并且EndoS在离体和体内都强烈地降低了抗血小板IgG抗体的致病力。总的来说，在用EndoS酶预处理病原抗体时和在疾病过程中早期或晚期施用EndoS时，EndoS对血小板计数和存活率都具有显著的积极影响。据发明人所知，将IgG聚糖的体内水解用作自身免疫性疾病的实验性治疗尚属首次。由于发明人先前发现IgG的EndoS水解抑制所有亚类的IgG与FcR的结合并且还减少了补体活化，因此EndoS的积极影响的机制从理论观点上讲是非常清楚的。尤其令人感兴趣的是EndoS不仅抑制IgG与FcR结合，并且还可通过水解重链聚糖释放已经与FcR结合的IgG。还应注意到的是似乎有一种IgG-FcR相互作用没有像其他相互作用那样受到影响；在某些条件下EndoS水解的IgG比未水解的IgG与人类FcRllb的确结合得更好(数据未显示)。由于IgG与FcRllb的相互作用已经显示出对用于治疗自身免疫性疾患的静脉内注射免疫球蛋白(IV1G)的抗炎活性来说是重要的，因此在抗炎活性的背景下这可能具有相关性。没有被任何假设束縛，发明人提出EndoS在一定条件下可通过直接抑制病原IgG与活化的FcR的结合和向通过FcRllb介导的抑制活性的转变而具有双倍的抗炎活性。力的替代方案，尤其是鉴于几项最近的研究证实IgG聚糖为IgG效应调节的关键。这包括发明人自己的关于这一聚糖的EndoS水解几乎取消了通过经典通路的补体活化并且减低了对白细胞上Fc受体的结合的发现。基于发明人的观察结果，显示EndoS可用于治疗其中IgG抗体起到病原作用的疾患，包括如本文通过ITP示例性说明的自身免疫性疾病和急性的抗体介导的器官同种异体移植物排斥。权利要求1.EndoS多肽或编码EndoS多肽的多核苷酸在制备用于治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或疾患的药物中的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其中所述EndoS多肽包括(a)SEQIDNO:1的氨基酸序列；(b)与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少50%的同一性并具有IgG内切糖普酶活性的其变体；或(d)具有IgG内切糖苷酶活性的其任一片段。3.根据权利要求2所述的用途，其中所述多肽由SEQIDNO:1中所示的序列组成。4.根据权利要求1所述的用途，其中所述多核苷酸包括(a)SEQIDNO:3的编码序列；(b)由于遗传密码而对于如(a)中所定义的序列为简并的序列；(c)与如(a)或(b)中所定义的序列具有至少60%同一性并编码具有IgG内切糖苷酶活性的多肽的序列；或(d)如(a)、(b)或(c)中所定义的序列中的任何一个的片段，所述片段编码具有IgG内切糖苷酶活性的多肽。5.根据权利要求4所述的用途，其中所述多核苷酸由SEQIDNO:3中所示的核酸序列组成。6.根据前述权利要求中的任一项所述的用途，其中所述疾病或疾患是自身免疫性疾病、移植排斥、手术后治疗或获得性血友病。7.根据权利要求6所述的用途，其中所述自身免疫性疾病是艾迪生病、斑壳、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、再生障碍性贫血、自身免疫性胃炎、自身免疫性听力丧失、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性甲状旁腺功能减退症、自身免疫性垂体炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴增生综合征、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性多内分泌腺病、白塞氏病、大疱性类天疱痴、心肌病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、丘-施二氏综合征、腹腔疾病、克罗恩病、CREST综合征、德戈斯病、获得性大疱性表皮松解症、原发性混合型冷球蛋白血症、巨细胞动脉炎、肾小球肾炎、古德帕斯丘综合征、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、炎症性肠病、川崎病、梅尼埃综合征、混合性结締组织病、莫伦氏溃疡、多发性硬化、重症肌无力、落叶型天疱疮、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、1型多腺体自身免疫性综合征(PAS-1)、2型多腺体自身免疫性综合征(PAS-2)、3型多腺体自身免疫性综合征(PAS-3)、多肌炎/皮肌炎、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、雷诺氏综合征、赖特尔综合征、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、舍格伦综合征、亚急性甲状腺炎、交感性眼炎、系统性红斑狼痤、高安氏动脉炎、l型糖尿病、白癜风、伏格特-小柳-原田疾病或韦格纳氏肉芽肿病。8.根据权利要求7所述的用途，其中所述自身免疫性疾病是类风湿性关节炎。9.根据权利要求7所述的用途，其中所述自身免疫性疾病是系统性红斑狼痴。10.根据权利要求7所述的用途，其中所述自身免疫性疾病是特发性血小板减少性紫癜。11.根据权利要求6所述的用途，其中所述移植排斥是同种异体移植物排斥或异种移植物排斥。12.—种EndoS多肽或编码EndoS多肽的多核苷酸，其在用于治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或疾患的方法中使用。13.—种在需要其的受治疗者中治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或疾患的方法，所述方法包括对所述受治疗者施用治疗有效量的EndoS多肽或编码EndoS多肽的多核芬酸。14.一种离体处理采自患有由IgG抗体介导的疾病或疾患的患者的血液的方法，其包括将所述血液与EndoS多肽接触。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述血液在其与所述EndoS多肽接触后被返回到所述患者。全文摘要本发明提供了EndoS多肽或编码EndoS多肽的多核苷酸在制备用于治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或疾患的药物中的用途。文档编号A61K38/47GK101605557SQ200780051249公开日2009年12月16日申请日期2007年12月12日优先权日2006年12月13日发明者K·S·南达库玛,L·博乔克,R·霍默达,乌纳·莎侬,阿恩·奥尔森,马迪亚斯·科林申请人:汉莎医药有限公司