专利名称：：老年性黄斑变性的预防和治疗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及老年性黄斑变性(AMD)的诊断、预防和治疗。更特别地，本发明涉及常见并且有力预防AMD发展的基因缺失的鉴定，并涉及沉默这些基因的抑制剂。背景老年性黄斑变性(AMD)是老年人群中视觉损坏的最常见的原因，严重的疾病困扰着近10%的超过75岁的白种人。这是一种其中遗传和环境因子造成易感性的复杂疾病。补体因子H(CFH)最近已被鉴定为主要的AMD易感性基因，并且Y402H多态已被提出为可能的诱发因素。CT^/和近缘基因Cf7fzj，cf7/",CF/a<CF/a2和a^a5(也被称为CEffl7-5)串联排列于染色体lq23，其中它们跨越RCA基因簇近端的355kb。特别是CF/f和CF/江/的3'外显子之间(98。/。)和CFf/L3和CFHL4的外显子之间(88-99%)极高水平的同源性表明它们通过基因组复制起源。所述基因产物参与调节补体活性，一种参与早期AMD中布鲁赫膜和视网膜色素上皮细胞之间产生的玻璃疣的形成的级联、发明概述尽管有AMD遗传成分的证据，但尚未鉴别出可以用于^:测疾病易感性和/或可以用作预防和/或治疗AMD的工具的特异性遗传标记。根据本发明的第一个方面，提供了预防和/或治疗AMD的药物，所述药物包含完全地或部分地沉默基因CP7tt/和/或基因Ci^fflJ中的至少一种的至少一种抑制剂。CFHR1的参照序列NM002113.2.CFHR1核苷^列的mRNA(993nt):(SEQIDNOl)ATGTGGCTCCTGGTCAGTGTAATTCTAATCTCACGGATATCCTCTGTTGGGGGAGAAGCAACATTTTGTGATTTTCCAAAAATAAACCATGGAATTCTATATGATGAAGAAAAATATAAGCCATTTTCCCAGGTTCCTACAGGGGAAGTTTTCTATTACTCCTGTGAATATAATTTTGTGTCTCCTTCAAAATCATTTTGGACTCGCATAACATGCACAGAAGAAGGATGGTCACCAACACCAAAGTGTCTCAGACTGTGTTTCTTTCCTTTTGTGGAAAATGGTCATTCTGAATCTTCAGGACAAACACATCTGGAAGGTGATACTGTGCAAATTATTTGCAACACAGGATACAGACTTCAAAACAATGAGAACAACATTTCATGTGTAGAACGGGGCTGGTCCACCCCTCCCAAATGCAGGTCCACTGACACTTCCTGTig^AATCCGCCCACAGTACAAAATGCTCATATACTGTCGAGACAGATGAGTAAATATCCATCTGGTGAGAGAGTACGTTATGAATGTAGGAGCCCTTATGAAATGTTTGGGGATGAAGAAGTGATGTGTTTAAATGGAAACTGGACAGAACCACCTCAftTGCAAAGATTCTACGGGAAAATGTGGGCCCCCTCCACCTATTGACAATGGGGACATTACTTCATTCCCGTTGTCAGTATATGCTCCAGCTTCATCAGTTGAGTACCAATGCCAGAACTTGTATCAACTTGAGGGTAACAAGCGAATAACATGTAGAAATGGACAATGGTCAGAACCACCAAAATGCTTACATCCGTGTGTAATATCCCGAGAAATTATGGAAAATTATAACATAGCATTAAGGTGGACAGCCAAACAGAAGCTTTATTTGAGAACAGGTGAATCAGCTGAATTTGTGTGTAAACGGGGATATCGTCTTTCATCACGTTCTCACACATTGCGAACAACATGTTGGGATGGGAAACTGGAGTATCCAACTTGTGCAAAAAGA翻译(330aa):(SEQIDNO:2)MWLLVSVILISRISSVGGEATFCDFPKINHGILYDEEKYKPFSQVPTGEVFYYSCEYMFVSPSKSFWTRITCTEEGWSPTPKCLRLCFFPFVENGHSESSGQTHLEGDTVQI工CNTGYRLQNNENNISCVERGWSTPPKCRSTDTSCVNPPTVQNAHIIiSRQMSKYPSGERVRYECRSPYEMFGDEEVMCIiNGNWTEPPQCKDSTGKCGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQliEGNKRITCRNGQWSEPPKCLHPCVISREIMENYN工ALRWTAK(jKLYLRTGESAEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLEYPTCAKR如本文所用，术语"基因"是指包含多肽或前体制备所必需的编码序列的核酸(如DNA)序列。所述多肽可由全长编码序列或编码序列的任何部分编码，只要保留全长序列或片段的预期活性或功能性质(如酶活性、配体结合、信号转导等)。术语"基因"包括基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或克隆含有被称为"间插区"或"间插序列"的非编码序列间断的编码区。如本文所用，术语"基因沉默"是指基因功能籍此被完全地或部分地抑制的现象。在整个说明书中，当涉及基因转录、蛋白质表达或表达蛋白12质的功能的减少而使用时，术语"沉默"、"抑制"、"压抑"、"敲除"、"阻抑"可以互换使用。认为AMD的预防减少受治疗者较晚时间点发展AMD的风险。AMD的治疗延緩受治疗者AMD的发展和/或逆转受治疗者的AMD症状。本发明的至少一种抑制剂可以包含RNAi。RNAi脂A干扰(RNAi)或转录后基因沉默(PTGS)是双链RNA藉此诱导有效且特异的基因沉默的过程。RNAi由RNA诱导的沉默复合体(RISC)(—种序列特异性的多成分的核酸酶，其破坏与沉默触发物同源的信使RNA)介导。已知RISC含有源自双链RNA触发物的短RNA(约22个核苷酸)。一方面，本发明提供了使用RNAi剂调节哺乳动物(优选人宿主)耙基因CF/仏7或CFfflJ表达(优选降低其表达)的方法。降低表达是指耙基因或编码序列的表达水平与对照相比被降低或抑制了至少约2倍，通常至少约5倍，如10倍、15倍、20倍、50倍、IOO倍或更多。在某些实施方案中，耙基因的表达被减少至CFHL1或CFHL3基因/编码序列被有效抑制的程度。调节靶基因的表达是指改变(如降低)编码序列(如基因组DNA、mRNA等)向多肽(如蛋白质)产物的翻译。可以用于本发明优选实施方案的RNAi剂是以双链体结构出现的小核糖核酸分子(本文中也称作干扰核糖核酸)，例如相互杂交的两个不同的寡核糖核苷酸或假定具有产生双链体结构的小发夹结构的单个核糖寡核苷酸。优选的寡核糖核香酸是不超过100nt长，通常不超过75nt长的核糖核酸。当所述RNA剂是siRNA时，双链体结构的长度范围通常是从约15至30bp，一般从20至29pb，最优选地21bp。当所述RNA剂是以发夹结构存在的单个核糖核酸(即shRNA)的双链体结构时，所述发夹杂交部分的长度通常与以上提供的siRNA型剂相同，或比之长4-8个核苷酸。在某些实施方案中，所述RNAi剂并不是干扰核糖核酸(如上述siRNA或shRNA)，而是可以编码干扰核糖核酸的RNAi剂。在这些实施方案中，RNAi剂通常是编码千扰核糖核酸的DNA。所述DNA可以存在于载体中。可以使用本领域所知的任何合适的方案向宿主施用RNAi剂。例如，可以通过病毒感染、显微注射、小泡融合、粒子轰击或水力核酸施用将核酸引入组织或宿主细月包。DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)是一种可以用于本发明的方法的RNAi技术。U.S.6,573,099和GB2353282中描述了ddRNAi。ddRNAi是一种触发RNAi的方法，其包括向细胞引入DNA构建体以触发双链(dsRNA)的生产，作为RNAi过程的部分，dsRNA接着被切割成小干扰RNA(siRNA)。ddRNAi表达载体通常使用RNA聚合酶III启动子(如U6或Hl)，以在哺乳动物细胞中表达转染的siRNA靶序列。可以将产自ddRNAi表达盒系统的siRNA乾序列直接克隆到没有U6启动子的载体。可选地，含有发夹siRNA靶序列的短单链DNA寡核苷酸可以被退火并克隆到载体，位于聚合酶ni启动子的下游。ddRNAi表达载体的首要优点是他们提供长期的干扰效应并且将细胞中天然的干扰素应答降至最低。本领域技术人员可根据发明人对AMD相关的遗传成分的新颖和创造性的确定(determination)进行运用的，关于SiRNA的设计和使用的合适方法的实例参见SoutschekJ、AkincA、BramlageB、CharisseK、ConstienR、DonoghueM、ElbashirS、GeickA、HadwigerP、HarborthJ、JohnM、KesavanV、LavineG、PandeyRK、RacieT、RajeevKG、RohlI、ToudjarskaI、WangG,WuschkoS、BumcrotD、KotelianskyV、LimmerS、ManoharanM、VomlocherHP(2004),TherapeuticsilencingofanendogenousgenebysystemicadministrationofmodifiedsiRNAs(全身施用<务饰的siRNA只十内源基因的治疗性沉默)，Atoww432(7014):173-178。这一论文讨论了根据siRNA减少apoBmRNA和蛋白质水平的能力，筛选靶向HepG2肝细胞中的小鼠和人apoB的84个siRNA。对最强力的siRNA的两个进行化学修饰，并结合到胆固S事，已显示胆固醇在体内和体外赋予siRNA提高的药理学性质。在向小鼠静脉注射后，这些siRNA已经表现出减少肝和空肠(apoB表达的原始部位)的apoBmRNA、减少apoB蛋白质的血浆水平和减少总胆固醇。已表明apoBmRNA的切割特异性发生于目前的RNAi才莫型预测的位点，siRNA反义链的5'末端的10nt下游。14反义RNA用于本发明的CFHL1或CFHL3抑制剂可以是反义分子或表达诸如RNA的反义分子的核酸构建体。所述反义分子可以是天然的或合成的。合成的反义分子可以是对天然核酸的化学修饰。反义序列与所靶向的CFHL1或CFHL3基因的mRNA互补，并且抑制所靶向的基因产物的表达。反义分子通过多种机制抑制基因表达，例如通过减少翻译可用的mRNA的量、通过活化RNA酶H或空间位阻。可以施用一个反义分子或反义分子的组合，其中组合可以包括多个不同序列。可以通过在合适的载体中表达全部的或部分的CFHL1基因或CFHL3基因序列制备反义分子，在所述载体中的转录起始方向将使反义链制备成RNA分子。可选地，所述反义分子可以是合成的寡核苷酸。反义寡核苷酸的长度一般是至少约7个核苷酸、常见的至少约12个核苷酸、更加常见的至少约16个核苦酸，并且常见不超过约50个核苷酸、优选不超过约35个核苷酸。内源CFHL1或CFHL3有义链mRNA序列的特定区域可以被选择与反义序列互补。在特定的实施方案中，至少一种反义序列可以互补于与以下序列具有至少90%、至少95%、至少99%和优选地至少100%的序列同一性的核酸序列CFHrt肌ggtggac3gcca犯c3gaagctttett卿g肌c吗gtgaatc3gttg3atttgt跑(SEQIDNO:3)CFHR1:taaggtggacagccaaacagaagctttatttgagaacaggtgaatcagetgaatttgtgtg(SEQIDNO:4)。(下划线表示核苷酸碱基的差异)适当地，抑制剂的一个实施方案可以是与CFHR1互补的反义序列，例如包含或是ttcaGctgattcacctgttctcAaat(SEQIDNO:5)的核酸序列，或与所述序列具有至少90%、至少95%、至少99%、至少100%序列同一性的15多核苷酸序列。寡核苷酸特异序列的选择可以通过使用经验法确定，其中检验了几个候选序列在体外或动物模型内对靶基因表达的抑制。还可以使用序列的组合，其中选择mRNA序列的几个区域用于反义互补。反义寡核苷酸可以通过本领域所知的方法化学合成(参见Wagner等人(1993)，同上，和Milligan等人，同上)。为了增加它们的细胞内稳定性和结合亲和力，化学修饰天然的磷酸二酯结构以获得优选的寡核香酸。在文献中已经描述了许多这些修饰，其改变主链、糖或杂环碱基的化学。属于主链化学有用改变的是磷酸二酰胺键、磷酸曱酯、硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯，其中两个非桥接氧用硫取代；亚磷酰胺(phosphoroamidite);烷基磷酸三酯和;粦酸硼酯。非手性的磷酸酯衍生物包括3'-0-5'-S-硫代磷酸酯、3'-S-5'-0硫代磷酸酯、3'-CH2-5'-0-磷酸酯和3'-NH-5'-0-氨基磷酸酯(phosphoroamidate)。肽核酸可以用肽键取代整个核糖石奔酸二酯主链。还可以使用糖修饰以加强稳定性和亲和力。根据本发明的第二个方面，提供了全部或部分沉默基因CFHL1和/或基因CFHL3中的至少一种的至少一种抑制剂在医药(medicine)中的用途。根据本发明的第三个方面，提供了全部或部分沉默基因CFHL1和/或基因CFHL3中的至少一种的至少一种抑制剂在制备治疗AMD的药物中的用途。根据本发明的第四个方面，提供了治疗AMD的方法，其包括向需要其的患者提供全部或部分沉默基因CFHL1和/或基因CFHL3中的至少一种的至少一种抑制剂的步骤。在本发明第二、三和四方面的特定实施方案中，所述至少一种抑制剂可以是本文讨论的反义分子或RNAi。在本发明第一、二、三和四方面的特定实施方案中，全部或部分沉默基因CFHL1和/或基因CFHL3中的至少一种的至少一种抑制剂可以和另一种治疗組合提供。在本发明第一、二、三和四方面的特定实施方案中，全部或部分沉默16基因CFHL1和/或基因CFHL3中的至少一种的至少一种抑制剂可以和抗-VEGF治疗组合提供。抗-VEGF治疗针对VEGF(血管内皮生长因子)，一种帮助新血管形成的蛋白质。在AMD中，已表明新血管是不稳定的并且倾向于在视网膜下泄漏液体和血液。认为这造成瘢痕形成，而瘢痕形成引起不可逆的视力损失。在AMD的情形中，认为抗-VEGF治疗抑制新血管的生长，并因此将瘢痕形成风险降至最小。抗-VEGF治疗包括，例如，Macugen(咪加他尼钠)、阿瓦斯丁(Avastin)、Lucentis(雷珠单抗注射液)或类似治疗。适当地，全部或部分沉默基因CFHL1和/或基因CFHL3中的至少一种的至少一种抑制剂可以和将患者吸烟的可能性降至最小的药物(例如戒必适(Champix)、安非他酮或类似药物)组合提供。治疗"治疗，，包括有益于人或非人动物的任何方法。所迷治疗可以是针对已存在的AMD病症或可以是预防性的(预防性治疗)。治疗可以包括AMD的治愈、緩解或预防效应。施用本发明的CFHL1和CFHL3抑制剂和用于本发明的CFHL1和CFHL3抑制剂可以以任何合适的方式施用。此外，它们可以組合使用或与其他治疗組合使用。在这样的实施方案中，本发明抑制剂或组合物可以和另一种化疗剂同时、分别或顺序施用。当分别或顺序施用时，它们可以在彼此的任何合适的时间段内施用，例如在l、2、3、6、12、24、48或72小时内。在优选的实施方案中，它们在彼此的6小时内、优选地2小时内、更优选地1小时内、最优选地20分钟内施用。在一个优选的实施方案中，本发明的抑制剂和/或组合物作为药物组合物施用，所述药物组合物将通常包括依据预期施用途径选择的合适的药学赋形剂、稀释剂或载体。本发明的抑制剂和/或组合物可以经任何合适的途径施用于需要治疗的患者。通过使用诸如抗体或细胞特异性配体的靶向系统，可以使用靶向治疗更加特异地将活性剂传递到某些类型的细胞。可能由于多种原因而需要靶向，例如如果所述剂有不可接受的毒性，或者如果它此外需要太大的剂量，或者如果它此外不能进入靶细胞。对于静脉注射或在患病部位的注射，活性成分将是胃肠外可接受水溶液的形式，所述水溶液是无热原的并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域技术人员能够很好地使用，例如，诸如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液的等渗^!某介物制备合适的溶液。如果需要，也可以包括防腐剂、稳定剂、緩冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。因此，本发明包括含有本发明第一个方面的药物的药物组合物。口服施用的药物组合物可以是片剂、胶嚢剂、粉剂或液体形式。片剂可以包括诸如明胶或佐剂的固体载体。液体药物组合物通常包括诸如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油的液体载体。可以包括生理盐水溶液、右旋糖或其他糖溶液或诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇的二醇。本发明抑制剂和/或组合物也可以经微球、脂质体、其他微粒传递系统或置于包括血液的某些组织的緩释制剂来施用。緩释载体的适当实例包括分份产品(sharedarticles)形式的半透过性聚合物基质，如栓剂或微胶囊。可植入的或微胶囊化的緩释基质包括聚交酯(polylactide)(美国专利第3,773,919号；EP-A-0058481)、L-谷氨酸和yL-谷氨酸乙酯的共聚物(Sidman等人，Biopolymers22(1):54孓556，1985)、聚(异丁烯酸2-羟乙酯)或乙烯醋酸乙烯酯(Langer等人，J,Biomed.Mater,Res.15:167-277，1981和Langer,Chem.Tech.12:98-105，1982)。含有多肽的脂质体由以下熟知的方法制备DE3,218,121A;Epstein等人，PNASUSA，82:3688-3692，1985;Hwang等人，PNASUSA,77:4030-4034,1980;EP-A-0052522;E-A-0036676;EP-A-0088046;EP-A-0143949;EP-A-0142541;JP-A-83-11808;美国专利第4,485,045和4,544,545号。通常，脂质体是小(约200-800埃)单层型，其中脂质含量超过约30mol.。/o胆固醇，调节选择的比例至多肽渗漏的最佳速率。以上提及的技术和方案以及根据本发明可以使用的其它技术和方案的实例参见Remington'sPharmaceuticalSciences(雷明顿氏药物科学)，第16版，Oslo,A.(编)，1980。药物组合物除了活性成分外，依据本发明的药物组合物和依据本发明使用的药物组合物还可以包含药学可接受赋形剂、载体、緩冲剂、稳定剂或本领域技术人员所熟知的其他材料。所述材料应该是非毒性的并且应该不干扰活性成分的功效。载体或其他材料的精确性质将取决于施用的途径，所述施用途径可以是口服或通过注射，如静脉内注射。所述制剂可以是液体(例如pH6.8-7.6的含有非磷酸緩冲剂的生理盐溶液)或冻干粉末。剂量本发明的抑制剂或组合物优选以"治疗有效量"施用于个体，所述治疗有效量足以对个体产生益处。施用的实际量和施用速率和时间进程将取决于所治疗疾病的性质和严重性。诸如剂量的确定等治疗处方最终由全科医生和其他医生负责和判断，并且通常考虑治疗的疾患、具体患者的病症、递送部位、施用方法以及医生所知的其他因素。本发明人确定了与AMD相关的新型基因多态，因此本发明第五个方面是至少一种包含分离的多核苷酸序列的探针，所述多核苷酸序列含有一种或多种选自以下列表的多态SNP编号SNP名称1rsl2924872rs5129003rs75247764rs5298255rs8002926rs13294247rsl0611478rsl0611709rsl080155510rs20197271911rs201972412rs20368513rsl83128114rs227470015rs667760416rs375339617rs41913718rs228466419rsl06548920rsl080156021rs46089722rs43200723rs43878124rs40851925rs642837226rsl092214727rsl97157928rs408574929rsl092215230rs5998适当地，至少一种包含分离的多核苷酸序列的探针，所述多核苦酸序列含有一种或多种选自以下列表的多态5rs8002928rsl06117015rs667760416rs375339617rs41913718rs2284664如本文所用，术语"含有一种或多种多态的分离的多核苷酸序列"是含有本发明SNP并且与存在于所述核酸的天然来源中的其他核酸分离的多核苷酸序列。分离的多核苷酸序列可以是诸如mRNA的RNA形式，或包括基因组DNA或cDNA的DNA形式。可选地，可以通过化学合成方法获得多核香酸序列。所述多核香酸序列可以是双链的或单链的。特定SNP对AMD疾病表型的贡献或联系使得能够将SNP用于发展高级诊断检测，所述检测能够鉴别表达可检测性状的个体和确定他们处于增加/减少的在稍后的时间发展AMD的风险。诊断可以基于单一SNP或一组SNP。多个SNP的组合检测通常增加准确诊断的可能性。可以使用本领域技术人员所知的方法确定存在或缺少用来诊断AMD、预测对AMD的易感性或监测患有AMD的受治疗者的特定SNP/单倍型(haplotype)，所述方法包括，例如，对来自受治疗者的样品的核酸进行酶扩增，接着进行DNA序列分析、引物延伸方法或质谱法。对疾病患者和未受影响的对照的关联研究可以表明何种多态和/或单倍型提供疾病的防护或增加疾病的风险。本领域技术人将理解，在本申请中已经表明特定SNP处，可以应用可选SNP定义其中所述可选SNP与已定义的那些完全连锁不平衡的每个遗传基因座的单体型结构。国际人类基因组单体型图计划(internationalhapmapproject)和其他基因组测序工作已经阐明了普通单体型上的多态模式。通常可以定型多态变体的不同组合，以获得个体全部的单体型信息。这些标记的组合被称为单体型标记多态。根据本发明第六个方面，提供了诊断和/或监测受治疗者的老年性黄斑变性的诊断试剂盒，所述试剂盒包含与多核苷酸序列具有结合特异性的检测试剂，所述多核苷酸序列含有一种或多种选自以下列表的多态SNP编号SNP名称1rs12924872rs5129003rs75247764rs5298255rs8002926rs13294247rsl0611478rsl0611709rsl080155:10rs201972711rs201972412rs20368513rsl83128114rs227470015rs667760416rs375339617rs41913718rs228466419rsl0654892120rsl080156021rs46089722rs43200723rs43878124rs40851925rs642837226rs1092214727rs197157928rs408574929rs1092215230rs5998或与由多核苷酸序列编码的分子具有结合特异性的检测试剂，所述多核苷酸序列含有一种或多种选自以下列表的多态SNP编号SNP名称1rsl2924872rs5129003rs75247764rs5298255rs8002926rsl3294247rsl0611478rsl0611709rsl080155510rs201972711rs201972412rs20368513rsl83128114rs227470015rs667760416rs375339617rs41913718rs228466419rsl06548920rsl080156021rs46089722rs43200723rs43878124rs40851925rs642837226rs1092214727rsl97157928rs408574929rs1092215230rs599822在某些实施方案中，所迷试剂盒包含至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少十种、至少十五种与多核苷酸序列具有结合特异性的检测试剂，所述多核苦酸序列含有一种或多种选自以下列表的多太.SNP编号SNP名称1rs12924872rs5129003rs75247764rs5298255rs8002926rsl3294247rsl0611478rsl0611709rsl080155510rs201972711rs201972412rs20368513rsl83128114rs227470015rs667760416rs375339617rs41913718rs228466419rsl06548920rsl080156021rs46089722rs43200723rs43878124rs40851925rs642837226rs1092214727rsl97157928rs408574929rsl092215230rs5998或与由至少一种所述多核苷酸序列编码的多肽具有结合特异性的检测试剂。适当地，至少一种检测试剂与多核苷酸序列具有结合特异性，所述多核普酸序列含有一种或多种选自以下列表的多态235rs8002928rsl06117015rs667760416rs375339617rs41913718rs2284664适当地，所述^T测试剂可以是与多核苷酸序列互补的核苷酸序列，所述多核苷酸序列含有本申请鉴别的编号为1至30的任何SNP，或是与可选的SNP互补的核苷酸序列，所述可选的SNP与已定义的那些处于完全连锁不平衡，SNP定义遗传标记的单体型结构。互补指当检测试剂为核苷酸序列时，其将在至少严格条件下与含有编号为1至30的任何SNP的多核苷酸序列杂交。应理解，当提及特定的SNP时，由于核酸可以是双链分子，因此一条链上的SNP的提及将依次指互补链上的对应位置。寡核苷酸探针或引物可以设计为与任何链杂交。在某些实施方案中，所述检测试剂是用报道分子(reporter)标记的。在某些实施方案中，所述:^艮道分子是荧光的。在某些实施方案中，所述检测试剂被结合到固相支持体。在特定的实施方案中，所述检测试剂被结合到作为不同分子的阵列的固相底物，包括纸、尼龙、过滤器或膜、芯片、载玻片。在某些实施方案中，所述检测试剂在固相支持体上合成。可以根据美国专利第5，837,832号和PCT申请WO95/1995中公开的方法提供和使用阵列。在某些实施方案中，所述检测试剂是所述多核苷酸序列的阵列，其中所述多核苷酸序列被固定在计算机芯片上，并且可以使用计算机技术检测样品核酸分子与阵列的杂交。因此，本发明第七个方面提供了至少一个阵列，其包含能够与至少两种遗传标记杂交的至少两种多核苷酸序列，所述遗传标记选自含有一种或多种选自以下列表的多态的多核苷酸序列SNP编号SNP名称1rsl2924872rs5129003rs75247764rs5298255rs8002926rsl3294247rsl0611478rsl0611709rsl080155510rs2019727nrs201972412rs20368513rsl83128114rs227470015rs667760416rs375339617rs41913718rs228466419rsl06548920rsl080156021rs46089722rs43200723rs43878124rs40851925rs642837226rsl092214727rsl97157928rs408574929rsl092215230rs5998适当地，所述阵列包含至少两种能够与至少两种遗传标记杂交的多核苷酸序列，所述遗传标记选自含有一种或多种选自以下列表的多态的多核苷酸序列5rs8002928rsl06117015rs667760416rs375339617rs41913718rs2284664所迷阵列可以用于诊断老年性黄斑变性，其通过确定来自受治疗者的生物样品的遗传图谱(geneticprofile)来确定存在或缺少用于诊断老年性黄斑疾病或监测其进展的遗传标记。在特定的实施方案中，至少一种阵列包含能够与遗传标记杂交的三种或更多，例如四种多核苷酸序列、五种多核苷酸序列、六种多核苦酸序列、十种多核香酸序列、十五种多核香酸序列，所述遗传标记选自含有一种或多种选自以下列表的多态的多核普酸序列SNP编号SNP名称1rs12924872rs5129003rs75247764rs529825行。本领域技术人员非常了解变化杂交条件以选择特定样品最合适的严格910111213141516171819202122232425262728293067rs800292rsl329424rsl061147rsl061170rsl0801555rs2019727rs2019724rs203685rsl831281rs2274700rs667760rs3753396rs419137rs2284664rs1065489rsl0801560rs460897rs432007rs438781rs408519ts6428372rs10922147rsl971579rs4085749rsl0922152rs5998性程度的技术。例如，当使用非严格洗涤緩冲液和严格洗涤緩冲液时，本领域普通技术人员可以改变各自洗涤的次数(通常0-20次)，洗涤温度(通常15-50。C)和杂交温度(通常15-50。C)以实现最佳杂交。本领域技术人员熟知优化杂交条件的方法(参见例如LABORATORYTECHNIQUESINBIOCHEMISTRYANDMOLECULARBIOLOGY(生物化学和分子生物学实验技术)，第24巻HybridizationW他NucleicAcidProbes(核酸探针的杂交)，P.Tijssen编，Elsevier，N.Y.，(1993》。本领域普通技术人员可以调节杂交因子以为给定杂交程序提供最佳杂交和信号产生，和提供不同的基因或基因组位置(genomiclocation)之间所需的分辨率。然后可以检测到严格条件下生物样品中的转录物与阵列上的互补序列的杂交或结合。严格条件下的杂交意在描述相互有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或更高的同源性的核芬酸序列保持相互杂交的条件。这种严格条件为本领域技术人员所熟知，例如CurrentProtocolsinMolecularBiology(分子生物学最新方案)，JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)。本领域普通技术人员容易确定杂交反应的"严格性，，，并且其通常是根据探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算。通常，较长探针需要较高的温度以适当的复性，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于变性DNA在当互补链出现在低于它们的解链温度的环境中时重退火的能力。探针和杂交序列之间预期的同源性程度越高，可以使用的相对温度就越高。结果就是较高的相对温度将使反应条件更加严格，而较低温度就不那么严格。有关杂交反应严格性的其他细节和解释参见Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology(分子生物学最新方案)，Wileylnterscience出版社，(1995)。如本文所定义，"严格条件"可以由以下内容鉴别(l)使用低离子强度和高温度进行洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.P/o十二烷基硫酸钠，50°C;(2)杂交过程中使用诸如甲酰胺的变性剂，例如50%(v/v)甲酰胺和0.1%牛血清白蛋白/0.1%菲可(Ficoll)/0.1。/。聚乙烯吡咯烷酮/pH6.5的50mM磷酸钠i爰沖液(含有750mM氯化钠、75mM4宁檬酸钠)，42°C;或(3)使用50。/o曱酰胺、5承SSC(0,75MNaCl、0,075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1%焦磷酸钠、5*Denhardt溶液、超声鲑精DNA(50[mu]g/ml)、0.1%SDS和10%^克酸葡聚糖，42°C,并在42。C下洗涤，以及在0.2乡SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50%甲酰胺中，55°C,接着进行由含有EDTA的0.1*SSC和55'C组成的高严格性洗涤。"适度严格条件，，可以根据Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆实验手册)，纽约冷泉港出版社，1989中的描述来鉴别，并且包括使用没有以上描述严格的洗涤溶液和杂交条件(如温度、离子强度和。/。SDS)。适度严格条件的实例是37。C在溶液中过夜孵育，所述溶液包括20%曱酰胺、5*SSC(150mMNaCl、15rnM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5xDenhardt溶液、10%^酸葡聚糖和20mg/mL变性剪切鲑精DNA，接着在约37-50。C下在1*SSC中洗涤滤器(filter)。熟练的技术人员将知道如何根据需要调节温度、离子强度等，以适应诸如探针长度和类似因素。高严格条件可以基于以上条件，只是接着在2SSC中，约5(TC下洗涤滤器。非常高严格是接着在6-SSC，约65t;下洗涤滤器。阵列中使用的核酸序列可以是任何类型的核酸或核酸类似物，包括且不限于RNA、DNA、肽核酸或其混合物和/或片段。如本文所用，术语"片段，，是指作为诸如本文提供的序列的一部分的核苷酸序列，其保留足以允许所述片段保持对其起源的全部序列的特异性和选择性的核苷酸序列。在特定的实施方案中，如果有大量DNA可用，可以直接使用基因组DNA。可选地，可以将感兴趣的区域克隆到合适的载体并扩增足够的数量用于分析。可通过诸如聚合酶链式反应(PCR)(Saiki等人，(1985)Science239:487)的常规技术扩增核脊酸序列。可以使用引物扩增编码感兴趣多肽的序列。任选地，可以在所述扩增反应中使用例如荧光染料、生物素或放射性标记的可检测标记。标记可以结合到引物之一或两者上。可选地，标记扩增中使用的核苷酸库，以将标记掺入扩增产物。可以使用本领域所知的任何合适方法分析诸如扩增的或克隆的样品核酸。例如，核酸可以通过双脱氧法或其他方法测序，然后将碱基序列与缺失的序列进行比较。通过DNA印迹、点印迹等，可以使用与变体序列的杂交以确定其存在。对照和变体序列与固定于固相支持体的寡核苷酸探28针阵列的杂交模式(参见WO95/35505)可以用作检测序列存在或缺少的方法。可选地，使用本领域标准技术，可以使用编码多肽的核酸或事实上所述多肽的特异性抗体的存在。此外，可以使用所述多肽的特异性抗体的存在来确定对所迷多肽免疫应答的存在。本领域技术人员十分了解基因形式的细胞DNA被转录成RNA;编码RNA被翻译成蛋白质；并且RNA任选地逆转录成cDNA。特定遗传标记的存在可以通过使用本领所知的任何方法检测由多核苷酸序列编码的多肽或其免疫应答确定，所述多核苦酸序列含有一种或多种选自以下列表的多态SNP编号SNP名称1rsl2924872rs5129003rs75247764rs52982567891011121314151617181920212223242526272829rs800292rsl329424rsl061147rsl061170rsl0801555rs2019727rs2019724rs203685rsl831281rs2274700rs6677604rs3753396rs419137rs2284664rsl065489rsl0801560rs460897rs432007rs438781rs權519rs6428372rsl0922147rsl971579rs4085749rs109221522930rs5998适当地，所迷方法包括，例如，ELISA分析法或RIA。在一个实施方案中，可以确定样品中多肽的存在；可选地或额外地，可以确定所述多肽的特异性抗体的存在；可选地或额外地，确定编码所述抗体或所述多肽的多核苷酸序列的存在。因此，本发明更进一步的方面提供了多肽阵列，其中所述多肽阵列包含由任何一种多核普S臾序列编码的多肽，所述多核苷酸序列含有一种或多种选自以下列表的多态SNP编号SNP名称1rs12924872rs5129003rs75247764rs5298255rs8002926rsl3294247rsl0611478rsl0611709rsl080155510rs201972711rs201972412rs20368513rsl83128114rs227470015rs667760416rs375339617rs41913718rs228466419rsl06548920rsl080156021rs46089722rs43200723rs43878124rs40851925rs642837226rs1092214727rsl97157928rs408574929rsl092215230rs599830或与由任何一种多核苷酸序列编码的多肽具有结合特异性的至少一种抗体，所述多核苷酸序列含有一种或多种选自以下列表的多态SNP编号SNP名称1rsl2924872rs5129003rs75247764rs5298255rs8002926rsl3294247rsl0611478rsl0611709rsl080155510rs201972711rs201972412rs20368513rsl83菌14rs227470015rs667760416rs375339617rs41913718rs228466419rsl06548920rs雨0156021rs46089722rs43200723rs43878124rs40851925rs642837226rsl092214727rsl97157928rs408574929rsl092215230rs5998适当地，所述阵列包含由任何一种多核普酸序列编码的至少一种多肽，所述多核苷酸序列含有一种或多种选自以下列表的多态5rs8002928rsl06117015rs667760416rs375339617rs41913718rs2284664或与由任何一种多核苦酸序列编码的多肽具有结合特异性的至少一种抗体，所述多核苷酸序列含有一种或多种选自以下列表的多态5rs8002928rsl06117015rs667760416rs375339617rs41913718rs2284664如本文所用，术语抗体与本领域中的定义一致并且包括单克隆抗体、多克隆抗体、所述抗体的片段，包括且不限于Fab、F(ab，)和Fv片段。已知许多产生和/或鉴别已知靶肽的抗体的方法。本领域技术人员将理解现有的技术，例如向包括兔、大鼠或小鼠的哺乳动物生物体提供分离的多肽以产生免疫应答，可以容易地用于提供合适的抗体。如本领域技术人员能够理解的，单克隆抗体可以由杂交瘤产生。杂交瘤是无限增殖化细胞系，其可以使用两种不同细胞类型在体外制备，所述两种不同细胞类型之一为肿瘤细胞，以制备能够分泌特异性单克隆抗体的细胞。本领域已知检测多肽或所述多肽免疫应答的存在的诊断和测定方法。例如，多肽的存在可以使用所述多肽的特异性抗体检测。可以使用的技术包括但不限于ELISA、免疫组织化学、电子显微术、乳胶凝集、免疫印迹、免疫色谱法、免疫芯片、側流免疫测定法(lateralflowimmunoassays)和DipStick免疫测试。ELISA试验(酶联免疫吸附测定)经常用于血清学诊断。这一方法提供生物液体中抗原或抗体的鉴别和定量。常规的ELISA在于通过结合于酶活性(过氧化物酶、碱性磷酸酯酶和其他)的第二种抗体(针对与抗原反应的抗体)检测抗体-抗原复合体。在乳胶凝集测定中，抗原制品被粘附到乳胶微球上。然后生物样品和乳胶颗粒直接在栽玻片上孵育。一小段时间内，检查反应中交联或凝集的乳胶颗粒的存在，指示样品中多肽抗体的存在。可以使用免疫芯片确定本发明特异性遗传标记的存在。通常，抗原的特异性抗体被固定于转导器上，如电极、量热器、压电晶体、表面等离子体共振转导器、表面声共振转导器或其他光检测设备。通过电信号的变化32检测生物样品中抗原与固定的特异性抗体的结合。可以通过检测编码抗原或编码针对所述抗原产生的抗体的核酸检测免疫原性抗原的存在。这种技术为本领域所熟知。本发明人对与AMD有关的多态的确定也可以用于受治疗者AMD的诊断。因此，本发明的进一步方面提供了诊断受治疗者老年性黄斑变性或预测其易感性的方法，所述方法包括以下步骤提供来自所述受治疗者的生物样品；确定生物样品中存在或缺少至少一种遗传标记，其中所述遗传标记选自多核普酸序列，所述多核苷酸序列含有一种或多种选自以下列表的多态SNP编号SNP名称1rsl2924872rs5129003rs75247764rs5298255rs8002926rsl3294247rsl0611478rsl0611709rsl080155S10rs201972711rs201972412rs20368513rsI83128114rs227470015rs667760416rs37533%17rs41913718rs228466419rsl06548920rsl080156021rs46089722rs43200723rs43878124rs40851925rs642837226rsl092214727rsl97157928rs408574929rsl092215230rs5998或由少一种所述多核苷酸序列编码的多肽，其中存在和/或缺少遗传标记指示受治疗者发展老年性黄斑变性(AMD)的风险。适当地，使用以上鉴别的多态检测所述遗传标记。适当地，所述遗传标记选自多核苷酸序列，所述多核苷酸序列含有一种或多种选自以下列表的多态5rs歸2928rsl06117015rs667760416rs375339617rs41913718rs2284664预测受治疗者疾病发作允许了早期的干预和疾病管理，例如向患者提供诸如咨询的支持服务。因此，疾病的早期检测能够使患者的治疗和管理在早期进行。本发明提供了可以用于确定AMD发作的方法。本方法可以在通常用于诊断老年性黄斑变性的症状出现前使用。因此，在本发明优选的实施方案中，可以提供来自没有AMD身体症状的受治疗者的生物样品。任何合适的生物样品均可以用于本发明的方法中。例如，所述生物样品可以选自包括但不限于诸如痰、唾液、血浆、血液、尿的生物液体或诸如组织活体解剖物的组织的组。在本发明的方法中，发明人认为通过检验多种遗传标记例如至少两种遗传标记、至少三种遗传标记、至少四种遗传标记、至少五种遗传标记、至少六种遗传标记、至少十种遗传标记、至少十五种遗传标记的存在，，提高了诊断或预测疾病发作的方法的灵敏度。在本方法优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤34提供来自受治疗者的生物样品；确定生物样品中存在或缺少两种或多种遗传标记，其中所述遗传标记选自多核苷酸序列或由至少一种所述多核苷酸序列编码的多肽，所述多核苷酸序列含有一种或多种选自以下列表的多态SNP编号SNP名称1rs12924872rs5129003rs75247764rs5298255rs8002926rs13294247rsl0611478rsl0611709rs鄉0155510rs201972711rs201972412rs20368513rsl83128114rs227470015rs667760416rs375339617rs41913718rs228466419rsl06548920rs1080156021rs46089722rs43200723rs43878124rs40851925rs642837226rs1092214727rsl97157928rs408574929rsl092215230rs5998其中存在和/或缺少遗传标记指示受治疗者发展老年性黄斑变性(AMD)的风险。适当地，所述遗传标记选自多核苷酸序列，所述多核苷酸序列含有一种或多种选自以下列表的多态355rs8002928rs薩17015rs667760416rs375339617rs41913718rs2284664根据本发明进一步的方面，提供了从第一时间点到较晚时间点监测老年性黄斑变性进展的方法，所述方法包括以下步骤提供第一时间点获得的第一生物样品，确定所述生物样品中存在或缺少至少一种遗传标记，其中所述遗传标记选自多核苦酸序列或由至少一种所述多核苷酸序列编码的多肽，所述多核苷酸序列含有一种或多种选自以下列表的多态SNP编号SNP名称1rsl2924872rs5129003rs75247764rs5298255rs8002926rs13294247rsl0611478rs腿1709rsl080155510rs201972711rs201972412rs20368513rsl8312Sl14rs227470015rs667760416rs375339617rs41913718rs228466419rsl06548920rsl080156021rs46089722rs43200723rs43878124rs40851925rs642837226rs1092214727rsl9715793628rs408574929rsl092215230rs5998提供在较晚时间点获得的第二生物样品，确定所述第二生物样品中存在或缺少至少一种遗传标记，其中所述遗传标记选自多核苷酸序列或由至少一种所述多核苷酸序列编码的多肽，所述多核苷酸序列含有一种或多种选自以下列表的多态SNP编号SNP名称1rsl2924872rs5129003rs75247764rs5298255rs8002926rsl3294247rsl0611478rsl0611709rsl080155510rs201972711rs201972412rs20368513rsl83128114rs227470015rs667760416rs375339617rs41913718rs228466419rsl06548920rsl080156021rs46089722rs43200723rs43878124rs40851925rs642837226rsl092214727rs簡57928rs408574929rsl092215230rs5998对比第一样品中与第二样品中所述遗传标记和/或多肽的缺少和/或存在；其中第一样品中与第二样品中的遗传标记和/或多肽的存在和/或缺少37的差异指示受治疗者发展AMD的风险的变化。适当地，所述遗传标记选自多核苷酸序列，所述多核苷酸序列含有一种或多种选自以下列表的多态5rs8002928rsl06117015rs667760416rs375339617rs41913718rs2284664在本发明方法的特定实施方案中，所述方法包括确定第一和第二样品中至少三种遗传标记和/或多肽、至少四种遗传标记和/或多肽、至少五种遗传标记和/或多肽、至少六种遗传标记和/或多肽、至少十种遗传标记和/或多肽、至少十五种遗传标记和/或多肽的存在和/或缺少。适当地，在本方法的某些实施方案中，在提供第一和第二生物样品之间的时段，可以向受治疗者提供可能的治疗剂，并且可以将各自生物样品的遗传标记/多肽的检测与所述受治疗者对针对老年性黄斑变性的可能治疗剂的效力和反应性的数椐联系起来。适当地，本文提供了筛选和选择治疗剂的方法，并且还提供了鉴别可能响应特定治疗剂的受治疗者的方法。适当地，可以评估受治疗者的药物基因组学易感性以提供响应药物或对药物的异常作用的遗传变异的细节。除非上下文另有要求，本发明每个方面的优选特征和实施方案加以必要变更而适用每个其他方面。参考附图，仅作为例子说明本发明的实施方案，其中图1显示CF/f中的域结构(blockstructure)和单体型之间的关系。图2显示CF/f、CFf江3、CFHU和CF7ft4的组织结构(organisation)。序列显示对从两个基因座共扩增的产物的单体型5(下方迹线(trace))和所有其他单体型代表(上方迹线)的分析。基因下面的PCR产物显示单体型5中CF//和CF/tt4，而不是C7^/ZJ或CEfflJ的扩增(使用基因特异性引物)。本发明人已经在172例具有严重新生血管性AMD和173例没有AMD38病征的老年对照中基因分型(genotype)了染色体lq23上跨CFH簇和五种CFH样基因的多态。对所有单体型的详细分析揭示20%对照染色体中CFHL1和CFHL3的共同缺失，其强烈预防AMD的发展，并且比Y402H更加显著。本研究的患者招募于眼科门诊并且具有与更加严重的渗出性或湿型AMD相关的脉络膜新生血管。年龄相符的对照没有老年性黄斑变性的病征。发明人在CF//区中分型了24个SNP，包括最常见的cSNP和选择用于确认全部单体型信息的其它内含子型SNP和基因间SNP。数据证实了CF/f和AMD2-5之间强烈相关，这在单独评估SNP和通过单体型评估中显而易见(表la、b)。在整个区域中，具有大范围的连锁不平衡(LD)。除了rsl065489以外，CF//中分型的所有SNP均位于三个跨度分别为45、19和84kb的大单体型域(haplotypeblock)中(图1)。域3标记从CF//的内含子21延伸至CF/ah基因分型允许区别在最终的单体型图(HapMap)数据6中找到的频率大于1%的所有单体型。域3中的SNP返回显著较低的Illumina基因分型质量分数，说明可能受这一区域的重复性质影响的同一基因型样品的较低聚类(clustering)，然而，属于HardyWeinberg平衡的这些标记的基因型在它们的单体型域中显示完全的LD，并与相邻的域2的单体型显示强烈的LD。在每个域内，单体型的影响范围是从对AMD严重有害到对AMD高度保护。在域1中，rs1061170(Y402H)表征与增加的AMD风险相关的两种单体型之一。然而，对AMD状态更加重要的是强烈保护性的单体型，其在所有域上显示LD的近固体脊(near-solidspine)。此共同单体型发现于20%的对照染色体中，并且在域3中勉强给予其3.06的最佳保护优势率(oddsratio)。其可通过域3中rs460897的C等位基因或域2中rs6677604的A等位基因唯一地标记。单独地，单体型域2中的rs2274700是病例状态(easestatus)的最佳单一预测者(p^.68xl(T9)。rs2274700的G和A等位基因在密码子473处均编码丙氨酸，并且认为所迷多态不具有影响剪接的任何功能作用，然而它最佳地区分了有害单体型组和有益单体型組。本发明人的目标是识别强烈保护性单体型5(域2:11112;域3:22221)的遗传基础。值得关注的是rs460897研究中明显可靠的分型，rs460897是先前确认的非同义SNP,其被报道在最后一个外显子中编码c.35720T(S1191L)。此外显子的参照编码序列与的最后一个外显子享有99%的同源性，只是在c.3572和c.3590处不同。rs460897的基因分型可能用缺失或转变(conversion)产生的分型结果说明CW/外显子23和C7^ffl:7外显子6处的等位基因的贡献。对于域2中五个单体型的每一个以及域3的相关单体型，选择基因特异性引物测序这些来自纯合个体的DNA中的外显子。它们没有表现出在与任何单体型关联(inassociationwith)的CFH外显子23中的变化。对于保护性单体型5，在纯合子中未扩增出的外显子6(图2)。在所有其它单体型中，外显子6在预期位点处与CF//不同，并且在SNPrs4320(c.906G〉T)和rs414628(c.942A〉T)处表现出单体型特异性变异。由携带一个拷贝的单体型5的杂合个体测序的所有28个样品表现出在所有CFHZJ外显子6SNP位点(包括稀少等位基因的10个位点)处纯合。不存在任何杂合性为外显子6的单体型5缺失提供了强大的支持。使用与CFH和CFHZJ中的共同位点退火的引物的共扩增，证实了单体型5纯合子中的缺失。PCR产物的测序显示单体型5仅扩增CF仏而所有其它单体型扩增两种基因，揭示了a^/和Cf7/丄/之间差异位点处的假SNP(pseudoSNP)(图2)。使用CF//内含子21和内含子4的共同引物的共扩增相似地显示了CF/a7内含子4的缺失(图2)，所述引物分别扩增324和380bp的产物。使用对O^L3外显子6和位于不完全相同区域侧翼的CFKL4特异的引物仅在纯合子中扩增CF/ZZ^序列，表明CFH丄3也从单体型5中缺失(图2)。还没有测量缺失的精确位置和大小，然而，根据染色体物理图谱中两个大片段重复之间的间距预测其约为80kb7。其没有延伸远至CF/tt4，在CF/ft4处插入了包围(surro皿ding)rs2274700的C7^/外显子11序列的有瑕疵的拷贝，并所述拷贝保留于所有单体型上(图2)。这一重复不干扰使用延伸反向引物的rs2274700的分型。仅位于内含子15的SNPrsl410996与rs2274700是绝对的连锁不平衡(数据未显示)。在十分复杂的重复区域中，不能直接建立基因组装配。检查了物理图谱所依据的序列数据，所述数据与CFH和相关基因的排列相符。本数据40不支持可选的Celera结构(其中Cf7/的末端外显子与是等位的，并且CFHL3和CFHL4之间具有相似的关系)，并且也不支持CFH向CFHZJ的基因转变。本发明人使用多重连接依赖性探针扩增技术(MLPA)8测量CFH外显子23和C77K7外显子6的拷贝数量。测定集中于CF/fc.3572C/CF/K/c.869T,并且基因特异性探针的杂交部分仅在一个关键碱基处不同。当涉及A^C^i^L7外显子9的常染色体标记和SG4尸37(其在雄性中修正性另iJ)的外显子6的X连锁标记时，在来自携带0、l或2个拷贝的单体型5的个体的雄性和雌性DNA样品中，CF/Z外显子23的拷贝数量保持恒定(l.00/1.04/1.06)。如所预期，在单体型5的杂合子和纯合子中，CPHL7的拷贝数量分别从1下降到0.44和0。CFH和CFHL1是更加重要的补体活性调节子，并且与其它CFH相关蛋白质相比，它们以更高的水平表达，因此可以假设在预防AMD中，Ci^fflJ的缺失可以比CFfflJ更加显著。CF/Z和CFffl^以高水平存在于循环中并且均用作因子I介导的C3b降解的辅因子"o。一些关于CFF丄7缺失如何可以预防AMD的观点来源于引起尿毒综合征的CFH突变的研究7(HUS;OMIM#235400)。超过75%的已知HUS突变聚类于CFi/的外显子，所述外显子与CF/a/具有同源性11—13。早期外显子的突变倾向于影响血浆中CFH蛋白质的稳定性而不是其功能。在外显子23中发现了分开或一起的c.3572C〉T(S1191L)和c.3590T〉C(V1197A)。可能是具有两种突变的HUS患者可以具有与预防AMD的突变相似的缺失，但其具有更早的断点。这将导致CF/Z转变为CfH丄i并删除Cf7/ZJ，而不是删除O^U和CFHU，后者预防AMD。这些HUS变异引起减少的C3b结合和降低的控制细胞表面上补体活化的能力7。在HUS患者中用CFHZJ的最后一个外显子代替最后一个CFH外显子的影响导致微血管病变性肾病，我们的患有视网膜新血管出血的严重AMD患者也一样。CF/f基因簇负责许多可变剪接的转录物和蛋白质。CF/ft7的最后一个外显子可以被可变剪接为CF/f,并且CEfflJ和CF/fL7的外显子可以加入其它转录物。需要许多工作来解释这些基因DNA水平上的复杂性和源自这一高度重复的基因簇的转录物和蛋白质的复杂性。可以预期其他的缺失或重排。总之，目前的数据支持一种模型，其中需要CFH维持健康的微血管系统，并且最好将41CFH"看作有害的干扰片段。老年性黄斑变性的发病率与人群寿命的增加平行增长。在没有有效治疗时，AMD提出很大的挑战。开始解决C7^7/和相关基因在AMD易患病体质中的复杂作用可以对其病因学有所启发并且在将来提供基因沉默的有效治疗靶。方法DNA提取、基因分型和测序所有的参与者招募于北爰尔兰、英国，并且是白种人血统。通过标准方法从外周血提取DNA。作为更大计划的一部分，高通量SNP基因分型由外界提供(outsource)，使用基于多重PCR和引物延伸的Illumina微珠技术(Illumina，圣地亚哥，美国)。其它SNP在内部(in-house)分型，使用多重PCR，接着是多重SNaPshot(ABI)技术。使用PrimerDetective(Clontech)设计引物。用于和相关基因的特异性和非特异性扩增的引物序列可在线获得。使用ABI染料终止子化学v3(ABIdyeterminatorchemistryv3)执行测序，在ABB100基因分析仪上分析。我们使用Sequencher程序(Genecodes)比较DNA序列。对SNP基因型进行编号，用1指示A或T等位基因，并用2指示C或G等位基因。在两个A/TSNPrs2019727和rs438781中，正向的A等位基因用l指示。统计方法将基因型数据以连锁格式载入Haploview14(www.broad.mit.edu/mpg/haploview/),以产生病例和对照等位基因和单体型数量和比例，和基于关联等位基因或单体型频率的卡方检验的P值。我们的病例:对照研究中使用了来自172个病例和173个对照的数据。MLPA使用来自MRC荷兰的緩冲剂、酶和PCR引物根据他们的方案对100ngDNA执行MLPA。将杂交探针序列X-CFH-1191C或X-CF/KJ-1191T用于单独与共同的PHO标记的寡CF/fll91-Y的反应。在所有的反应中包括使用MO^F礼7和SG4尸37的对照。分析是基于峰高，并且与峰面积很好地相关。所有MLPA寡聚物均可在线获得。GenBank登录号OT7恵000186;CF脂BC016755;CF脂BC022283;CF瓜5AK124051;CF//Z￥BC074957。CF//外显子的编号包括外显子10，其可变剪接为这一基因的较短转录物。转录物的编号从起始ATG开始。参考文献1.Mullins,R.R,Aptsiauri,N.&HagemanG.S.Structureandcompositionofdrusenassociatedwithglomerulonephritis:implicationsfortheroleofcomplementactivationindrusenbiogenesis.(与肾小J求肾炎相关的玻璃祝的结构和组成玻璃疣生物发生中补体活化作用的暗示)￡>e15,390-395(2001).2.Klein,R丄等人.ComplementfactorHpolymorphisminage-relatedmaculardegeneration.(老年性黄斑变性中的补体因子H多态。)Sc/ewce308,385-389(2005).3.Edwards,A.O.等人.ComplementfactorHpolymorphismandage-relatedmaculardegeneration.(补体因子H多态和老年性黄斑变性。)Sc/e"ce308，421-424(2005).4.Haines,J.L等人.ComplementfactorHvariantincreasestheriskofage-relatedmaculardegeneration.(补体因子H变体增加老年性黄斑变性的风险。)&^"ce308,419-421(2005).5.Hageman,G.S.等人.AcommonhaplotypeinthecomplementregulatorygenefactorH(HF1/CFH)predisposesindividualstoage-relatedmaculardegeneration.(补体调节基因因子H(HF1/CFH)的普通单体型使个体易患老年性黄斑变性。)Mo^.&〖.f/&4102,7227-7232(2005).6.TheInternationalHapMapConsortium,Ahaplotypemapofthehumangenome.(人类基因组单体型图。)jVa加w437,1299-1320(2005).7.HeinenS等人.DenovogeneconversionintheRCAgenecluster(lq32)causesmutationsincomplementfactorHassociatedwithatypicalhemolyticuremicsyndrome.(RCA基因簇(lq32)的从头基因转变引起与非典型性溶血43尿毒症综合征相关的补体因子H的突变。)ifw附.A/wf.即将出版.8.Schouten,JP.等人.Relativequantificationof40nucleicacidsequencesbymultiplexligation-dependentprobeamplification.(由多重连才妄依赖性3果针扩增的40个核酸序列的相对量。)Wwc/ezc4c/AWes.30,e57(2002).9.Reid,K.B.等人.ComplementsystemproteinswhichinteractwithC3borC4b;asuperfamilyofstructurallyrelatedproteins.(与C3b或C4b相互作用的补体系统蛋白质；结构相关蛋白质的超家族。)//wm#w/.roAy7,230-234(1986).10.DiScipioRG.UltrastructuresandinteractionsofcomplementfactorsHandI.(补体因子H和I的超微结构和相互作用。),/mwimo/.;149,2592-2599(1992).11.Warwicker,P.等人.Geneticstudiesintoinheritedandsporadichemolyticuremicsyndrome.(遗传性和偶发性溶血尿毒症综合征的遗传研究。)ft勿M.53,836-844,(1998).12.Perez-Caballero,D.等人.ClusteringofmissensemutationsintheC-terminalregionoffactorHinatypicalhemolyticuremicsyndrome.(非典型溶血尿毒症综合征中因子H的C末端区的错义突变的成条。)J附.,68,478-484.(2001).13.www.FH-HUS.org14.Barrett,J.C.，Fry,B.,Mailer,J.&Daly,M.J.Haploview:analysisandvisualizationofLDandhaplotypemaps.(Haploview:LD和单体型图的分才斤和呈现。)说o/M/omw^".21，263-265(2005).44SNP编号SNP名称编码变体病例，对照比卡方P值1rs1292487312:38.263:7717.33.26x1(Ts2rs512卿348:2,338:20.00邻3rs7524776322:28,292:486.60.014rs529825313:37,263:7718.21.诉x10-55rs800292CWI62V313:37.263:7718.21邻x10"56rs1329424193:157,130:21019.88.59x10"8了rs106"47CfHA307A193:157,130:21019.88.59x10"88re106"70CfWY402H194:156,130:21020,56逾1O"09rs10801555194:156.130:21020.56.06x10"810rs2019727307:27,272:6618.41.75x10-s11rs2019724216:134,141:19928.31.04x10-712rs203685215:135,141:19927.513rs1831281297:37，269:69".00.000914rs2274700CWA473A284:66,205:13536.31.68x10-915rs6677604323:27,274:6620.216rs37533诉CfWQ672Q282:68,278:620.20.6917rs419137285:65,296:444.10.04318rs2284664311:39,271湖10.90.000919rs1065489C/=HD936E281:69,276:640.10.7720rs10801560311:39,274:669.140.002521rs460的7CFWL1191S323:27,270:6822.22.42x1(T822rs432007214:134,145:19123.11.57x10"*23rs438781217:133,148:19223.61.18x10"824rs408519215:135,147:19322.91.72x10"625re6428372285:65,281:590.20.6826rs10922147300:48,261:7910.20.001427rs1971579265:85,223:1178.50.003528rs408S749CfWL2C140G302:48,263:779.30加23表la使用关联172个AMD患者和173个对照中等位基因频率的卡方4全验产生P值。表lbCF及基因单体型域的关联单体型对照的％病例的％优势比卡方P值域l标记4-13221121112238.254.9-1.9819.21.2x10-s222212121216.319.3-1.231.10.29"221212"20.310.3+2.2113.20.0003222212221219.67.9+2.8619.88.6x10"622221211223.26.0稀少3.00.081"221212122.40.3稀少5.50.019域2标记14-18单体型l2212212.918.6-1.534.10.043单体型22211229.143.1-1.8514.70,0001单体型32221218.219.4-1.080.20.69单体型41211120.3".1+2.0310.90.0009单体型51111219.47.7+2.8820.26.8x10"6域3标记20-2421"243.261.5-2.1023.01.6x10"82122117219.5-1.170.60.43"22119.4".2+1.919.0O.O咖2222119.87.5+3.0622.42.2x10""负优势率表示有害单体型，正优势率表示保护性AMD单体型。4权利要求1.一种预防和/或治疗AMD的药物，所述药物包含全部或部分沉默基因CFHL1和/或基因CFHL3中的至少一种的至少一种抑制剂。2.如权利要求1所述的药物，其中所述至少一种抑制剂包含RNAi。3.如权利要求1所述的药物，其中所述至少一种抑制剂是与基因CFHL1和基因CFHL3中的至少一种的mRNA互补，以致各自基因产物减少的反义分子。4.如权利要求1或权利要求3所述的药物，其中所述至少一种抑制剂是在高严格杂交条件下与基因CFHL1和基因CFHL3中的至少一种的mRNA互补，以致各自基因产物减少的反义分子。5.如权利要求4所述的药物，其中所述至少一种抑制剂包含与加aGctgattcacctgttctcAaat(SEQIDNO5)具有至少90%序列同一性的核苷酸序列。6.如权利要求4或权利要求5所述的药物，其中所述至少一种抑制剂包含包含ttcaGctgattcacctgttctcAaat(SEQIDNO5)的核苷酸序列。7.全部或部分沉默基因CFHL1和/或基因CFHL3中的至少一种的至少一种抑制剂在医药中的用途。8.全部或部分沉默基因CFHL1和/或基因CFHL3中的至少一种的至少一种抑制剂在制备治疗AMD的药物中的用途。9.一种治疗AMD的方法，其包括向需要其的患者提供全部或部分沉默基因CFHL1和/或基因CFHL3中的至少一种的至少一种抑制剂的步骤。10.如权利要求9所述的方法，其进一步包括提供抗VEGF治疗和最小化受治疗者吸烟可能性的药物中的至少一种的步骤。11.如权利要求1至6任一项所述的药物，其进一步包含抗VEGF治疗和最小化受治疗者吸烟可能性的药物中的至少一种。12.如权利要求7和8任一项所述的全部或部分沉默基因CFHL1和基因CFHL3中的至少一种的至少一种抑制剂与抗VEGF治疗和最小化受治疗者吸烟可能性的药物中的至少一种组合的用途。13.—种探针，其包含分离的多核酸序列，所述多核酸序列含有一种或多种选自以下列表的多态<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>14.如权利要求13所述的探针，其中分离的多核苷酸包含<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>15.—种诊断和/或监测受治疗者老年性黄斑变性的诊断试剂盒，所述试剂盒包含具有与多核苷酸序列的结合特异性的检测试剂，所述多核普酸序列含有一种或多种选自以下列表的多态<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>或与多核苷酸序列编码的多肽具有结合特异性的检测试剂，所述多核苷酸序列含有一种或多种选自以下列表的多态<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>16.—种阵列，其包含能够与至少两种遗传标记杂交的至少两种多核苷酸序列，所述遗传标记选自含有一种或多种选自以下列表的多态的多核苷酸序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>13rsl83128114rs227470015rs667760416rs37533%17rs41913718rs228466419rsl06548920rsl080156021rs46089722rs43200723rs43878124rs40851925rs642837226rsl092214727rsl97157928rs408574929rsl092215230rs599817.—种多肽阵列，其中所述多肽阵列系列包括多核苷酸序列编码的多肽，所述多核苷酸序列含有一种或多种选自以下列表的多态SNP编号SNP名称1rsl2924872rs5129003rs75247764rs5298255rs8002926rsl3294247rsl0611478rsl0611709rsl080155510rs201972711rs201972412rs20368513rsl83128114rs227470015rs667760416rs375339617rs41913718rs228466419rsl06548920rsl080156021rs46089722rs43200723rs43878124rs40851925rs642837226rsl092214727rs簡57928rs408574929rsl092215230rs5998或与多核苷酸序列编码的多肽具有结合特异性的至少一种抗体，所述多核苷酸序列含有一种或多种选自以下列表的多态SNP编号SNP名称1rsl2924872rs5129003rs75247764rs5298255rs8002926rsl3294247rsl0611478rsl0611709rsl080155510rs201972711rs201972412rs20368513rsl83128114rs227470015rs667760416rs375339617rs41913718rs228466419rsl06548920rsl080156021rs46089722rs43200723rs43878124rs40851925rs642837226rsl092214727rsl97157928rs408574929rsl092215230rs599818.—种诊断受治疗者老年性黄斑变性或预测其易感性的方法，所述方法包括以下步骤提供来自所述受治疗者的生物样品；确定所述生物样品中至少一种遗传标记的存在或缺少，其中所述遗传标记选自多核普酸序列或由至少一种所述多核普酸序列编码的多肽，所述多核苷酸序列含有一种或多种选自以下列表的多态<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中遗传标记的存在和/或缺少指示受治疗者发展老年性黄斑变性(AMD)的风险。19.一种从第一时间点到较晚时间点监测老年性黄斑变性进展的方法，所述方法包括以下步骤提供第一时间点获得的第一生物样品，确定所述生物样品中至少一种遗传标记的存在或缺少，其中所述遗传标记选自多核苷酸序列或由至少一种所述多核普酸序列编码的多肽，所述多核苷酸序列含有一种或多种选自以下列表的多态-.SNP编号SNP名称1rs12924872rs5129003rs75247764rs5298255rs8002926rs13294247rsl0611478rsl0611709rsl080155510rs201972711rs201972412rs20368513rsl83128114rs227470015rs667760416rs375339617rs41913718rs228466419rs106548920rsl080156021rs46089722rs43200723rs43878124rs40851925rs642837226rsl092214727rs簡57928rs408574929rs1092215230rs5998提供在较晚时间点上获得的第二生物样品，确定所述第二生物样品中至少一种遗传标记的存在或缺少，其中所述遗传标记选自多核苷酸序列或由至少一种所述多核苷酸序列编码的多肽，所述多核苷酸序列含有一种或多种选自以下列表的多态SNP编号SNP名称1rs12924872rs5129003rs75247764rs5298255满02926rsl3294247rs薩1478rsl0611709rsl080155510rs201972711rs201972412rs20368513rsl83128114rs227470015rs667760416rs375339617rs41913718rs228466419rsl065柳20rsl080156021rs46089722rs43200723rs43878124rs40851925rs642837226rs1092214727rsl97157928rs408574929rs1092215230rs5998对比第一样品中与第二样品中所述遗传标记和/或多肽的缺少和/或存在；其中第二样品中与第一样品中的遗传标记和/或多肽的存在和/或缺少的差异指示受治疗者发展AMD风险的变化。10全文摘要关于诊断、预防和治疗老年性黄斑变性(AMD)的方法和试剂。特别地，所述方法和试剂与RNA有关；被确定为强有力预防受治疗者AMD的发展。文档编号C12Q1/68GK101501194SQ200780030171公开日2009年8月5日申请日期2007年6月13日优先权日2006年6月13日发明者安妮·伊丽莎白·休斯申请人:英国贝尔法斯特女王大学