专利名称：非核糖体肽合成酶及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生产经修饰的非核糖体肽合成酶(NRPS)的方法，及该酶在生产天然或经加工的肽和蛋白原中的用途。
非核糖体肽合成酶(NRPS或肽合成酶)是“模块化(modular)”酶，具有复杂的结构和重要的生物学功能。制药和生物技术上感兴趣的大量的肽，尤其是例如生物表面活性剂、铁载体、抗体、细胞抑制剂、免疫抑制剂及抗肿瘤剂，都是通过大的酶复合物“NRPS”进行生物合成的(Marahiel等(1997)，Chem.Rev.97第2651-2673页)。此外还包括已知的药物，如环孢菌素A和万古霉素。由于“NRPS”结构多种多样，使得由此产生的生物活性肽也是多种多样。除了20种蛋白质氨基酸外，NRPS还常形成特殊的残基，例如α-羟基氨基酸或非蛋白质氨基酸。各个残基由肽键或通过形成酯或内酯相互连接起来。通过N-甲基化或形成杂环或者差向异构化使这些残基进一步被修饰。许多由天然NRPS合成的多肽都通过肽键或酯键进一步环化。一般来说，NRPS在合成复杂的肽类生物化合物的过程中起重要作用。
人们已发现，多功能的蛋白模板基本上是以一种“模块”化的方式构成的。“模块(modular)”是指催化单元，它使得特定的氨基酸掺入至产物(肽)中(Marahiel等(1997)，Chem.Rev.97第.2651-2673页)。
各单独的模块由“域”组成，所述域在每一种情况下负责一个特定的反应。腺苷酰化(adenylation)域(A域)决定底物进入肽，因为A域可选择底物，并使其腺苷酰化，所述底物通常为氨基酸。被活化的氨基酸再通过硫酯键与一个辅因子相连接，该辅因子是硫醇化作用域(T域)中的4’-磷酸泛酰巯基乙胺。从而，氨酰基和肽基缩合成相邻的环化模块，该反应由缩合域(C域)催化。这三个域即C，A及T域。形成了多模块的(mutimodular)NRPS的基本单元。最后一个NRPS模块通常含有一个终止域(Te域)，该域负责释放合成产物。NRPS中模块的次序决定了肽的结构。
在被修饰的氨基酸掺入处，修饰域掺入到适当的模块中。
EP0789078 A2中仅指出可通过域的改变来改变已知化合物，其中仅从技术角度说明了关于控制肽链终止的原理。
具体说来，例如伴随ATP的水解，腺苷酰化域识别并活化关连底物氨基酸，成为酶联氨酰腺苷酸。然后这些相对不稳定的中间产物通过将共价连接于硫醇化域的4’-磷酸泛酰巯基乙胺辅因子(4-PAN)转移到硫醇基团上而得以稳定。在缩合(C)域的参与下，以此方式被活化的氨基酸的转肽作用依次进行，从而使链不断生长，直到肽产物形成为止。所掺入的单体的修饰(例如差向异构化，N-甲基化)或肽主链的修饰(如酰化或葡糖基化)能够进一步改变所形成产物的结构。这种功能化由NRPS主体中特定的域或多聚乙酰合成酶模块来催化。
已证明，A域通过其底物特异性和在某一特定NRPS系统中的相对次序来决定所形成非核糖体肽的一级结构(序列)。搞清腺苷酸形成酶超家族中两个成员的晶体结构，表明尽管就其一级结构来说仅有16％的同一性，但这两种酶具有明确的同源折叠拓扑结构。上述两种腺苷酸形成酶超家族成员为，来自Photinus pyralis的萤光素酶(Conti等，1996，结构(Structure)4287-298)和来自短小芽孢杆菌(Bacillus brevis)的短杆菌肽S合成酶1的A域(以下以PHeA表示)(Conti等，1997，EMBO J.164174-4183)。在底物ATP和苯丙氨酸存在时测定的PheA(图1A)的结构允许人们首次对底物识别和底物活化的分子机制进行研究。
NRPS A域的序列比较结果证明，其中存在高度保守的序列区域，即“核心基元”，它在A域内的位点及氨基酸序列几乎不变。先前的突变分析和现在PheA的晶体结构表明绝大多数的所述核心序列本质上都参与ATP结合及ATP水解。此外一些核心基元还有与底物氨基酸结合的功能。例如，PheA中的底物L-苯丙氨酸的α-氨基和α-羧基分别与235位的天冬氨酸(核心A4)和517位的赖氨酸(核心A10)形成静电配位(Marahiel等1997，Chem.Rev.97第2651-2673页)。实际介导底物特异性的PheA区域位于约100个氨基酸长的区域内，该区域在A域群体中保守性较低。这一区域形成底物苯丙氨酸侧链的结合口袋(图1B)，口袋的一侧由第236位的丙氨酸残基、第330位的异亮氨酸残基、和第331位的半胱氨酸残基组成，另一侧由第332位的丙氨酸残基、第301位的丙氨酸残基、第299位的异亮氨酸残基和第278位的苏氨酸残基组成。两侧被位于口袋底部的第239位色氨酸残基的吲哚环所分隔开。
通过先前对NRPS A域的计算机模拟研究(计算机模拟)可能说明A域的底物特异性决定区估计位于核心基元A3和A6之间。这一区域相对保守性较低，但就相同底物特异性的域而言，估计其同源关系应增高。据此，活化相同底物的域在进化树中应成组出现。但详细分析不能证明这种相互关系。相反，显然，A域的进化起源(宿主生物)较它们的底物特异性对它们的聚类具有更大的影响。
为得到共有序列，通过与PheA和萤光素酶进行序列比较，我们确定了从公共序列数据库中可获得的160个A域中推测的结合口袋的相应10个残基。对于每个A域仅使用上述10个氨基酸残基作为独立的氨基酸序列，以便用Laser Gene MegAlign程序(获自例如GATC，GmbH，Fritz-Arnold Str.23，D-78467 Konstanz，德国)进行对比和系统发生研究。通过以上研究，得到了一个系统发生家族树(图2)，其中按照其起源域的特异性出现了10个氨基酸长度序列的族。这一研究结果清楚地证明了所选择的氨基酸残基的确参与底物识别。根据这些研究结果，就可能对推测和所观察到的A域底物特异性之间的差异作出解释，并且推测NRPS系统的特异性。
本发明的目的在于，提供一种修饰A域的方法，以便提供并生产经适当修饰的用于生产新肽的非核糖体肽合成酶。本发明允许以特异的方式生产所期望的非核糖体肽。
出乎意料的是，基于系统发生的研究结果，能得到共有序列，该序列可理解为NRPS的非核糖体密码(表1)。与核糖体密码类似，该密码是简并的(冗余的)，例如，迄今可鉴定出四种不同的亮氨酸活化域的密码，三种缬氨酸活化域的密码，和两种半胱氨酸活化域的密码。由此可以设想，对于其他底物，也有大量的底物识别策略存在，这可由本发明所述方法确定。
因此，本发明还涉及列于表1中的编码非核糖体多肽的非核糖体密码。
基于由序列比较确定的“密码子”，可以推测底物结合口袋的一般形状，在图3中作为实例，对底物氨基酸天冬氨酸、鸟氨酸和缬氨酸推测的结合口袋进行了描述。虽然在所有A域中，第235位的天冬氨酸和517位的赖氨酸介导与底物氨基、羧基基团的关键相互作用，并因此高度保守，其余的残基则在很大程度上决定特定氨基酸侧链的特异性。所述3个实例中相应的残基(第236位到331位)支持了这一理论，并很好地反映出关于被活化底物极性和大小的要求。(1)天冬氨酸活化(‘天冬氨酸’密码子)碱性的第322位组氨酸残基(可能还包括第278位的赖氨酸)确定了与酸性侧链的极性相互作用，而236位的亮氨酸残基则为长侧链底物(如谷氨酸)的摄入锁住结合口袋。(2)鸟氨酸活化(‘鸟氨酸(2)’密码子)酸性的第278位的谷氨酸和第331位的天冬氨酸似乎在识别大的碱性侧链中起关键作用。(3)缬氨酸活化(‘缬氨酸(3)’密码)完整的结合口袋由疏水残基构成。考虑到由于β位分枝需要相对大的空间，则(1)上部用小的侧面基团，且(2)下部用较大的残基，这样将扩展结合口袋。
除了简并性，就出现可变(摆动样)位点而言，非核糖体密码与核糖体密码有进一步的同质性。如表1所示，摆动样残基位于278，299，331位，这些残基在特定的密码子中具有更大的可变性。一般的观察是，识别相对小的氨基酸的结合口袋在靠近结合口袋底部的部位有更高的可变性，而对于识别大的底物的结合口袋，其顶部具有更大的可变性(见表1)。
计算机模拟研究结果表明结合口袋的各个组分对特定底物的特异性的形成有不同的重要性，该结果汇总于图3和表1中。为确证这一观察结果，更加详细地研究了160个结合口袋的残基。图4和表2所显示的研究结果表明结合口袋的10个组分可以分成3组。它们不均等的可变性或许反映它们在介导底物特异性方面不同的重要性(1)‘不变’位点(第235位和517位)仅仅在活化不带有α-氨基的底物的A域中缺少第235的天冬氨酸。例如AcvA合成酶的α-氨基己二酸活化域或肠杆菌(大肠杆菌)和耶尔森氏杆菌(Yersiniabactin)体系(鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis))中的羧酸活化域。与此相反，第517位的赖氨酸是绝对不变的，它结合关连氨基酸的α-羧基和ATP/AMP核糖单元的04’和05’位，结果，预计两底物均进入最佳相互作用的位置。因此这两个残基介导与底物中(基本上)不变的α-氨基和α-羧基之间重要的相互作用，这也可以解释它们自身的不变性。(2)‘部分变化’位点(第236位、第301位和第330位)这些残基在所有已研究的域中仅表现出低的可变性，93％的情况下在这些位点形成疏水氨基酸。就这些位点的低可变性和带电及极性侧链不成比例的低出现率来说，可以排除这些位点对介导底物特异性存在实质上的重要性。(3)‘高变’位点(第239位、第278位、第299位、第322位和第331位)这些位点具有与所用氨基酸相关的最高的可变性。除了第229位和第331位，这两个位点具有高度的适应性和摆动样性质(参见表1)，所有位点都预先确定用来确立底物的特异性。就它们在结合口袋中的相对位置及表1+2及图3所示的数据而言，可以推测第322位对较小的底物残基具有更大的影响，而第239位和第278位则影响较大的残基。这一假说得到下面的例子的支持，例如，活化天冬氨酸(第322位组氨酸)、谷氨酸(第239位赖氨酸)和鸟氨酸(第278位谷氨酸)的A域的密码子(参见表1+2)。在所有提到的例子中，被识别底物的极性和结合口袋的高变位点恰好匹配(参见表2，于深灰背景中)。
经改变的DNA可以通过本领域普通技术人员所知道的方法，在染色体或染色体外插入至宿主生物中(Sambroo k，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，分子克隆实验室手册(Molecular CloningALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
因此，本发明涉及权利要求中列出的实施方案。
为进行实验确证，我们突变了PheA结合口袋中大量的介导特异性氨基酸组分，并对导致了下列改变的突变体进行了研究，该改变指(1)ATP-焦磷酸交换速率(酶活性)(2)非关连氨基酸的活化(酶特异性)。关于这后一点，不能不提及野生型蛋白自始即表现出对非关连底物色氨酸(18％)、亮氨酸(7％)显著的活化作用。PheA的诱变实验结果汇总于表3中，其可概述如下(1)用稍大的氨基酸来进行替换不可避免地要以付出结合口袋中可利用的空间为代价。由此造成突变体中ATP-焦磷酸转交换速率降低，而对关连底物苯丙氨酸的特异性提高(例如T278M，T278Q，A301V，A322S和C311L)。在所有的情况下，均可以降低非关连底物色氨酸和亮氨酸的位点特异性20倍。(2)用稍小的氨基酸进行替换所观察到的结果恰恰相反，结合口袋稍稍得以扩大。在这些突变体中保留野生型蛋白的催化活性，但区别非关连底物的能力下降可达5倍(例如A301G，A322G，和I330V)。(3)“高变”侧链的突变(位点为29，278，322和331)造成酶活损失高达5倍(例如W239L，T278M和C331L)。极性和带电荷侧链基团的引入改变了整个结合口袋的极性，结果造成相应的酶完全失去活性(例如A322D，A322K和A322N)。(4)依照特异性密码(参照表1)，所观察到的特定非关连底物活化的提高是可预见的。
例如，突变体PheA(I330V)中对苯丙氨酸的活性和特异性都没有受到影响，但这一结构也表现出对非关连底物色氨酸和酪氨酸活化作用的明显提高。有意思的是，所有的色氨酸和酪氨酸活化域都在330位处有缬氨酸。对于朝‘亮氨酸(4)’密码子(表1)方向突变的突变体也可以观察到类似的情况，该情况如下所述。
苯丙氨酸和亮氨酸(4)密码子(表1)具有约60％的同源性，其主要区别在于位点278，301和322(注三个位点中的两个为‘高变’组)。因此，估计并经实验证实，向亮氨酸(4)方向进行点突变(→T278M和A301G)表现出增强的亮氨酸活化作用(表3)。有趣的是，突变体PheA(T278M)对L-亮氨酸非特异活化的催化效率实际上不受到影响(相同的Vmax)，与此同时对关连底物(D-，L-苯丙氨酸)的催化活性降低了大约3倍。对突变体PheA(A301G)的观察结果与此恰恰相反。此处苯丙氨酸活化的Vmax不受影响，而同时L-亮氨酸的催化活化作用实际上提高了两倍。所有这些底物特异性和底物活性的变化都是显著的，可重复的且明显高于标准差。密码子中仅三点不同如何区分苯丙氨酸和亮氨酸至今仍不清楚，但至少对第301位，可以推测，这种辨别是由于相应氨基酸δ位的CH基团(Phe)相对CH3基团(Leu)在空间上的扩展不同造成的。所有活化在空间结构上需要γ或δ位的底物的域在第301位都具有最小的可能侧链基团(甘氨酸)(表2和3)。
为改变PheA使其底物特异性完全针对亮氨酸，我们构建了双突变体PheA(T278M/A301G)。该突变体密码子与“Leu(4)”密码子的相似性约为80％(参见表1)，且其在系统发生树中的位置与亮氨酸活化域紧密相邻(图2；中间灰色背景部分)。如图5A所示，这种结构的确更倾向于活化亮氨酸，事实上其各方面的催化效率均等同于野生型的酶，甚至超过后者的活性(突变体对L-Leu的催化活力为Kcat与Km之比为86mM-1min-1，而野生型催化L-Phe的活性为69 mM-1min-1，表4)。经检测，其对L-Leu特异活化效率增加了至少30倍。令人惊讶的是，双突变体对D-Phe的活化作用仅受到轻微的负影响，而对另一个立体异构体L-Phe进行活化时，其催化效率显著降低了约7倍(图5A和表4)。与此相反，可以发现，野生型蛋白PheA与两个配体L-Phe和D-Phe间的相互作用几乎是一样的。如图1B所示，D-Phe侧面基团的苄环相对于L-Phe的苄环旋转了约30度，结果，β碳原子而非α碳原子的相对位置有了轻微的改变。
根据本发明所述方法，我们改变了其立体结构尚不清楚的A域的特异性。这个实验的出发点在于下述发现即天冬氨酸和天冬酰胺活化域的已测密码子非常相似(约为80％，参见表1)。其主要区别在于第322位(组氨酸对谷氨酸，“高变”组)和330位(缬氨酸对异亮氨酸，“部分可变”组)。因此，我们选择了已作了深入研究的枯草菌脂肽生物合成复合物的天冬氨酸活化A域[Cosmina，P.等，1993，分子微生物学(Mol.Microbiol.)8821-831]，并试图将其改变为天冬酰胺特异性的。可以确定野生型的蛋白AspA对L-Asp，而非L-Asn具有中等活性的特异活化作用(对L-Asp的野生型活性Kcat与Km之比为10 mM-1min-1；参见图5B和表4)。与此相反，点突变产物AspA(H322E)形成了对L-Asn的高选择性(图5B)，虽然这种特异性改变与催化活性降低相关(10倍)(突变体对L-Asn的催化活性Kcat与Km之比为1 mM-1min-1；参见表4)。通过构建AspA(H322E)还可说明通过引入单个点突变可以完全改变酶对底物的特异性。此外，结果表明，突变体AspA(H322E)对大小相似的脂肪族天冬酰胺类似物例如异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的活化效率提高了约5倍。
通过引入Ile330Val点突变，还可能进一步将对L-Asn特异活化作用的效率提高约70倍。同时也获得了目前天冬酰胺活化域的催化活性，所述天冬酰胺活化域的大小(腔隙)与原先的AspA域相同。
对谷氨酸和谷氨酰胺活化域密码子的分析表明，在这些域中形成了非常相似的密码子(表1)。主要的区别在于第239位(赖氨酸对谷氨酰胺；“高变”组)。于是我们选择了枯草菌脂肽生物合成复合物的谷氨酸活化域(SrfA-A1)，试图将其改变为谷氨酰胺特异性的。对于野生型蛋白GluA，可以确证其对L-Glu而非L-Gln具有中等活性的特异活化作用(其Kcat与Km之比为25/mM-1min-1)。与此对照，点突变体GluA(K239Q)对L-Gln产生了高选择性，同时催化活性稍稍降低(Kcat与Km之比为20/mM-1min-1)。由于突变体和谷氨酰胺域的密码子的原因，该结果是可预计的，这表明，采用结构GluA(K239Q)也可能通过引入单个点突变完全改变底物特异性。
如下述所示，A域改变的底物特异性也能应用在体内合成一级结构改变了的肽。为此，例如，通过以同源重组的方式将对谷氨酰胺特异的双突变体AspA(I330V/H322E)的基因片段转移到产生枯草菌脂肽的枯草芽孢杆菌ATCC21332的染色体上。这一整合采用两步重组的方法[Schneider，A，等，1998，Mol.Gen.Genet.257第308-318页]进行，并且导致在枯草菌脂肽生物合成操纵子srfA-B基因中用aspA(H322A/I330V)’替换aspA’。通过从染色体PCR扩增突变的asp(H322A/I330V)’基因片段和接下来对该扩增片断的DNA序列分析，验证这一克隆枯草芽孢杆菌Asn-5的同一性。
生物表面活性剂枯草菌脂肽是一种脂七肽，其带有一可变的β-羟基脂肪酸部分(6-9个亚甲基团)，该脂七肽在细胞向稳定生长阶段转变时，产生并分泌到培养基中。据此，通过发酵枯草芽孢杆菌ATCC21332和Asn-5，从培养基的上清液中制备野生型枯草菌脂肽和[Asn-5]枯草菌脂肽，可以检测经修饰的脂七肽。接下来的高压液相层析-质谱(HPLC-MS)分析显示，和野生型相比较，[Asn-5]枯草菌脂肽(1)产量相同，(2)延迟期较长，(3)在ESIMS分析中质量相差1Da。该质量不同是显著的，且在负离子模式下可以对野生型m/z992到1034和突变体m/z991到1033确定增量为14(可变脂肪酸部分)的离子系。这一发现与[Asn-5]枯草菌脂肽降低的溶血活性可以视为是在枯草菌脂肽中用脲基(Asn-5；突变体)替代羧基基团(Asp-5；野生型)的明确指示。总之，这些结果说明，可以通过特异地改变NRPS基体中A域的底物特异性来改变体内相应的肽产物。
本发明涉及一种肽的特异合成方法，其基本上可按如下进行按照本发明所述方法，可以从天然存在的具有功能活性的NRPS系统开始，通过在A域内点突变特异地改变所形成非核糖体肽产物的每一个氨基酸位点。为此，要首先从生产生物的染色体扩增出待改变的A域的DNA，然后将其克隆到大肠杆菌(E.coli)His标记表达载体上。借助此结构可以得到足够多的具有功能活性的A域蛋白，将所述蛋白纯化，并在体外研究其底物特异性。接下来，就可以依照表1向重组的A域DNA中特异地引入点突变，该突变导致底物特异性改变。所述改变通过下述方式来证明首先在大肠杆菌中过表达、纯化突变的A域，并针对它们的底物特异性对突变的A域进行研究。若由此证实了所期望的特异性改变，则可用同源重组的方法将突变的A域DNA替代生产生物的染色体上的天然A域DNA。由此形成的带有突变的A域的生产菌株即可用于生产改变了的非核糖体肽。
本发明的方法还可以用于影响已知生物学活性肽的特异性和/或活性。为此，按照已知的密码，改变特定的A域，使由改变了的NRPS所合成的肽具有所期望的性质。例如，在这里必须指出，可利用亲水性氨基酸替代疏水性氨基酸产生溶解度的改善，反之亦然。
本发明的结果还可以具体预测那些已被测序但其功能尚不明确的NRPS基因的底物特异性。由于各种基因组测序工程的进行，使得基因序列数量稳步增长，鉴于此，本发明的上述作用就显得越来越重要。举例来说，应用此处所述方法，就可根据一个NRPS族的DNA序列，预测所形成的产物肽的可能结构。这样，对这些基因的结构—功能分析变得容易得多。
为获得一种具有已知DNA序列的NRPS A域的底物特异性，首先要将其与PheA的DNA序列进行序列比较。由此可确定待研究的A域中推定的结合口袋中10个相应氨基酸残基。接下来，这10个氨基酸残基用作独立的氨基酸序列与所有已知的其它A域的结合口袋中的10个氨基酸残基一起进行对比和系统发生研究。由此形成关于A域成员的底物特异性的严格序列分类。从而可通过分组特性(grouping behavior)确定所研究的A域的底物特异性。
应用本发明的发现还可从特别是A、C和T域(如果适合，还包括其它域，见Mahariel等(同上)所述)的已知DNA序列合成不是来自天然合成酶的NRPS。
实施例实施例1PheA和AspA突变体的PCR扩增和克隆所有PheA突变体都是通过反向PCR的方法，在质粒pPheA上通过定向诱变形成的。完整质粒的PCR扩增是遵循生产商建议的方法，应用“扩展长范围PCR系统”进行的(Boehringer Mannheim；Mannheim，德国，目录号1681842)。应用了下列5’磷酸化的寡核苷酸(MWG-Biotech，Ebersberg，德国)(每个寡核苷酸序列中突变的密码子已添加了下划线)(Seq ID-NO1)3′A2365′-ATCAAA AGA GAT GCT GGC A-3′；(Seq ID-NO2)5′-A236L5′-TTA TCT GTA TGG GAG ATG TTT ATG-3′；(Seq ID-NO.3)3′-W-2395′-TAC AGA TGC ATC AAA AGA G-3′；(Seq ID-NO4)5′-W239G5′-GGA GAG ATG TTT ATG GCT TTG TTA AC-3′；(Seq ID-NO.5)5′-W239L5′-TTA GAG ATG TTT ATG GCTTTG TTA-3′；(Seq ID-NO6)3′-T2785′-AAT AAC AGT GATTTC CTT TTG G-3′；(Seq ID-NO7)5′-T278M5′-ATG CTGCCA CCT ACC TAT GTA GTT-3′；(Seq ID-NO8)5′-T278Q5′-CAG CTG CCA CCT ACC TAT GTA GTT-3′；(SeqID-NO9)3′-12995′-TAA CGT TTG TAT CGA TAA AAT AC-3′；(Seq ID-NO10)5′-1299T5′-ACT ACA GCA GGC TCA GCT AC-3′；(Seq ID-NO11)3′-A301G5′-TCC TGT AAT TAA CGT TTGTAT CG-3′；(Seq ID-NO12)3′-A301V5′-AAC TGT AAT TAACGT TTG TAT CG-3′；(Seq ID-NO13)5′-A3015′-GGC TCAGCT ACC TCG CCT-3′；(Seq ID-NO14)3′-A3225′-AAT GTAAGT TAC TTT CTC CTT C-3′；(Seq ID-NO15)5′-A322D5′-AAT GAT TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3′；(Seq ID NO16)5′-A322E5′-AAT GAA TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3′；(Seq ID-NO17)5′-A322G5′-AAT GGC TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3′；(Seq ID-NO18)5′A322I5′-AAT ATT TAT GGC CCT ACGGAA ACA-3′；(Seq ID-NO19)5′-A322K5′-AAT AAG TATGGC CCT ACG GAA ACA-3′；(Seq ID-NO20)5′-A322N5′-AAT TTG TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3′；(Seq ID-NO21)5′-A322Q5′-AAT CAG TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3′；(Seq ID-NO22)5′-A322S5′-AAT AGC TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3′；(SeqID-NO23)3′-I3305′-AGT TGT TTC CGT AGG GC-3′；和(Seq ID-NO24)5′-I330V5′-GTT TGT GCG ACTACA TGG G-3′.
采用“QIAquick-spin PCR纯化”系统对PCR产物进行纯化(Qiagen；Hilden，德国，目录号28104)，其粘末端平端化后，进行分子内连接。添加需要甲基化的识别序列的限制性内切酶Dpnl(Amersham/Buchler；Braunschweig，德国；订货号E0302Z)来特异地降解PCR基质(pPheA；自dam+大肠杆菌菌株中纯化的)，从而排除了假阳性克隆。对所有DNA操作和从大肠杆菌XL-1-blue(Stratagene，Heidelberg，德国，Order No.；200268)制备重组质粒，均采用标准的方法[Sambrook等，1989，分子克隆实验室手册，Cold SpringHarbor Laboratory Press，NY]。通过对PCR扩增产物的克隆获得了下列质粒pPheA(A236L)(用寡核苷酸序列Seq ID-NO1和Seq ID-NO2)，pPheA(W239G)(Seq ID-NO3加Seq ID-NO4)，pPheA(W239L)(Seq ID-NO3加Seq ID-NO5)，pPheA(T278M)(Seq ID-NO6加Seq ID-NO7)，pPheA(T278Q)(Seq ID-NO6加Seq ID-NO8)，pPheA(I299T) (Seq ID-NO 9 加 Seq ID-NO10)，pPheA(A301G) (Seq ID-NO11 加 Seq ID-NO13)，pPheA(A301V) (Seq ID-NO12 加 Seq ID-NO13)，pPheA(A322D) (Seq ID-NO14 加 Seq ID-NO15)，pPheA(A322E) (Seq ID-NO14 加 Seq ID-NO16)，pPheA(A322G) (Seq ID-NO14 加 Seq ID-NO17)，pPheA(A322I) (Seq ID-NO14 加 Seq ID-NO18)，pPheA(A322K) (Seq ID-NO14 加 Seq ID-NO19)，pPheA(A322N) (Seq ID-NO14 加 Seq ID-NO20)，pPheA(A322Q) (Seq ID-NO14 加 Seq ID-NO21)，pPheA(A322S) (Seq ID-NO14 加 Seq ID-NO22)和pPheA(I330V) (Seq ID-NO23 加 Seq ID-NO24)。所有结构的序列均经“ABI prism310 Genetic Analyzer”DNA序列分析仪的序列测定进行了检测和确证(ABIWeiterstadt，德国，OrderNo.310-A)。
编码SrfA-B天冬氨酸活化A域的DNA片段是用下列寡核苷酸对枯草芽孢杆菌JH642的染色体DNA进行PCR扩增得到的(Seq ID-NO25)5’AspA5’-AAT CCA TGG CGA ACG TTC GGC TGT CTG-3’和(Seq ID-NO26)3’-AspA5’AAT GGA TCC GGC CAA GGC CTT GCC-3’。纯化PCR扩增产物(见上)，再用限制性内切酶Ncol和BamHI(mersham/Buchler；Braunchschweig，德国，Order No.E1160Z和E1010Y)消化后，克隆到以同样方式制备的‘His-标记’载体pQE60上(Qiagen；Hilden，德国，Order No.33603)。这一克隆过程构建了质粒pAspA，该质粒能用做利用反向PCR(见上)生成pAspA(H322E)的模板(Seq ID-NO27)5’-AspA(H322E)5’-TAA TGA GTA CGG CCC GAC AGA AGC-3’和(Seq ID-NO28)3’-AspA(H322E)5’-ATA AAT TCG GTA TGT CCA TAC-3’。所构建的质粒pAspA(H322E)接下来作为模板用于采用下列引物(Seq ID-NO29)5’-AspA(I330V)5’-TAC CGG CCC ACA GAA GCA ACG GTC GGC-3’和(Seq ID-NO30)3’-AspA(I330V)5’-CTG TGG GCC CGT ACT CATTAA TAA ATT CGG-3’通过反向PCR的方法生成pAspA(H322E/I330V)。以上所有结构的同一性均经DNA测序反应检测并确证。编码SrfA-A的谷氨酸活化A域的DNA片段是由下列寡核苷酸以枯草芽孢杆菌JH642的染色体DNA为模板进行扩增得到的(Seq ID-NO31)5’GluA5’-TATGGATCC ATT GAT GAA TTA ACA CTG-3’和(Seq ID-NO32)3’-GluA5’-TATGGA TCC GAT TGC TTT TTC AGT-3’。纯化PCR扩增产物(见上)再用限制性内切酶BamHI(Amersham/Buchler；Braunchschweig，Germany，OrderNo.E1010Y)消化后，克隆到经限制性内切酶BgIII(Amersham/Buchler；Braunchschweig，Germany，Order No.E1021Y)消化的‘His-标记’载体pQE60上(Qiagen；Hilden，Germany，Order No.33603)。这一克隆过程构建了质粒pGluA，该质粒能用做利用反向PCR(见上)生成pGluA(K239Q)的模板(Seq ID-NO33)5’-GluA(K239Q)5’-GTG CAG CAAATC TTC GCG TCG CTT C-3’和(Seq ID-NO34)3’-GluA(K239Q)5’-TGA CGC ATC AAA GTG GAA C-3’。以上所有结构的同一性均经DNA测序反应检测并确证。实施例2腺苷酰化域(野生型和突变体)的表达和纯化(突变的)基因片段的表达和其产物His6融合蛋白的纯化依照本发明以外的文献[Mootz等，1997，细菌学杂志(J.Bacteriol.)1786834-6850]描述的方法进行。每种情况下，与质粒pQE60的经BamHI切割的一侧相连接使氨基酸序列“GSRSHHHHHH”与特定的重组蛋白的羧基端相融合。SDS-PAGE电泳结果表明，用Ni2+亲和层析的方法，大多数的蛋白都可被纯化到接近均一。但有两个结构是不溶性的(参见表3)。合并包含特定重组蛋白的组分并在分析缓冲液(HEPES，50mM pH8.0；氯化钠，100mM；氯化镁，10mM；二硫赤藓糖醇(DTE)，2mM；EDTA，1mM)中透析。加入10％的甘油(体积比)，可在-80℃保存该蛋白，而检测不到任何催化活性的损失。蛋白质在各溶液中的浓度通过其在280纳米下计算的消光系数(A280nm)来确定PheA和除PheA(W239Xaa)外所有的PheA突变体均为64060 M-1cm-1，PheA(W239Xaa)为58370 M-1cm-1，AspA和AspA(H322E)为39780 M-1cm-1，GluA和GluA(K239Q)为35490 M-1cm-1。实施例3ATP焦磷酸交换反应ATP焦磷酸交换反应的进行是为了测定纯化的重组A域的催化活性和特异性的[Mootz和Marahiel，1997，细菌学杂志1786843-6850]。在此方面，每种情况的特异性都采用20种蛋白质氨基酸和L-鸟氨酸及D-苯丙氨酸予以检测。反应混合物包含(终体积为100μL)HEPES，50 mM pH8.0；氯化钠，100mM；氯化镁，10mM；二硫赤藓糖醇(DTE)，2mM；EDTA，1mM；氨基酸，0到2mM；酶，250nM。各种反应均通过添加下列物质来起始，所述物质为2mM ATP，0.2mM焦磷酸钠和0.15μCi(16.06Ci/mmol)的[32P]焦磷酸钠(NEN/DuPont；Germany；Order No.NEX019)，在37摄氏度下温育10分钟。然后加入0.5毫升的终止液终止交换反应，所述终止液由1.2％(w/v)活性炭，0.1M的焦磷酸钠和0.35M的高氯酸组成。离心收集活性炭，用1mL双蒸水洗一次，再悬浮于0.5mL的水中。加入3.5mL闪烁液(Rotiscint Eco Plus；Roth；Art.No.0016.2)后，可在闪烁分析仪中确定与碳结合的放射性(1900CA Tri-Carb“液体闪烁分析仪”；Packard)。实施例4通过计算机分析确定假定的底物结合口袋从公共数据库(如http∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/nucleotide.html)中获得160个A域蛋白序列，将其减少到核心基元A4和A5(Marahiel等，1997，Chem.Rev.972651-2673)之间约100个氨基酸的区域。然后利用DNAStar程序包中的MegAlign子程序，采用“clustal”方法和默认设置，对这些序列进行同源性对比。这第一步对比的主要目的是使接下来对假设的底物结合口袋的组件进行分类容易一些。为此，可以以它们相对于高度保守的序列基元(核心基元A4和A5及基元‘TPS’和‘GE’；结构‘锚’)的位置为依据来进行分类。然后将所有的序列均削减到结合口袋的确定组分，再对这些仅包含10个氨基酸的序列进行新的对比及系统发生学研究。每一种方法和每一套参数使得这些编码序列能根据其原始域的底物特异性进行归组。应用下列参数空缺罚分为12，空缺长度罚分为6，Ktuple为2，以Jotun Hein的方法确定如图2所示的系统发生树。实施例5将编码AspA(H322E/I330V)的基因片段整合到枯草芽孢杆菌AS20的染色体上将编码AspA双突变体(Asp(H322E/I330V)的基因片段引入到枯草芽孢杆菌的srfA生物合成操纵子中(Cosmina，P.等，1993，分子微生物学(Mol.Microbiol.)，8821-831)，以便验证经特异修饰的肽抗生素所有体内合成方法的有效性。为构建其要求的整合质粒，首先需要用PCR的方法从枯草芽孢杆菌ATCC21332的染色体DNA上扩增出合适的srfA-B基因片段，该片段编码天冬氨酸活化模块(碱基对14195-18200)(Cosmina，P.等，1993，分子微生物学(Mol.Microbiol.)，8821-831)，其中所用到的引物序列如下(加下划线的限制性酶切位点)(seq NO35)5’-homo Asp(ClaI)5’-TAA ATC GAT GGA GGC TGC CAA GG-3’和(seq NO36)3’-homo Asp(SpeI)5’-TAA ACT AGT CAG TAA ATC CGCCCA GT-3’。获得的扩增产物经纯化及限制性内切酶ClaI和SpeI(Amersham/Buchler；Braunchschweig，Germany，Order No.E11034Y和E1086Z)消化后克隆到经同样方式制备的载体pBluescrept SK(-)(Stratagene，Heidelberg，德国，Order No.212206)上。该克隆过程获得质粒pSK-homoAsp，用限制性内切酶EcoRI和PstI(Amersham/Buchler；Braunchschweig，德国，Order No.E1040Y和E1073Y)切下该质粒上约1.3kb的aspA’片段(碱基对15212-16559)(Cosmina，P.等，1993，分子微生物学，8821-831)，上述片段用质粒pAspA(H322E/I330V)上经两次突变的互补片段替换。所得重组质粒pSK-homoAsp(H322E/I330V)的同一性，经DNA序列测定验证。
突变的aspA’片段通过经证明的共转化技术整合到枯草菌肽生物合成操纵子上(“集合法”(congression))[Schneider，A.等，1998Mol.Gen.Genet.257308-318]，所用宿主为枯草芽孢杆菌AS20[Schneider，A.等，1998 Mol.Gen.Genet.257308-318]，该菌株所带有的aspA’基因(碱基对15245-17177；Cosmina，P.等1993，分子微生物学8821-831)已被缺失，并由氯霉素转移酶基因所替代。使枯草芽孢杆菌AS20能摄入DNA，再用整合载体pSK-homoAsp(H322E/I330V)和辅助质粒pNEXT33A[Schneider，A.等，1998 Mol.Gen.Genet.257308-318]共转化。上述辅助质粒通过其新霉素抗性基因首先介导了一次正筛选，接下来可对所得克隆进行研究，以检查其是否失去了氯霉素DNA片段，并由此整合了aspA(H322E/I330V)’基因片段。对筛选出的克隆的染色体上这一区域进行PCR扩增以及DNA测序，可确证构建的克隆枯草芽孢杆菌Asn-5的同一性。实施例6枯草菌脂肽的制备和分析依照标准的方法[Schneider，A.等，1998 Mol.Gen.Genet.257308-318]制备枯草芽孢杆菌Asn-5产生的枯草菌脂肽。为进行分析，所得甲醇溶液经“HP1100 Series LC/MSD”高压液相层析系统用一种PepRPC HR5/5柱(Pharmacia，Freiburg，Germany，Order No.18-0383-01)分离。各组分采用线性梯度的存在于0.1％三氟乙酸(v/v)中的35％-70％乙腈(v/v)以0.7mL min-1的流速进行分离。通过质谱在线分析于214nm波长下检测洗脱物。作为对照，从枯草菌脂肽产生菌枯草芽孢杆菌ATCC21332中提取野生型枯草菌肽进行类似的分析。
图1苯丙氨酸识别和活化的结构基础(Conti等[Conti等，1997，EMBOJ.164174-4183])。(A)带状图表明PheA包括两个折叠域，一个大的N端域(底部)和一个较小的C端域。AMP和底物苯丙氨酸用黑色表示。(B)苯丙氨酸的结合口袋由10个氨基酸形成。第235位的天冬氨酸和第517位的赖氨酸介导与底物α-氨基和α-羧基的静电相互作用(虚线)。可对苯丙氨酸侧链基团进行特异识别的真正的结合口袋是由一侧的第236位的丙氨酸、330位的异亮氨酸、331位的半胱氨酸和另一侧的第322位的丙氨酸、第301位的丙氨酸、第299位的异亮氨酸和第278位的苏氨酸形成。两侧由位于底部的第239位色氨酸的吲哚环分割开。这种构造使得PheA结合口袋可以结合两种立体异构体的苯丙氨酸L-Phe(浅灰)和D-Phe(深灰)而没有发生任何可检测到的构象变化。图2用A域的10个介导特异性的氨基酸所构建的系统发生树。系统发生研究结果显示，根据其原始域(浅灰色框)的特异性，已确定的密码子可以归组。这证明了A域之间结构同质性概念的正确性，而且表明每种情况下所确定的这10个氨基酸的确形成关连底物氨基酸的识别密码子。所给出的例子表明通过这一技术的方法可预测最新检测到的域的特异性，而且分组是由实验观察到的特异性(深灰色框)所控制的。对于构建的突变体PheA(T278M/A301G)和AspA(H322E)这同样正确，所述突变体在ATP焦磷酸交换反应中表现出亮氨酸和天冬酰胺特异性(中灰背景)。图3图示三个腺苷酰化域的推测的结合口袋。三种不同底物(天冬氨酸，鸟氨酸(2)，缬氨酸(3)；参见表1)已测定的密码子投射于图1B中所示Phe结合口袋的位置。脂肪族的(浅灰)、极性的(阴影)、酸性的(白色)和碱性的(深灰)侧链基团如图中所示。在所有三种情况下，第235位的天冬氨酸和第517位的赖氨酸介导与特定底物α-氨基和α-羧基之间的相互作用，而所有其它的氨基酸残基，Xaa236到Xaa331介导真正的底物侧链识别作用。在所有的例子中，都可以观察到结合口袋的极性与底物之间完美的相关性。图4所观察到的各种底物结合口袋组分的可变性研究了160个假定的底物结合口袋各位置的氨基酸组分的可变性。在中灰框中描述了所研究的各A域中底物性质的分布比例。与结合口袋每一位置相连接的浅灰色框代表所观察到的各种残基的数量(频率＝1％)，以及在这些位置疏水的、极性的、酸性的、碱性的侧链基团出现的比例。根据所示结果，10个氨基酸组分可以分为3个亚组(1)第235位(天冬氨酸酸性，白色)和第517位(赖氨酸碱性，深灰)是不变的。(2)第236位、301位、和330位仅部分可变。它们表明带电荷的和极性的侧链基团的出现率低于平均水平，所研究的A域中的绝大多数(93％)在这些位置使用了脂肪族的残基(灰色)。第239，278，299，322和331位可被视为“高变”位点，就使用不同的氨基酸而言所述位点表现出高度的可变性。图5PheA和AspA底物特异性的特异改变。借助ATP焦磷酸交换反应研究了野生型(白色)和突变体(各种形状的灰色)的底物特异性。X轴表示所用底物，所观察到的每种蛋白最大活性定为100％。(A)在PheA中向‘亮氨酸(4)’密码子方向的点突变(T278M和A301G)稍稍提高了对亮氨酸的特异性，而苯丙氨酸依然是最适底物。另一方面，相应的双突变(PheA(T278M/A301G)；深灰)能很好的活化亮氨酸，其催化活性在各个方面均与野生型酶PheA对苯丙氨酸的催化效率相等。(B)AspA中的H322E点突变足以将突变体的底物特异性由对天冬氨酸完全转变为对天冬酰胺。所观察到的突变体的活化模式与图2所示系统发生树中它们密码子的位置相一致(中灰背景)。图6-9为表1-4。
权利要求
1.具有期望结构的肽的特异性非核糖体合成方法，该方法包括根据列于表1的非核糖体密码，在编码非核糖体肽合成酶的给定DNA序列内改变一个或多个A域编码区，以致经改变的DNA序列的表达产物表达具有期望结构的肽。
2.根据权利要求1的方法，其中在至少一个待改变的A域中，替换了仅10个氨基酸，优选仅6个氨基酸，特别优选仅3个氨基酸，尤其特别优选1个氨基酸。
3.根据权利要求1的方法，其中为了产生更长或更短的肽，在给定的DNA序列中特异地添加或除去A域编码区。
4.根据权利要求1至3之至少一项的方法，其中所合成的肽具有抗生素、免疫抑制、抑制细胞生长、抗病毒、抗蠕虫、杀真菌或表面活性作用。
5.根据权利要求1至3之至少一项的方法，其中至少一种经改变的非核糖体肽合成酶包含在宿主生物内。
6.根据权利要求5的方法，其中所述宿主生物选自细菌、真菌和酵母，且优选杆菌、放线菌、粘细菌、假单孢菌和大肠杆菌，特别优选枯草芽孢杆菌。
7.根据权利要求5的方法，其中所述宿主生物为植物。
8.根据权利要求5的方法，其中所述宿主生物为哺乳动物。
9.根据权利要求8的方法，其中所述宿主生物为人。
10.根据权利要求1至4之至少一项的方法，其中经改变的非核糖体肽合成酶以分离的形式(在体外)使用。
11.根据权利要求10的方法，其中经改变的非核糖体肽合成酶是固定化的。
12.根据权利要求11的方法，其中经改变的非核糖体肽合成酶与支持物结合。
13.编码非核糖体肽合成酶的DNA序列，其中根据表1的非核糖体密码，改变了一个或多个A域，以致所改变的DNA序列的表达产物表达预定结构的肽，该肽优选不与天然肽一致。
14.根据权利要求13的DNA序列，其中在至少一个待改变的A域中替换仅10个氨基酸，优选仅6个氨基酸，特别优选仅3个氨基酸，尤其特别优选1个氨基酸。
15.根据权利要求13或14的DNA序列在采用根据权利要求1-11的任意一种方法合成肽中的用途。
16.可基于根据表1的非核糖体密码获得的肽，其中表1是该权利要求的一部分。
全文摘要
本发明涉及一种制造经修饰的非核糖体肽合成酶(NRPS)的方法,本发明还涉及该合成酶在制备天然的或人工的肽或蛋白原中的用途。特别地,通过新的非核糖体密码可制备目的肽。
文档编号C12N15/52GK1342201SQ00804496
公开日2002年3月27日 申请日期2000年2月28日 优先权日1999年3月3日
发明者穆罕默德·A·马拉黑尔, 托尔斯滕·施塔赫尔豪斯, 亨宁·穆茨, 德克·康兹 申请人:穆罕默德·A·马拉黑尔, 托尔斯滕·施塔赫尔豪斯, 亨宁·穆茨, 德克·康兹