专利名称：一种减弱反馈抑制菌株生产谷胱甘肽的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体地说，是关于一株用减弱了反馈抑制的菌株提高谷胱甘肽累积量的方法。
背景技术：
谷胱甘肽(Y-L-glutamyl-cysteiny 1-glycine, GSH),是由 L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸组成的生物活性三肽化合物，是细胞内重要的抗氧化剂和主要的非蛋白巯基化合物(> 90% )。在生物组织中，谷胱甘肽通过谷胱甘肽还原酶保持氧化型和还原型的动态平衡并发挥细胞保护、物质代谢、信息调控、调节细胞及组织的发育、对抗或诱发疾病等作用，因此，大量应用于医药保健、护肤美容、食品添加等行业。对于谷胱甘肽的生产，经历了萃取法、化学合成法、酶催化法和发酵法，其中发酵法已成为生产谷胱甘肽的主要方法。基于发酵法的菌株选育和条件优化等生产方法的应用也使谷胱甘肽的生产得到了提高并广 泛在实验室规模上加以实验，但应用于实践的却不多，究其原因，主要是谷胱甘肽合成过程中的限速酶，Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶容易受到终产物谷胱甘肽的反馈抑制，当终产物浓度达到一定程度后就会反馈抑制Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性，使产量维持在较低的水平。多年来，科研工作者们用了很多方法试图通过减弱反馈抑制的方法来提高目的产物的产量，如Murata等人早期成功构建了具有较强GSH合成能力的重组E. coli并从E. coliB中筛选得到一株GSHl脱敏突变株，克隆了其GSHl基因并在E. coli B RC912中得以表达，获得的菌株合成GSH的能力大大提高。Liang与Zhao等人通过在培养基中添加表面活性剂和制霉素的方法抑制细胞膜的合成，使产物及时的分泌出来，减弱了反馈抑制，提高了产量。但这些操作都是基于提高酶系的活力或降低酶系对GSH的敏感性，没从本质上消除反馈抑制。况且，一些表面活性剂的加入会对细胞产生一定的毒性。因此，寻求新的方法减弱或者消除反馈抑制以从根本上提高目的产物的产量显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种谷胱甘肽合成酶系重组质粒，以用于构建表达谷胱甘肽合成酶系的菌株。本发明还有一个目的在于，提供一种谷胱甘肽合成酶系重组质粒的构建方法。本发明还有一个目的在于，提供一种谷胱甘肽合成酶系重组质粒的应用。本发明还有一个目的在于，提供一种减弱反馈抑制菌株生产谷胱甘肽的方法。本发明提供的谷胱甘肽合成酶系重组质粒包括GSHl和GSH2序列和两个合适的载体片段；所述GSHl和GSH2序列分别如NCBI上Gene ID为242378250和253978924的序列所示。根据本发明的一个优选实施例，在谷胱甘肽合成酶系重组质粒中，GSHl和GSH2分别连接在不同的载体上，根据两个载体启动子的不同调控两个基因表达的时间，从而使GSHl和GSH2分开表达，进而使合成Y-谷氨酰半胱氨酸(谷胱甘肽合成过程中的中间产物，由Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶催化合成)和谷胱甘肽分步进行，消除反馈抑制。根据本发明的另一个优选实施例，所述谷胱甘肽合成酶系重组质粒分别包括一个卡那霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，用以筛选基因重组菌。本发明提供的谷胱甘肽合成酶系重组质粒的构建方法包括以下步骤A) PCR扩增获得GSHl和GSH2序列；B)将GSHl和GSH2序列分别克隆入pET28a和pBAD24。本发明提供的谷胱甘肽合成酶系重组质粒可用于构建表达谷胱甘肽合成酶系的菌株。
本发明提供的方法可用于累积谷胱甘肽。本发明提供的累积谷胱甘肽的方法通过发酵培养本发明提供的谷胱甘肽合成酶系重组菌株，累积谷胱甘肽。根据本发明的另一个优选实施例，累积谷胱甘肽的方法还通过，在选择高产菌株后，通过高密度发酵的技术来累积谷胱甘肽。使用本发明提供的双质粒可以构建累积谷胱甘肽大肠杆菌，可以明显的减弱反馈抑制，提高了谷胱甘肽生产量，提高了原料利用率、降低了成本和能耗，可为进一步研究生物法合成谷胱甘肽建立一个基础模型。除此之外，该方法构建的菌株及思路可以用于其他因反馈抑制限制产量提高的目的产物，为生产有价值的产品提供了新的思路。
图I是PCR扩增获得的GSHl的检测结果，其中泳道I为GSHl。图2是PCR扩增获得的GSH2的检测结果，其中泳道I为GSH2。图3是BL21-GSH1，BL21-GSH2及BL21-GSH12质粒PCR后的电泳图，其中泳道1，2，3和4，5，6分别对应GSH1GSH2及GSHl和GSH2的DNA片段。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。以下实施例中为注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验室手册》(New York CoLd Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件或厂商提供的方案进行。在本发明的下述实施例中，使用的胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒均购自生工生物公司。在本发明的下述实施例中，使用的pMD-18TSimpLe Vector,Hind III,Xba I,BamHI, Taq DNA聚合酶，T4DNA连接酶，DNA Marker,均购自TAKARA公司。在本发明的下述实施例中，使用的表达载体pET28a、pBAD24,菌种E. coliBL21(DE3)、E. coli DH5 α，为中国药科大学生命中心实验室保存，其中菌种E. coliBL21 (DE3)的 ATCC 编号为 BAA-1025 。在本发明的下述实施例中，使用的E. coli BL21(DE3)感受态细胞、E. coli DH5 α感受态细胞，购自天根生化科技有限公司。在本发明的下述实施例中，使用的LB培养基的配方为1%胰蛋白栋，O. 5%酵母浸粉，1% NaCl ;使用的摇瓶发酵培养基的配方为1%胰蛋白栋，O. 5%酵母浸粉，l%NaCl。配置固体LB平板培养基时，按照上述配方添加2%琼脂粉。在本发明的下述实施例中，感受态细胞的制备和转化，按照《分子克隆实验室手册》提供的方法进行。实施例I两个表汰质粒的构律I. I引物设计根据NCBI报道的GSHl和GSH2序列，设计以下4条引物 GSHlUP CGCGGATCCATGATCCCGGACGTATCACAGGC ；GSHlDOffN CCCAAGCTTTCAGGCGTGTTTTTCCAGCCACACC ；GSH2UP GCTCTAGAGATGATCAAGCTCGGCATCGT ；GSH2D0WN :ATGAAGCTTTTACTGCTGCTGTAAACGTGC。其中GSHlUP和GSH1D0WN用于扩增GSHl编码区；GSH2UP和GSH2D0WN用于扩增GSH 编码区；GSH1UP、GSH1D0WN、GSH2UP、GSH2D0WN 上的下划线表示在 GSH1UP、GSH1D0WN、GSH2UP、GSH2D0WN 上分别引入的 BamH I, Hind III、XbaI 和 Hind III 酶切位点。I. 2PCR 扩增 GSHl 和 GSH2 序列抽提得到大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)基因组。以大肠杆菌E. coli BL21(DE3)基因组为模板，分别以步骤I. I中设计的GSHlUP和GSH1D0WN以及GSH2UP和GSH2D0WN为引物对，进行PCR扩增，具体如下扩增GSHl 和 GSH2 的反应体系均为10 X PCR Buffer 5μ L,2mM dNTPs 5μ L,25mMMgS042 y L，上下游引物(10 μ M)各 I μ L，Ε. coli BL21(DE3)基因组 DNA I μ L，Taq DNA 聚合酶I μ L,加入去离子水，至体系总体积为50 μ L0扩增GSHl 的反应条件94°C 5min ；94°C 30s，56°C 40s, 72 °C 5min，25 个循环；72°C IOmin。扩增GSH2 的反应条件94°C 5min ；94°C 30s，52°C 70s, 72 °C 5min，25 个循环；72°C IOmin。PCR扩增产物分别进行凝胶电泳检测，检测结果如图I和图2所示。根据图I和图2的结果，获得的产物的大小分别为1500bp和900bp，符合GSHl和GSH2产物的预期大小。I. 3表达载体的构建I. 3. I构建预处理使用胶回收试剂盒纯化步骤I. 2中获得的PCR产物，然后和pMD-18T SimpLe载体，用T4DNA连接酶，于16°C连接过夜，反应体系如下4 μ L 的 PCR 产物，I μ LpMD-18Τ SimpLe 载体，5 μ L T4 DNA 连接酶。连接产物转化大肠杆菌DH5a并涂布含有60 μ g/mL氨苄青霉素的固体LB平板，37°C培养至转化子长出。其中E. coli DH5a是无氨苄青霉素抗性菌株，不能在含有氨苄青霉素的固体LB平板上生长，因此，平板上长出的转化子均为转化了 pMD-GSHl或PMD-GSH2质粒的大肠杆菌。挑取转化子鉴定，根据鉴定结果，最终获得两个质粒pMD-GSHl和 pMD-GSH2。
质粒pMD-GSHl或pMD_GSH2经测序验证，分别包含GSHl、GSH2编码区(GSH1、GSH2编码区序列分别如SQ ID NO. I和SQ ID NO. 2所示)，而且编码区无氨基酸残基突变。I. 3. 2表达载体的构建将I. 3. I中双酶切产物GSHl和GSH2凝胶回收纯化，分别与BamH Ι/HindIII双酶切的表达载体pET28a和Xba Ι/HindIII双酶切的表达载体PBAD24连接，将连接产物分别转化入宿主菌E. coli DH5 α，并涂布含有60 μ g/mL卡那霉素和氨苄青霉素的固体LB平板，37°C培养至转化子长出。其中E. coli DH5a是无氨苄青霉素抗性菌株，不能在含有卡那霉素或氨苄青霉素的固体LB平板上生长，因此，平板上长出的转化子均为转化了pET28a-GSHl或pBAD24_GSH2质粒的大肠杆菌。挑取转化子鉴定，根据鉴定结果，最终获得两个质粒 pET28a-GSHl 和 pBAD24_GSH2。质粒pET28a-GSHl和pBAD24_GSH2经测序验证，分别包含GSHl和GSH2编码区(GSHUGSH2编码区序列分别如SQ ID NO. I和SQ ID NO. 2所示)，其中GSH1、GSH2编码区分别置于T7启动子、Lac操纵子之下和araBAD启动子、阿拉伯糖操纵子之下，而且编码区无氨基酸残基突变。实施例2双质粒的构建将I. 3. I中得到的带有质粒质粒pET28a-GSHl和pBAD24_GSH2的大肠杆菌，抽提两个质粒并一起转化入宿主菌E. coli BL21 (DE3)，并涂布同时含有60 μ g/mL卡那霉素和氨苄青霉素的固体LB平板，37°C培养至转化子长出。其中E. coli BL21(DE3)是无卡那霉素和氨苄青霉素抗性菌株，不能在含有卡那霉素和氨苄青霉素的固体LB平板上生长，因此，平板上长出的转化子均为转化了 pET28a-GSHl和pBAD24_GSH2质粒的大肠杆菌。分别随机挑取若干含pET28a-GSHl和pBAD24_GSH2质粒的转化子，摇瓶发酵培养，并分别选取谷胱甘肽累积量较高的大肠杆菌菌株各两株，一株命名为BL21-GSH12。同时，将抽提得到的pET28a-GSHl和pBAD24_GSH2分别转化宿主菌E. coliBL21 (DE3)，并分别涂布含有60 μ g/mL卡那霉素和氨苄青霉素的固体LB平板，37°C培养至转化子长出。其中E. coli BL21(DE3)是无卡那霉素和氨苄青霉素抗性菌株，不能在含有卡那霉素或氨苄青霉素的固体LB平板上生长，因此，在含卡那霉素的LB平板上长出的转化子为转化了 pET28a-GSHl质粒的大肠杆菌，在含氨苄青霉素的固体LB平板上转化子为转化了PBAD24-GSH2质粒的大肠杆菌。分别随机挑取若干含pET28a-GSHl和pBAD24_GSH2质粒的转化子，摇瓶发酵培养，并分别选取谷胱甘肽累积量较高的大肠杆菌菌株各两株，一株命名为BL21-GSH1，另一株命名为 BL21-GSH2。抽提BL21-GSH12的质粒并对其进行琼脂糖凝胶电泳，电泳后将两个质粒pET28a-GSHl和pBAD24_GSH2分别进行胶回收，之后以两个质粒作为模板并分别以引物GSHlUP和GSH1D0WN，GSH2UP和GSH2D0WN对上述抽提物进行PCR扩增，将PCR扩增得的产物经琼脂糖凝胶电泳，如图3所示，得了长度分别为I. 5kb，和O. 9kb的片段，确证GSHl和GSH2的表达框均已插入。根据上述结果，BL21-GSH12含有GSHl和GSH2基因。实施例3 BL21-GSH1、BL21-GSH2、BL21-GSH12 和 E.coli BL21(DE3)摇瓶发酵谷胱甘肽
将于37 °C 固体 LB 平板上生长过夜的 BL21-GSH1、BL21-GSH2、BL21-GSH12 和E. coliBL21(DE3)(原始菌，命名为BL21)的单菌落，分别接入液体LB培养基中，摇瓶培养过夜。分别取适量菌液转接入摇瓶发酵培养基，培养10h。其中，在适当时间加入诱导剂；适时添加前体氨基酸并于发酵的3、5、7、9、llh取样，检测发酵产物中谷胱甘肽的累积量，检测结果如表I所示。根据表I 的结果，BL21-GSH1、BL21-GSH2、BL21-GSH12 和 E. coli BL21 (DE3)中的L-5-甲基四氢叶酸的累积量，在发酵Ilh时达到最高且以BL21-GSH12效果最好。因此，在下一实施例中，仅选取摇瓶发酵后期累积量最高的BL21-GSH12进行发酵罐发酵。表1BL21-GSH1、BL21-GSH2、BL21-GSH12 和 E. coli BL21 (DE3)谷胱甘肽的累积量随培养时间的变化
权利要求
1.一种谷胱甘肽合成酶系重组质粒，其特征在于，重组质粒包括两个，分别由GSHl和GSH2序列和一段合适的载体片段连接而成，所述GSHl和GSH2序列分别如NCBI上Gene ID为242378250和253978924的序列所示，载体片段为pET28a和pBAD24。
2.如权利要求I所述的重组质粒，其特征在于，所述GSHl和GSH2序列分别置于T7启动子、Lac操纵子之下和araBAD启动子、阿拉伯糖操纵子之下。
3.如权利要求I或2所述的重组质粒，其特征在于，所述两个重组质粒各包括一段抗性基因片段。
4.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述抗性基因片段分别为卡那霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。
5.如权利要求1-4中任一项所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤 A)PCR扩增获得GSHl和GSH2序列； B)将GSHl和GSH2序列分别克隆到合适的表达载体。
6.如权利要求1-3中任一项所述的双表达重组质粒用于转化累积谷胱甘肽的原始细菌株的应用。
7.一种提高谷胱甘肽累积量的生物合成方法，其特征在于，所述方法为，将权力要求1-3中任一项所述的共表达重组质粒转化累积谷胱甘肽原始细菌株，获得重组菌。
8.如权利要求6所述的应用和权利要求7所述的方法，其特征在于，所述累积谷胱甘肽的原始细菌株为大肠杆菌。
9.如权利要求8所述的应用和方法，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，通过发酵培养所述重组菌，并在发酵培养一定时间后，用诱导剂乳糖和阿拉伯糖诱导谷胱甘肽代谢途径中的两个关键酶基因GSHl和GSH2的表达，提高谷胱甘肽的累积量。
全文摘要
本发明提供了一种谷胱甘肽合成酶系重组质粒及其构建方法和应用、一种谷胱甘肽合成酶系的重组质粒及其构建方法和应用、一种累积谷胱甘肽方法。本发明提供的谷胱甘肽合成酶系重组质粒包括GSH1和GSH2序列和两段合适的载体片段；这种方法的原理在于，GSH1与GSH2连接在启动子不同的载体上，通过在不同时间添加诱导剂实现GSH1与GSH2的分步表达而减少反馈抑制；使用本发明提供的方法可以明显的减弱反馈抑制，提高了谷胱甘肽生产量，提高原料利用率，可为进一步研究生物法合成谷胱甘肽建立一个基础模型。除此之外，该方法及思路可以用于其他因反馈抑制限制产量提高的目的产物，为生产有价值的产品提供了新的思路。
文档编号C12N15/70GK102911960SQ20121045021
公开日2013年2月6日 申请日期2012年11月12日 优先权日2012年11月12日
发明者许激扬, 卞筱泓, 赵玉成, 邵飞 申请人:中国药科大学