专利名称：运用核酸恒温扩增技术检测小肠结肠炎耶尔森菌的试剂及其扩增方法
技术领域：
本发明涉及病原体检验技术，具体地说是运用核酸恒温扩增反应来检测小肠结肠炎耶尔森菌的技术。
背景技术：
小肠结肠炎耶尔森菌，属于肠杆菌科耶尔森菌属，是该菌属三种致病性菌之一。小肠结肠炎耶尔森菌是一种肠道病原菌，流行病学特点与假结核耶尔森菌很相似，感染率高于假结核耶尔森菌。该菌可在低温环境下生存，冰箱贮存食物是现代社会发生该菌感染的一个重要传染源。因此能够快速有效的检测小肠结肠炎耶尔森菌对于与之相关的疾病防控具有重要的意义。小肠结肠炎耶尔森菌的检测方法有常规培养和生理生化反应检测等多种方法，与 传统检测手段相比，本发明很好的解决了目前大多数检测技术手段的弊端。首先，无需任何复杂的仪器，只需要一台简单的加热器，如普通的水浴锅或以电、电池为能源的加热器，使得核酸诊断可以前所未有地用于现场诊断。其次，可以加快反应速度，缩短反应时间。第三，易于操作者掌握，对反应条件的要求相对宽松，使得以该技术为基础的产品对操作人员的技能要求不高，这也为核酸试剂的普及创造了条件。
发明内容
针对小肠结肠炎耶尔森菌，本发明克服了现有技术中的缺点，提供一种运用等温扩增技术快速、便捷、低成本的试剂和检测方法。本发明提供了更加快速和低成本通过等温扩增方法检测小肠结肠炎耶尔森菌的方法。本发明是通过以下技术方案实现的(I)设计特异性寡核苷酸引物用于等温扩增技术检测；(2)整合各引物使之不相互干扰。(3)以引物序列组，扩增待测样品模板，进行目的基因的特异性扩增；(4)扩增完毕后可通过使用商业化的核酸恒温扩增检测试纸条对扩怎产物进行检测，阳性结果呈现两条紫红色条带，阴性结果呈现一条紫红色条带。该方法包括应用该方法检测小肠结肠炎耶尔森菌所使用的引物组和与之配套的等温扩增反应条件。其中引物序列如下该引物序列参照GenBank 中的序列 EU29431. I Yersinia enterocoliticasubsp.enterocolitica strain ATCC 9610 中 16S-23S rDNA 基因间序列为基础进行设计。引物SEQ ID NO. I :5’ -GAGGTCAGCGGTTCGASEQ ID NO. 2 :5’ -TGTGGCTGCGAACACACTSEQ ID NO. 3 :5’ -GCGTCGTTGTGCAGTTTTTGTACTGCGGTCGCAAG
SEQ ID NO. 4 :5’ -GCGTCGTTGTGCAGTSEQ ID NO. 5 :5’ -ACAGCAACCGGAGTGAAC。其中序列SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5使用特殊基团标记，扩增产物中包含上述基团，以便同核酸恒温扩增检测试纸条反应。本发明中反应体系中各组分构成比例如下
成分浓度加样量
Bst 酶5U/pLIpL
Bst酶缓冲液-5 μι
SEQ ID NO. I10 μ mol/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 2ΙΟμηιοΙ/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 3:ΙΟμιηοΙ/LO. 8 μ L
SEQ ID NO. 410 μ mol/LO. 8 μ L
SEQ ID NO. 5:ΙΟμηιοΙ/L2μΙ
DNA样品2 μ L
双蒸水8 μ L
总体积20 μ L其中Bst 酶缓冲液的成分为 20mM Tris-HCl, IOmM(NH4) 2S04, IOmM KCl、2mM MgS04、质量百分比 0· I % Triton X-IOOUOmM dNTP，且 pH 为 8· 8。等温扩增程序为63°C 60分钟。扩增完毕后可通过使用商业化的核酸恒温扩增检测试纸条对扩怎产物进行检测，阳性结果呈现两条紫红色条带(分别为检测线和质控线)，阴性结果呈现一条紫红色条带(质控线)。如出现其它结果则表明此次检验失败不能确定样品中是否存在小肠结肠炎耶尔森囷，需重新检验。与现有技术相比，本发明的有益效果是相比传统生理生化检测方法，基于等温扩增的鉴定方法适用于直接从临床样品中扩增靶基因，只需要一次等温扩增反应就能够检测小肠结肠炎耶尔森菌是否存在，大大提高了效率节约了时间。相比较其它PCR方法，本方法制仅需要简单的设备——一个恒温水浴即可，大大提高了性价比节约了成本。等温扩增方法具有检测准确、特异性强、灵敏度高的特点，可以快速、准确地鉴定特异的目的病原体。它通过扩增靶基因，避免了反复培养，节约时间；该鉴定方法不受培养条件和病原体生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确。
图I样品检测结果，样品DNA使用核酸恒温扩增小肠结肠炎耶尔森菌的检测技术检测，扩增完毕后可通过使用商业化的核酸恒温扩增检测试纸条对扩怎产物进行检测，阳性结果呈现两条紫红色条带(分别为检测线和质控线)，阴性结果呈现一条紫红色条带(质控线)，试纸条I为阴性对照，试纸条2为I株小肠结肠炎耶尔森菌标准株扩增产物检测结果，试纸条3和4分别为2株小 肠结肠炎耶尔森菌野生株扩增产物检测结果。
具体实施例方式下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步详细描述。实施例I样本1株小肠结肠炎耶尔森菌标准株的细菌培养物，2株小肠结肠炎耶尔森菌野生株的细菌培养物。I.样品DNA抽提取Iml样品培养物，离心得到沉淀物质在Iml缓冲液中重悬，加入Iml裂解液，沸水浴10分钟，室温下10000转/分钟，离心5分钟，取上清液置-20°c保存。3.等温扩增体系中反应体系中各组分构成比例如下
成分浓度加样量
Bst 酶5υ/μ Ιμ
Bst酶缓冲液-5pL
SEQ ID NO. I:10 μ mol/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 2ΙΟμπιοΙ/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 3:10 μ mol/LO. 8 μ L
SEQ ID NO. 410 μ mol/L0.8 μ L
SEQ ID NO. 5:10 μ mol/L2 μ
DNA样品2 μ L
双蒸水8 μ L
总体积20 μ 其中Bst 酶缓冲液的成分为 20mM Tris-HCl, IOmM(NH4) 2S04, IOmM KCl、2mM MgS04、质量百分比 0· I % Triton X-IOOUOmM dNTP，且 pH 为 8· 8。等温扩增程序为63 °C，60分钟。等温扩增共进行4管检测，其中DNA样品所加入的分别为样品I为阴性对照；
样品2为小肠结肠炎耶尔森菌标准株培养物的DNA样本；样品3和4为小肠结肠炎耶尔森菌野生株培养物的DNA样本。4.被检测样品结果观察扩增完毕后通过使用商业化的核酸恒温扩增检测试纸条对扩怎产物进行检测，阴性对照显示阴性结果，小肠结肠炎耶尔森菌标准株和野生株均显示阳性结果。实施例2样本某待测样品。I.样品DNA抽提某样品怀疑含有小肠结肠炎耶尔森菌，取Iml该样品培养物，离心得到沉淀物质·在Iml缓冲液中重悬，加入Iml裂解液，沸水浴10分钟，室温下10000转/分钟，离心5分钟，取上清液置_20°C保存。3.等温扩增体系中反应体系中各组分构成比例如下
成分浓度加样量
Bst 酶5U/ μ LIpL
Bst酶缓冲液-5μ
SEQ ID NO. I:ΙΟμιηοΙ/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 2ΙΟμηιοΙ/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 3:10 μ mol/LO. 8 μ L
SEQ ID NO. 4ΙΟμιηοΙ/LO. 8 μ L
SEQ ID NO. 5:ΙΟμηιοΙ/L2 μι
DNA样品2 μ L
双蒸水8 μ L
总体积20 μ L其中Bst 酶缓冲液的成分为 20mM Tris-HCl, IOmM(NH4) 2S04, IOmM KCl、2mM MgS04、质量百分比 0· I % Triton X-IOOUOmM dNTP，且 pH 为 8· 8。等温扩增程序为63 °C，60分钟。等温扩增共进行3管检测，其中DNA样品所加入的分别为样品I为阴性对照；样品2为阳性对照，即含小肠结肠炎耶尔森菌标准株的DNA样本；样品3为待测样本。4.被检测样品结果观察扩增完毕后通过使用商业化的核酸恒温扩增检测试纸条对扩怎产物进行检测，阴性对照显示阴性结果，小肠结肠炎耶尔森菌标准株的DNA样本和待测样本的DNA显示阳性结果。6天后，通过常规微生物培养和生化检测证明，所检验的目的样本中含有小肠结肠炎耶尔森菌。核酸恒温扩增检验结果与常规微生物培养和生化检测结果一致。
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。
权利要求
1.一种运用核酸恒温扩增技术检测小肠结肠炎耶尔森菌的试剂及其扩增方法，其特征在于，包括以下五个引物SEQ ID NO. I :5’ -GAGGTCAGCGGTTCGASEQ ID NO. 2 :5’ -TGTGGCTGCGAACACACTSEQ ID NO. 3 :5’ -GCGTCGTTGTGCAGTTTTTGTACTGCGGTCGCAAGSEQ ID NO. 4 :5’ -GCGTCGTTGTGCAGTSEQ ID NO. 5 :5’ -ACAGCAACCGGAGTGAAC。
2.根据权利要求I所述的一种运用核酸恒温扩增技术检测小肠结肠炎耶尔森菌的试剂及其扩增方法，其特征在于，核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下成分浓度加样量Bst 酶5U/ μ LI μ LBst酶缓冲液-5pLSEQ ID NO. I:ΙΟμιηοΙ/L0.2μΙSEQ ID NO. 2:10 μ mol/LO. 2 μ LSEQ ID NO. 3:10 μ mol/LO. 8 μ LSEQ ID NO. 4ΙΟμιηοΙ/LO. 8 μ LSEQ ID NO.510 μ mol/L2 μ LDNA样品2 μ L双蒸水8 μ L思体积20 μ L 其中 Bst 酶缓冲液的成分为 20mM Tris-HCl, IOmM(NH4) 2S04, IOmM KCl、2mM MgS04、质量百分比 0· I % Triton X-IOOUOmM dNTP，且 pH 为 8· 8。
3.根据权利要求I所述的一种运用核酸恒温扩增技术检测小肠结肠炎耶尔森菌的试剂及其扩增方法，其特征在于，核酸扩增程序为63°C，60分钟。
全文摘要
本发明公开了一种运用核酸恒温扩增技术检测小肠结肠炎耶尔森菌的试剂及其扩增方法，设计了五个引物组序列，5’-GAGGTCAGCGGTTCGA；5’-TGTGGCTGCGAACACACT；5’-GCGTCGTTGTGCAGTTTTTGTACTGCGGTCGCAAG；5’-GCGTCGTTGTGCAGT；5’-ACAGCAACCGGAGTGAAC。针对小肠结肠炎耶尔森菌，本发明克服了现有技术中的缺点，提供一种运用核酸恒温扩增技术快速低成本的检测方法。
文档编号C12Q1/04GK102899420SQ20121044899
公开日2013年1月30日 申请日期2012年11月12日 优先权日2012年11月12日
发明者张霞, 郑文杰, 赵良娟, 吴冬雪, 曲鹏, 张宏伟, 刘培, 高旗利 申请人:天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心