专利名称：Cfhr1基因型、高密度脂蛋白上cfhr1及氧化磷酸胆碱的测定试剂盒及测定方法
技术领域：
本发明涉及补体因子H相关蛋白I (CFHRl)的基因型鉴定，CFHRl在血浆中的测定方法，含CFHRl高密度脂蛋白样颗粒的分离纯化，CFHRl对氧化特异性抗原的结合，以及高密度脂蛋白(HDL)上氧化磷脂的检测，并且通过以上检测所得到的数据，对年龄相关性黄斑变性进行预警性诊断和治疗指导。具体涉及有关的定量检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
年龄相关性黄斑变性(AMD)的发病机理涉个体的遗传变异及环境危险因素(如氧化应激)的相互作用。AMD患者视力的严重损失大多是由于脉络膜新生血管(CNV)出血及渗出，或湿性AMD引起。AMD是老年人不可逆失明的主要原因并影响世界上数以百万的人。
全基因组关联研究(GWAS)可有效推进基于分子水平的复杂性状疾病1的研究。但是，对遗传变异的性状与发病机制之间的理解仍需实质性的突破。现已发现AMD的发生与 I号染色体上的补体因子H (CFH)区域密切相关。CFH区域包含两个主要疾病风险单体，一个由rsl061170 (Y402H)标记，另一个由rs227470(T9标记。这两个风险单体型一起出现在60%以上的AMD患者中。
最近的研究发现，CFH相关蛋白(CFHRs)的拷贝数变异也与AMD相关。特别是，由 rs6677604标记的CFHRl在高密度脂蛋白上的缺失与避免AMD1tu2病变有关。CFHRl基因位于I号染色体长臂31-32区域，其蛋白编码与CFH的C端具有高度同源性。CFHRs与补体系统中的其它具体效应因子相互结合起调节功能。
研究表明，许多老化疾病与氧化应激相关，包括动脉粥样硬化、阿尔茨海默氏病和 AMD1m90除了全身整体性的氧化应激，视网膜感光细胞同时还因为与局部氧化产物的接触所受到氧化应激。视网膜的感光细胞含有大量不饱和脂肪酸磷脂，如磷脂酰胆碱(PtC)等。 这些磷脂是极容易受到氧化应激导致化学结构发生变化，产生各种氧化磷脂(oxPLs)。例如 l-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PAPC, I-掠榈酉先 ~2~ 花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)是最常见视网膜磷脂之一。在氧化作用下，其中的双键结构被打断，从而使磷酸胆碱(PC)基团产生构象变化，变为l-palmitoyl_2-(5’ -oxo-valeroyl )-snglycero-3-phosphocholine(POVPC, I-棕榈酰 _2_ 氧化戍酰 _sn_ 甘油-3-磷酸胆碱) (图I)。POVPC可以由鼠天然抗体TEPC15 (通常也叫T15)明确识别。相比之下，TEPC-15却不与正常细胞膜或天然脂蛋白上的非氧化卵磷脂结合20。通常，oxPLs存在于氧化修饰的低密度脂蛋白(oxLDL)载体或凋亡细胞上。很多研究已经表明oxPL能够刺激强烈的炎症反应，并且可以作为一个可靠的氧化应激生物标记物21’22。
有研究人员发现，一部分的CFHRl存在于血浆中一种特殊的高密度脂蛋白样颗粒上。该颗粒包含载脂蛋白A (ΑροΑΙ)、脂多糖结合蛋白(LBP)和磷脂23。由于此高密度脂蛋白样颗粒仅占小于HDL总量的1%，因此推测它不是脂质转运的结构组件。相反，它可能具有调节功能，可能是参与和细菌内毒素的结合来调节炎症反应。然而，CFHRl在此高密度脂蛋白样颗粒中的确切作用尚没有被充分探讨，尤其是在AMD的研究中。
研究者已经在AMD患者的视网膜玻璃膜疣和Bruch膜中检测到了被氧化修饰的蛋白质和脂24。作为天然防御机制的一部分，CFHRs可能参与这种氧化应激的调节。有报道称CFHRl缺失(CFHRl Δ )对于AMD风险有保护作用1CU1。但是，其对于AMD风险的影响机制在很大程度上还是未知的。发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供用于从DNA模板中扩增CFHRl基因片段的引物对。
本发明的技术方案是用于从DNA模板中扩增CFHRl基因片段的引物对，包括标记为rs6677604的CFHRl上SNP基因座CFHRl扩增引物对
上游引物5’ -GATGGAAGACACCAGAGCAGAT-3 ’( SEQ ID No 1)
下游引物:5，-GAATCCATCAGCTTCTACCATT-3’(SEQ ID No 2)；
在此基础上，本发明还提供了用于对标记为rs6677604的CFHRl上SNP基因座进行基因型鉴定的引物，其核苷酸序列
5’-TGAACACATGACTTACATAGTTGCCCTGAGAAAATGCGAG-3’ (SEQ ID No 3)。该引物主要是将上述CFHRl扩增引物对的扩增产物进行测序，以测得CFHRl上标记为rs6677604的 SNP基因座的序列，进而得到样本的基因型。
本发明要解决的一个技术问题是提供一种用于鉴定人组织样本DNA中补体因子H 相关蛋白1 (CFHRl)基因型的试剂盒，该试剂盒包含下列成分
a、从人组织样本中提取DNA模板的试剂；
b、用于从DNA模板中扩增CFHRl基因片段的引物，包括扩增标记为rs6677604的 CFHRl扩增引物对
上游引物:5，-GATGGAAGACACCAGAGCAGAT-3，(SEQID No 1)
下游引物:5，-GAATCCATCAGCTTCTACCATT-3’(SEQ ID No 2)；
C、用于对DNA扩增产物的片断进行基因型鉴定的引物序列，包括标记为 rs6677604的CFHRl基因型鉴定的引物序列
5， -TGAACACATGACTTACATAGTTGCCCTGAGAAAATGCGAG-3’ (SEQ ID No 3)。
其中，上述试剂盒中所述的人组织样本为外周血样本。
本发明提供的标记为rs6677604的CFHRl扩增引物对可应用于制备鉴定人组织样本DNA中补体因子H相关蛋白1 (CFHRl)基因型的试剂盒。
本发明提供的标记为rs6677604的CFHRl基因型鉴定的引物可应用于制备鉴定人组织样本DNA中补体因子H相关蛋白1 (CFHRl)基因型的试剂盒。
本发明提供的鉴定人组织样本DNA中补体因子H相关蛋白1 (CFHRl)基因型的试剂盒可用于检测年龄相关性黄斑变性(AMD)患者CFHRl基因型。
本发明还提供了一种鉴定人组织样本DNA中补体因子H相关蛋白1 (CFHRl)基因型的方法，该方法包括以下步骤
a、从人组织样本中提取和纯化DNA模板；
b、利用DNA模板扩增补体因子H相关蛋白1 (CFHR1)基因片段，采用的扩增引物为rs6677604标记的CFHRl扩增引物对
上游引物5，-GATGGAAGACACCAGAGCAGAT-3，(SEQID No I)；
下游引物:5，-GAATCCATCAGCTTCTACCATT-3’(SEQ ID No 2)；
C、使用基因型鉴定的引物序列对步骤b得到的补体因子H的基因片段进行扩增， 得到的产物测序进行基因型SNP鉴定，如果其中保护性等位基因为纯合子标记为AA ;其中如果致病性等位基因为纯合子标记为GG ;其中如果保护性/致病性等位基因为杂合子标记为AG。
其中所述的基因型鉴定的引物为 5’ -TGAACACATGACTTACATAGTTGCCCTGAGAAAA TGCGAG-3’ (SEQ ID No 3)。
本发明还提供了一种测定血浆中CFHRl含量的免疫印迹试剂盒，该试剂盒包含下列成分
a、抗 CFHRl 的抗体；
b、CFHRI 标准品。
其中用于制备抗CFHRl抗体的多肽为CPTVQNAHILSRQMS (SEQ ID No 4)。
其中所述抗CFHRl的抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或单链抗体可变区片段中的任一种。
本发明还提供了测定血浆中CFHRl含量的方法，包括以下步骤
a、将血浆样本进行SDS电泳；
b、将电泳分离后的胶转印至尼龙薄膜；
C、使抗CFHRl抗体与薄膜上的蛋白结合；
d、测定所述抗体与CFHRl的结合量。
其中，上述方法中所述的步骤d可采用化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附试验法、生物素一亲和素系统测定法、放射免疫测定法中的至少一种方法来检测所述抗体与 CFHRl的结合量。
其中，上述方法中还可包括步骤e，即根据以CFHRl标准品测得的标准曲线，测定血浆中的CFHRl量。
本发明还提供一种从血浆中分离纯化含CFHRl的高密度脂蛋白的试剂盒，该试剂盒包含下列成分溴化钾，比重计，离心管和透析膜。
本发明还提供一种从血浆中分离纯化含CFHRl的高密度脂蛋白的方法，该方法包括以下步骤
a、将外周血进行血浆分离
b、用溴化钾将血浆调整至I. 027克/毫升
c,45,000RPM 离心 18 小时
d、丢弃上层液后，提取中层液体
e、用溴化钾将其调整至I. 065克/毫升
f、45，000RPM 离心 18 小时
g、上层液体，放入透析袋；
h、用PBS透析后测定蛋白浓度
本发明还提供了一种定量检测高密度脂蛋白样颗粒上CFHRl结合量的试剂盒，该试剂盒包含下列成分
a、抗载脂蛋白Al抗体，用于将血浆中高密度脂蛋白样颗粒俘获；
b、抗CFHRl的抗体，用于与含高密度脂蛋白样颗粒的样品接触。
其中用于制备抗CFHRl抗体的多肽序列为CPTVQNAHILSRQMS (SEQ ID No 4)。
其中所述抗CFHRl的抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或单链抗体可变区片段中的任一种。
本发明同时提供了一种定量检测高密度脂蛋白样颗粒上CFHRl结合量的方法，包括以下步骤
a、用抗载脂蛋白Al抗体将血浆中高密度脂蛋白俘获；
b、将抗CFHRl的抗体与含高密度脂蛋白样颗粒的样品接触；
C、使抗CFHRl的抗体与其中的CFHRl结合；
d、测定抗CFHRl的抗体与CFHRl的结合量。
其中，上述方法中所述的步骤d可采用化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附试验法、生物素一亲和素系统测定法、放射免疫测定法中的至少一种方法来检测所述抗体与 CFHRl的结合量。
为了使检测结果更为准确，可以通过使用纯化的CFHRl标准品与抗CFHRl的抗体制备得到标准曲线，然后通过标准曲线来获得待测样品中高密度脂蛋白样颗粒上CFHRl结合量。因此，上述方法中还可包括步骤e，即根据以CFHRl标准品测得的标准曲线，测定氧化高密度脂蛋白样颗粒表面的CFHRl量。
本发明提供了一种定量检测高密度脂蛋白样颗粒上氧化特异性抗原的试剂盒，该试剂盒包含下列成分
a、抗载脂蛋白Al抗体，用于将血浆中高密度脂蛋白样颗粒俘获；
b、抗磷酸胆碱的抗体，用于与含高密度脂蛋白样颗粒的样品接触。
其中，上述试剂盒中所述抗磷酸胆碱的抗体的编码基因含有S107VH重链可变区和V-kappa 22VL轻链可变区。
本发明同时提供了一种定量检测含高密度脂蛋白样颗粒上氧化特异性抗原的方法，包括以下步骤
a、用抗载脂蛋白Al抗体将血浆中高密度脂蛋白俘获；
b、将抗磷酸胆碱的抗体与高密度脂蛋白的样品接触；
C、使所述抗磷酸胆碱的抗体与氧化磷酸胆碱结合；
d、测定所述抗磷酸胆碱的抗体与氧化磷酸胆碱的结合量。
其中，上述方法中所述的步骤d可采用化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附试验法、生物素一亲和素系统测定法、放射免疫测定法中的至少一种方法来检测所述抗体与氧化磷酸胆碱的结合量。
其中，上述方法还可包括步骤e，即根据以磷酸胆碱化合物为标准品测得的标准曲线，测定氧化高密度脂蛋白表面的氧化特异抗原决定簇的量。
其中，上述方法中所述的抗体的编码基因含有S107VH重链可变区和V-kappa 22VL轻链可变区。
其中，上述方法中所述的含有氧化高密度脂蛋白样品为血清、血浆、组织匀浆液或组织提取液。
本发明还提供一种定量测定补体因子H相关蛋白I与氧化特异性抗原结合的试剂盒，该试剂盒含有下列成分
a、含POVPC的氧化特异性抗原；
b、抗 CFHRl 的抗体。
本发明同时提供一种定量测定补体因子H相关蛋白I与氧化特异性抗原结合的方法，包含下列操作步骤
a、制备含POVPC的氧化特异性抗原；
b、包被氧化特异性抗原在微孔板上；
C、将血浆中CFHRl与氧化特异性抗原结合；
d、用抗CFHRl的抗体测定CFHRl与氧化特异性抗原的结合量。
其中，上述方法中所述的步骤d可采用化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附试验法、生物素一亲和素系统测定法、放射免疫测定法中的至少一种方法来检测所述CFHRl与氧化特异性抗原的结合量。
其中，上述方法还可包括步骤e，即根据以CFHRl为标准品测得的标准曲线，测定 CFHRl与氧化特异性抗原的结合量。
本发明中CFHRl标准品可采用以下方式获得将CFHRl重组质粒转染真核生物体外表达系统，该质粒表达后，然后通过亲和层析纯化得到CFHRl标准品。
本发明中外周血基因组DNA的提取与纯化，可以通过本领域熟知的生物工程方法制备，可使用Qiagen公司的血液DNA纯化试剂盒。
在本发明的定量检测含高密度脂蛋白样颗粒上氧化特异性抗原的方法中，所述抗载脂蛋白Al抗体和抗磷酸胆碱的抗体可从市场上购买也可通过本领域熟知的生物工程方法制备。例如，购自Sigma化学公司的抗人体ApoAI抗体Anti-humanApoAI(HDL)和TEPC15 即可用做本发明方法中的抗体。此外，可以用常规免疫学方法制备抗载脂蛋白Al抗体(即用纯化人载脂蛋白B注射山羊制备抗血清纯化IgG的方法)，或者用生物工程方法制备抗磷酸胆碱的抗体，优选编码所述抗磷酸胆碱的抗体的基因含有S107VH重链可变区和V-kappa 22VL轻链可变区。在检测过程中，为了使检测结果更为准确，可以通过不同量的磷酸胆碱化合物标准品与抗磷酸胆碱的抗体的结合获得标准曲线，测定氧化高密度脂蛋白表面的氧化特异抗原决定簇的量。
在本发明中“磷酸胆碱”(Phosphocholine)指的是磷脂酰胆碱(卵磷脂)的两条脂肪酸尾巴被去掉后所余下的结构部分。
本发明的检测抗原与抗体结合量的方法基于抗原抗体间反应的特异性和标记物检测的灵敏性，是一种免疫标记测定方法。即采用酶、荧光剂、放射性同位素、发光剂或电子致密物质标记抗体或抗原，进行抗原抗体间的特异性反应，从而能定量检测抗体或抗原的量。其中将抗原特异性抗体标记后进行检测的方法是直接法，采用标记的第二抗体对检测结果进行放大的方法为间接法。
在本发明的方法中，采用直接化学发光免疫分析法、间接化学发光免疫分析法、直接放射免疫测定法、间接放射免疫测定法、直接酶联免疫吸附试验法、间接酶联免疫吸附试验法、直接生物素一亲和素系统测定法、间接生物素一亲和素系统测定法中的任一种来完成。而上述这些直接法和间接法又分别可进一步地分为夹心法和非夹心法。
双抗体夹心法可如下完成先将抗磷酸胆碱抗体固定在固相载体上，加入含有氧化低密度脂蛋白的样品，使二者接触，再加入抗ApoB抗体(或称抗LDL抗体，Sigma)，使之与氧化低密度脂蛋白接触，测定抗ApoB抗体的量而定量氧化低密度脂蛋白的含量。或者， 先将抗ApoB抗体固定在固相载体上，加入含有氧化低密度脂蛋白的样品，使二者接触，再加入抗磷酸胆碱抗体，使之与氧化低密度脂蛋白接触，测定抗磷酸胆碱抗体的量而定量氧化低密度脂蛋白的含量。
本发明中的鉴定人组织样本DNA中补体因子H相关蛋白I (CFHR1)基因型的试剂盒可用于检测年龄相关性黄斑变性(AMD)患者CFHRl基因型。
本发明中的测定血浆样品中CFHRl含量的试剂盒可用于检测血浆样品中CFHRl含量。
本发明中的从血浆中分离纯化含CFHRl的高密度脂蛋白的试剂盒可用于分离纯化血浆中含CFHRl的高密度脂蛋白。
本发明中的定量检测高密度脂蛋白样颗粒上CFHRl结合量的试剂盒可用于检测血浆样品中高密度脂蛋白样颗粒上CFHRl的结合量。
本发明中的检测血浆样品中高密度脂蛋白样颗粒上氧化特异性抗原的试剂盒可用于检测血浆样品中高密度脂蛋白样颗粒上氧化特异性抗原。
本发明中的检测血浆样品中CFHRl蛋白与氧化特异性抗原结合的试剂盒可用于检测血浆样品中CFHRl蛋白与氧化特异性抗原的结合。
本发明所述的任一试剂盒均可用于检测年龄相关性黄斑变性(AMD)疾病的发生、 发展。
通过我们建立的计算公式，我们可以推断出AMD发病的几率。
本发明的有益效果在于创造性地确认了不同基因型CFHRl通过氧化应激影响 AMD风险的新机制和CFHRl在这一调节过程中的作用。开发出不同基因型CFHRl的检测试剂盒和检测方法。这些发现可能会导致在预防和治疗老年黄斑退化的新策略，如通过CFHRl 活性的抑制或对其下游的参与脉络膜形成炎症基因，包括IL-I的活性抑制，以期能预防和治疗老年黄斑退化。本发明的试剂盒具有广阔的开发应用前景。
图I、为天然与氧化磷脂的结构图
IA为天然的磷酸胆碱的分子结构；1B为氧化的磷酸胆碱的分子结构，其中箭头所指的虚线椭圆框内所示为T15抗氧化磷脂抗体的抗原决定簇。
图2、CFHRl缺失rs6677604基因型的鉴定图谱
2A为纯和保护性基因型(AA) ;2B为杂和基因型(AG) ;2C为纯和致病性基因型 (GG)0
图3、为高密度脂蛋白样颗粒的组成部分
3A 为 Westernblot 检测人血衆；
3B为Westernblot检测相应的所分离纯化的高密度脂蛋白样颗粒；
rs6677604与纯合子AA基因型的样本被标示成“保护型”;rs6677604纯合子GG基因型的样本被标示成“风险型”。
3C、显不闻密度脂蛋白样颗粒含有氧化憐脂(oxPL);纵坐标表不闻密度脂蛋白样颗粒上氧化磷脂的值，数据以相对光单位(RLU)表示，平均值土SEM。
图4、重组补体因子H相关蛋白I (rCFHRl)能够特异性地与氧化磷脂结合
4A显示rCFHRl能够与POVPC - BSA，氧化低密度脂蛋白(oxLDL)呈剂量依赖性结合，但却不能够与天然LDL和BSA结合。Nat-LDL表示非氧化的,天然的低密度脂蛋白。
4B显示oxLDL能够竞争性抑制rCFHRl与P0VPC-BSA的结合。将rCFHRl与不断增加浓度的竞争剂预先预孵育，然后添加到一个包被P0VPC-BSA的微孔板，再以抗CFHRl抗体检测结合到板上的CFHR1。数据表示为BziBtl，其中Btl是没有竞争剂时CFHRl与抗原的结合值。图A和B均为三次实验结果的平均值。
4C 和 4D :血浆中 oxPL (C)或 CRP (C-反应蛋白)(D)的水平与 CFHRlrs6677604 基因型相关(CFHR1 Λ，N=8与CFHR1，N=82)。数据表示为平均相对光单位(RLU) 土SEM。
4E和4F:高密度脂蛋白样颗粒刺激炎症性基因表达。图E，将保护型 (rs6677604AA, CFHRl Δ ,N=4),或风险型(rs6677604GG，CFHRl，N=4)基因型的高密度脂蛋白样颗粒处理的ARPE-19细胞，然后用定量PCR测定所示基因的表达。图F表示用氧化低密度脂蛋白处理ARPE-19细胞在有无rCFHRl存在(N=4)的条件下IL-IA的表达。相对mRNA 水平用GAPDH的水平进行调整后，相对于未经处理的样品进行比对。Nat-LDL表示非氧化的，天然的低密度脂蛋白。
图5、含CFHRl高密度脂蛋白样颗粒促进CNV的形成
5A和5C :视网膜下注射含CFHRl高密度脂蛋白样颗粒诱导CNV的。用isolectin 染色(绿，5A)可以查看到新生血管性活动(箭头)；而巨噬细胞在视网膜下腔的浸润(箭头) 则通过F4/80阳性染色(红色，5B)观察所确定。合并后的图像显示isolectin和F4/80染色标记新生血管和巨噬细胞浸润共存在于注射部位附近(5C)。细胞核用DAPI (蓝色)反染色显示。
5D和5E为阴性对照面板，显示天然低密度脂蛋白注射后没有促进CNV新生血管的活动(5D)或巨噬细胞的浸润(5E)。尺寸把100微米。
图6、oxPL，载脂蛋白Al和CFHRl在AMD共同存在于患者玻璃膜疣
免疫组化显示，当AMD患者的眼睛切片被如下抗体免疫染色的结果无抗体(6A)， 抗oxPL抗体(6B)，抗载脂蛋白Al (60抗体，和抗0 服1抗体(60)。尺寸把50微米。
图7、激光诱导脉络膜CNV实验结果
7A表示脉络膜新生血管(CNV)在野生型和IL-I受体敲除小鼠的面积大小比较；7B 表示脉络膜新生血管(CNV)在野生型小鼠中加入IL-I抑制剂与没有抑制剂的面积大小比较；
7A和7B中的纵坐标表示新生血管面积(μ m2)
7C和7D为7A中野生型和IL-I受体敲除小鼠的面积的代表性影像；7E和7F为7B 中入IL-I抑制剂与没有抑制剂的面积的代表性影像。
具体实施方式
本发明中，最初在1560个无血缘关系的欧洲人后裔白种人个体中的CFHrsl061170C/T和CFHRl rs6677604A/G的基因分型，包括886个AMD病人和674个正常对照组。我们的研究结果表明rsl061170和rs6677604的单核苷酸多态性与AMD高度相关 (ρ=4· 53Χ1(Γ16和 4· 98Χ 10,，表 I)。单核苷酸多态性rsl061170 将对missense CFH Y402H 变异编码，并在之前显示出与AMD强烈关联3’5_7。CFHRl表达是否缺失可以通过rs6677604 基因座上的SNP来检测。若要确定是否与带有AMD的rs6677604关联是独立于rsl061170， 我们执行逐步回归分析。即在对rs 1061170调后节，rs6677604仍然强烈关联AMD风险 (p=l. 16X IO-3)。为了进一步验证这一发现，使用来自密歇根、梅奥、AREDS、宾夕法尼亚州 (MMAP)群体研究的独立群体(国家眼科研究所，Accession phs000182. v2. pi)来进行同样的分析。在MMAP的数据集中，SNP rsl0801555作为rsl061170代理SNP(r2=0. 99)9。如所料，遗传协会MMAP数据的分析显示，rsl0801555与AMD强烈关联。调节rsl0801555之后发现，在MMAP群集中rs6677604仍然与AMD大大相关联(p=2. 38X 1(Γ6，表2)。同时，这些结果确定与AMD风险与CFHRl相关联并独立于CFH Υ402Η。究由四川大学华西医院和圣地亚哥加利福尼亚大学的机构审查委员会批准。所有参与者都提供了书面的知情同意文档， 都进行了标准的眼部检查，包括视力测量，扩张狭缝灯显微镜、彩色摄影和荧光素眼底血管造影。湿性AMD的诊断是基于根据AREDS所设立的分类得到CNV的存在25。
表ICFH rsl061170)和CFHRl (rs6677604)的单核苷酸多态性与AMD高度相关
权利要求
1.用于从DNA模板中扩增CFHRl基因片段的引物对，包括标记为rs6677604的CFHRl上SNP基因座CFHRl扩增引物对，其序列如SEQ ID No I和SEQ ID No 2所示 上游引物5’ -GATGGAAGACACCAGAGCAGAT-3’ (SEQ ID No I)； 下游引物5’ -GAATCCATCAGCTTCTACCATT-3’ (SEQ ID No 2)。
2.用于对标记为rs6677604的CFHRl上SNP基因座进行基因型鉴定的引物，其序列如SEQ ID No 3 所示5’ -TGAACACATGACTTACATAGTTGCCCTGAGAAAATGCGAG-3’ (SEQ ID No3)。
3.权利要求I中所述的引物对在制备鉴定人组织样本DNA中CFHRl基因型的试剂盒中的应用。
4.权利要求2中所述的引物在制备鉴定人组织样本DNA中CFHRl基因型的试剂盒中的应用。
5.用于鉴定人组织样本DNA中CFHRl基因型的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含下列成分 a、从人组织样本中提取DNA模板的试剂； b、用于从DNA模板中扩增CFHRl基因片段的引物，包括标记为rs6677604的CFHRl扩增引物对，其序列如SEQ ID No I和SEQ ID No 2所示 上游引物:5，-GATGGAAGACACCAGAGCAGAT-3，(SEQ ID No I) 下游引物5’ -GAATCCATCAGCTTCTACCATT-3’ (SEQ ID No 2)； c、用于对DNA扩增产物的片断进行基因型鉴定的引物序列，包括rs6677604标记的CFHRl基因型鉴定的引物序列，其序列如SEQ ID No 3所示5’ -TGAACACATGACTTACATAGTTGCCCTGAGAAAATGCGAG-3’ (SEQ ID No3)。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述的人组织样本为外周血样本。
7.鉴定人组织样本DNA中CFHRl基因型的方法，其特征在于该方法包括以下步骤 a、从人组织样本中提取和纯化DNA模板； b、利用DNA模板扩增CFHRl基因片段，采用的扩增引物为标记为rs6677604的CFHRl扩增引物对 上游引物5’ -GATGGAAGACACCAGAGCAGAT-3’ (SEQ ID No I)； 下游引物5’ -GAATCCATCAGCTTCTACCATT-3’ (SEQ ID No 2)； c、使用基因型鉴定的引物序列对步骤b得到的CFHRl的基因片段进行扩增，得到的产物测序进行基因型SNP鉴定，如果其中保护性等位基因为纯合子标记为AA ;其中如果致病性等位基因为纯合子标记为GG ;其中如果保护性/致病性等位基因为杂合子标记为AG ； 所述的基因型鉴定的引物序列包括rs6677604标记的CFHRl基因型鉴定的引物序列5’ -TGAACACATGACTTACATAGTTGCCCTGAGAAAATGCGAG-3’ (SEQ ID No3)。
8.测定血浆中CFHRl含量的免疫印迹试剂盒，其特征在于该试剂盒包含下列成分 a、抗CFHRl的抗体； b、Ci7HRl标准品。
9.测定血浆中CFHRl含量的方法，其特征在于该方法包括以下步骤 a、血浆样本进行SDS电泳； b、将电泳分离后的胶转印至尼龙薄膜；C、使抗CFHRl抗体与薄膜上的蛋白结合； d、测定所述抗体与CFHRl的结合量。
10.一种定量检测高密度脂蛋白样颗粒上CFHRl结合量的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含下列成分 a、抗载脂蛋白Al抗体； b、抗CFHRl的抗体。
11.一种定量检测高密度脂蛋白样颗粒上CFHRl结合量的方法，其特征在于该方法包括以下步骤 a、用抗载脂蛋白Al抗体将血浆中高密度脂蛋白俘获； b、抗CFHRl的抗体与高密度脂蛋白样颗粒样品接触； C、使抗CFHRl的抗体与其中的CFHRl结合； d、测定抗CFHRl的抗体与CFHRl的结合量。
12.一种定量检测高密度脂蛋白样颗粒上氧化特异性抗原的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含下列成分 a、抗载脂蛋白Al抗体，用于将血浆中高密度脂蛋白样颗粒俘获； b、抗磷酸胆碱的抗体，用于与含高密度脂蛋白样颗粒的样品接触。
13.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于所述抗磷酸胆碱的抗体的基因含有S107VH重链可变区和V-kappa 22VL轻链可变区。
14.一种定量检测高密度脂蛋白样颗粒上氧化特异性抗原的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 a、用抗载脂蛋白Al抗体将血浆中高密度脂蛋白俘获； b、抗磷酸胆碱的抗体与含高密度脂蛋白的样品接触； C、使抗磷酸胆碱的抗体与氧化磷酸胆碱结合； d、测定抗磷酸胆碱的抗体与氧化磷酸胆碱的结合量。
15.根据权利要求14所述的定量检测高密度脂蛋白样颗粒上氧化特异性抗原的方法，其特征在于所述的含有氧化高密度脂蛋白样品为血清、血浆、组织匀浆液或组织提取液。
16.一种定量测定CFHRl与氧化特异性抗原结合的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有下列成分 a、含POVPC的氧化特异性抗原； b、抗CFHRl的抗体。
17.一种定量测定CFHRl与氧化特异性抗原结合的方法，其特征在于包含如下步骤 a、制备含POVPC的氧化特异性抗原； b、包被氧化特异性抗原在微孔板上； C、将血浆中CFHRl与氧化特异性抗原结合； d、用抗CFHRl的抗体测定CFHRl与氧化特异性抗原的结合量。
18.根据权利要求8、10或16所述的试剂盒，其特征在于用于制备抗CFHRl的抗体的多肽的序列如SEQ ID No 4所示。
19.根据权利要求8、10或16所述的试剂盒，其特征在于所述抗CFHRl的抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或单链抗体可变区片段中的任一种。
20.根据权利要求9、11、14或17所述的方法，其特征在于所述步骤d可采用化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附试验法、生物素一亲和素系统测定法、放射免疫测定法中的至少一种方法来测定所述抗体与抗原的结合量。
21.根据权利要求9、11、14或17所述的方法，其特征在于还包括步骤e，即根据以纯化的CFHRl或者磷酸胆碱化合物为标准品测得的标准曲线，确定CFHRl的定量或高密度脂蛋白样颗粒表面的氧化特异抗原决定簇的量。
全文摘要
本发明要解决的技术问题是提供年龄相关性黄斑变性(AMD)疾病发生、发展的诊断试剂。本发明涉及对CFHR1基因型鉴定、血浆样品中CFHR1含量测定、高密度脂蛋白样颗粒上CFHR1结合量和CFHR1与氧化特异性抗原结合的试剂盒及其检测方法。本发明对年龄相关性黄斑变性(AMD)疾病发生、发展的诊断提供了可靠的参照指标。创造性地确认了不同基因型CFHR1。而本发明的工作可能会导致在预防和治疗老年黄斑退化的新策略，如通过CFHR1活性的抑制或对其下游的参与脉络膜形成炎症基因，包括IL-1的活性抑制，以期能预防和治疗老年黄斑退化。具有广阔的开发应用前景。
文档编号C12N15/11GK102978204SQ20121045134
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月12日 优先权日2011年11月11日
发明者张康, 彼得.肖 申请人:张康