于细胞内制造融合蛋白质的方法

专利名称：：于细胞内制造融合蛋白质的方法
技术领域：
：本发明关于一种融合蛋白质的制造方法，且特别是攸关一种于细胞内制造融合蛋白质的方法。
背景技术：
：融合蛋白质(Fusionprotein),是指一种连接有至少二个以上多胜肽的蛋白质，可能保有单一多胜肽原有的生物功能，或是呈现不同于单一多胜肽的生物功能。举例来说，融合有β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)及半乳糖去氢酶(galactosedehydrogenase)的蛋白质,经细胞外实验后,证实其相较于单一酵素具有酵素动力学上的优势(请参阅Ljungcrantz.P.,etal.,Biochem.,1989,28:8786-8792)。又举例来说，融合有海藻糖磷酸合成酶(trehalose-6-phosphatesynthetase)及海藻糖磷酸脂酶(trehalose-6-phosphatephosphatase)的蛋白质,经细胞外实验后,证明其不仅保留单一酵素本身的活性外，更较单一酵素具有酵素动力学上的优势(请参阅SeoH.S.，etal.,Appl.Environ.Microbiol.,2000,66:2484-2490)。再举例来说，甜菜醒去氢酶(betainealdehydedehydrogenase)-胆喊去氧酶(chlolinedehydrogenase)融合蛋白质于大肠杆菌co7i)或烟草OVicotabacum)内表现时，可以提升这些生物体抵抗逆境的能力(请参阅YilmazJ.L.,etal.,Biotechnol.Progs.,2002,18:1176-1182)。融合蛋白质可以自然存在于细胞体内，例如癌症细胞中的bcr-abl融合蛋白质。融合蛋白质也可以有目的地透过人为方式存在于细胞体内，基因工程已提供一般实验流程来实现之，如聚合酶连锁反应(polymerasechainreaction,PCR)、限制酶剪切(enzymedigestion)、核酸接合(DNAligation)、…等等。详细地说,须将二个以上各自编码一个多胜肽的基因片段连接在一起，再送入至细胞体内。接着，于细胞体内表现这些多胜肽而形成融合蛋白质。`就基因工程而言，制备融合蛋白质的方法虽然相当简单，但是融合蛋白质大多属于大分子，使得其在空间上的弹性度及自由度受到阻碍，且彼此易相互干扰而无法折迭，造成融合蛋白质失去生物活性，甚至于细胞体内形成不可溶的包涵体(inclusionbody)。因此，后续须破坏细胞体取得包涵体，再从包涵体得到失活的融合蛋白质，并于适当溶液中使失活的融合蛋白质折迭而复性。但复性过程毕竟系属人为操作的，仍不比细胞体内提供的环境，因此在溶液中折迭的融合蛋白质的生物功能仍然有改善空间。
发明内容自然界中，厌氧微生物演化出一种相当特殊且可以有效分解纤维素的胞器。厌氧微生物在细胞外形成纤维体(celIulosome),纤维体含有一撑架蛋白质(scaffoldingprotein),而撑架蛋白质具有一黏附区域(coherindomain),黏附区域结合至一纤维素水解酶(cellulase)的锚定区域(dockerindomain),藉此容许纤维体成为一酵素复合体(enzymecomplex)而有效地分解纤维素(请参阅DoiR.H.,etal.,NatureRev.Microbiol.,2004，2:541—551)。本发明乃是根据黏附区域结合至锚定区域的特性，而发现二各具有黏附区域及锚定区域的融合蛋白质在同一宿主细胞中被表现，黏附区域及锚定区域不易影响此二融合蛋白质中其它多胜肽的弹性度及自由度，使得此些融合蛋白质可以于宿主细胞内折迭并相互融合，并提供此二融合蛋白质优异的生物功能。因此，在第一方面，本发明揭露一种融合蛋白质的制造方法，其包括下列步骤(a)构筑一编码一锚定区域及一第一目标胜肽的第一核酸分子；(b)构筑一编码一黏附区域及一第二目标胜肽的第二核酸分子；(C)递送第一核酸分子及第二核酸分子至一宿主细胞内；以及(d)培养宿主细胞，以表现一第一融合胜肽及一第二融合胜肽，且第一融合胜肽具有锚定区域及第一目标胜肽，第二融合胜肽具有黏附区域及第二目标胜肽，藉此锚定区域连接至黏附区域，以容许第一融合胜肽及第二融合胜肽相互融合。在第二方面，本发明揭露一种宿主细胞，其包括一第一核酸分子及一第二核酸分子，而第一核酸分子系编码一锚定区域及一第一目标胜肽，第二核酸分子系编码一黏附区域及一第二目标胜肽。图1为质体pETW-A2HCh的图谱，图中简写符号Ap，抗胺苄青霉素基因；T7promoter,T7启动子；AHL,编码aradiobacterB11291AHL的基因；HDT,编码AgrobacteriumradiobacterB11291HDT的基因；ColEl,大肠杆菌的ColEl复制起始点。图2为质体pTH-ChA203的图谱，图中简写符号Km，抗康那霉素基因；T7promoter,T7启动子;AHL，编码Agro0acten·u/αradiobacterB11291AHL的基因；ChBD,编妈AgrobacteriumradiobacterWL-12ChBD的基因；pSC101,大肠杆菌的pSClOl复制起始点。图3为质体pTH-AL203Coh的图谱，图中简写符号Km，抗康那霉素基因；T7promoter,T7启动子;AHL，编码Agro0acten·u/αradiobacterB11291AHL的基因；CohI,编妈Clostridium黏附区域的基因；pSC101,大肠杆菌的pSClOl复制起始点。图4为质体pTac-HDTDoCh的图谱，图中简写符号Ap，抗胺苄青霉素基因；TrxA，编码TrxA的基因；HDT,编码radiobacterB11291HDT的基因；Docl,编码Clostridium锚定区域的基因；ColEl,大肠杆菌的ColEl复制起始点。图5为质体pTac-TrChHDT的图谱，图中简写符号Ap，抗胺苄青霉素基因；Tac，Tac启动子；TrxA,编码TrxA的基因；HDT,编码radiobacterB11291HDT的基因；ChBD，编码circulansWL-12ChBD的基因；ColEl，大肠杆菌的ColEl复制起始点。图6为非原态硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳胶图，以说明重组菌株BL21(DE3)/pETff-A2HCh生产的蛋白质分布；其中，径1:蛋白质标准物；径2:未经诱导的重组菌株生产的可溶性蛋白质；径3:经诱导的重组菌株生产的可溶性蛋白质；径4:未经诱导的重组菌株生产的不可溶性蛋白质；径5:经诱导的重组菌株生产的不可溶性蛋白质；箭头AHL-HDT的融合蛋白质。图7为非原态硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳胶图，以说明重组菌株BAD-5/pTH-ChA203/pTac-TrChHDTh及BAD-5/pTH-AL203Coh/pTac_HDTDoCh生产的蛋白质分布；其中，径1:蛋白质标准物；径2:经诱导的重组菌株BAD-5/pTH-ChA203/pTac-TrChHDTh生产的可溶性蛋白质；径3:经诱导的重组菌株BAD-5/pTH-AL203Coh/pTac-HDTDoCh生产的可溶性蛋白质；径4:经诱导的菌株BAD-5生产的可溶性蛋白质(作为对照组)；箭头由上至下依序为=TrxA-HDT-Docl-ChBD融合蛋白质、TrxA-HDT-ChBD融合蛋白质、AHL-CohI融合蛋白质、AHL-ChBD融合蛋白质。图8(A)为非原态硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳胶图，以说明重组菌株BAD-5/pTH-AL203Coh/pTac-TrChHDT生产的蛋白质与几丁质球吸附的情况；其中，径1:蛋白质标准物；径2:吸附前的细胞萃取液；径3:吸附后的细胞萃取液；径4:经吸附后第I次清洗的清洗液；径5:经吸附后第2次清洗的清洗液；径6:加热分离的吸附蛋白质；箭头由上至下依序为=TrxA-HDT-ChBD融合蛋白质、AHL-CohI融合蛋白质。图8(B)为非原态硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳胶图，以说明重组菌株BAD-5/pTH-AL203Coh/pTac-HDTDoCh生产的蛋白质与几丁质球吸附的情况；其中，径1:蛋白质标准物；径2:吸附前的细胞萃取液；径3:吸附后的细胞萃取液；径4:经吸附后第I次清洗的清洗液；径5:经吸附后第2次清洗的清洗液；径6:加热分离的吸附蛋白质；箭头由上至下依序为=TrxA-HDT-Docl-ChBD融合蛋白质、AHL-CohI融合蛋白质。图9(A)为重组菌株BAD-5/pTH-ChA203/pTac-TrChHDT的D-HPG转化率的结果图；其中，图中数据取自于3次独立实验的平均值及标准差。图9(B)为重组菌株BAD-5/pTH-AL203Coh/pTac-HDTDoCh的D-HPG转化率的结果图；其中，图中数据取自于3次独立实验的平均值及标准差。具体实施例方式迄今针对纤维体的黏附区域及锚定区域的相关研究及应用多着重在纤维体于细胞外的制造，并运用得到的纤维体来进行纤维素的分解，但却未见任何研究文献或专利文献将二各具有黏附区域及锚定区域的融合蛋白质表现于同一细胞体中，更无法了解到对此些融合蛋白质在结构上及生物功能上的影响。经本发明人多年努力与研究，发现编码锚定区域的基因及编码黏附区域的基因送入到同一细胞体后，细胞体表现的二融合蛋白质除了各具有相互连接的锚定区域及黏附区域，使此些融合蛋白质相互结合外，此些融合蛋白质也不会形成不可溶的包涵体。而且，此些融合蛋白质可以在细胞体中折迭，因此后续不须将此些融合蛋白质置于溶液中进行复性，则可使用于不同的领域，如疾病治疗及/或预防、生质材料及/或能源开发、废弃物分解、环境保护、…等等。因此，本发明提供的融合蛋白质的制造方法，含有下列步骤(a)构筑一编码一锚定区域及一第一目标胜肽的第一核酸分子；(b)构筑一编码一黏附区域及一第二目标胜肽的第二核酸分子；(C)递送第一核酸分子及第二核酸分子至一宿主细胞内；以及(d)培养宿主细胞，以表现一第一融合胜肽及一第二融合胜肽，且第一融合胜肽具有锚定区域及第一目标胜肽，第二融合胜肽具有黏附区域及第二目标胜肽，藉此锚定区域连接于黏附区域，以容许第一融合胜肽及第二融合胜肽相互融合。文中单独或组合使用的术语「胜肽」，意谓一种由多个胺基酸组成的聚合物，且包含已知的天然存在胺基酸或人造仿效物(artificialchemicalmimic)。且本文所用的术语「胜肽」可与「多胜肽」、「蛋白质」等术语交换使用。特别指明的是，本文单独或组合使用的术语「目标胜肽」，意谓一种选定胜肽，且选定胜肽具有已知的生物功能，如化合物催化、胞内或胞外讯息传递、抗原辨识、…等等。文中单独或组合使用的术语「核酸」或「核酸分子」，意谓一种由核苷酸组成的聚合物，可呈单股或双股，且包含已知的天然存在核苷酸或人造仿效物。且本文所用的术语「核酸」或「核酸分子」可与「基因片段」、「基因」、「DNA」等术语交换使用。除非另有指明，本
技术领域：
人士应当了解本文列示的核酸序列不限于显示的特定核苷酸序列，亦涵盖其互补序列(complementarysequence)。此外，由于核酸序列中的密码子(由三个核苷酸组成)具有简并性，不同密码子能编码出同一胺基酸，因此针对相同的胜肽，本
技术领域：
人士可透过已知的密码子偏好表(codonusagetable)获得特定序列的简并序列(degenerativesequence)。换句话说,文中列示的核酸序列还涵盖特定序列的简并序列。文中单独或组合使用的术语「宿主细胞」，除了意谓一特定个体的细胞外，还涵盖其继代培养的子代或可能的子代。而所有子代可能在后续培养过程中因突变或环境等因素造成基因修饰，使得子代与母代不一致，但子代仍涵盖于本发明的范围内。且本文所用的术语「宿主细胞」可与「细胞」、「细胞体」、「生物体」等术语交换使用。本发明步骤(a)中的锚定区域可衍生自但不限于下列微生物中的一者Acetivibriocellulolyticus、Bacteroidescellulosolvens、Butyrivibriofibrisolvens、Clostridiumacetobutylicum、Clostridiumcellobioparum、Clostridiumcellulolyticum、Clostridiumcellulovorans、ClostridiumJosuiΛClostridiumpapyrosolvensΛClostridiumthermocellum、Ruminococcusalbus、Ruminococcusflavefaciens^Neocallimastixpatriciarum、OrpinomycesJoyoni1、OrpinomycesPC_2、PiomycesequiΛPiomycesE2。本发明步骤(b)中的黏附区域可衍生自但不限于下列微生物中的一者Acetivibriocellulolyticus、Bacteroidescellulosolvens、Butyrivibriofibrisolvens、Clostridiumacetobutylicum、Clostridiumcellobioparum、Clostridiumcellulolyticum、Clostridiumcellulovorans、ClostridiumJosuiΛClostridiumpapyrosolvensΛClostridiumthermocellum、Ruminococcusalbus、Ruminococcusflavefaciens^Neocallimastixpatriciarum、OrpinomycesJoyoni1、OrpinomycesPC_2、PiomycesequiΛPiomycesE2。本发明步骤(a)及步骤(b)的构筑过程，已于本
技术领域：
的相关研究文献及专利文献中有详细报导，如SambrookJ.,etal.,2001,MolecularCloning:aLaboratoryManual,3rded.。除非另有指明，关于此二步骤的详细说明可参考前述文献。进行本发明步骤(a)及步骤(b)时，此二步骤的顺序并无一定限制。也就是说，先进行步骤(a)，后进行步骤(b);先进行步骤(b)，后进行步骤(a);或是同时进行步骤(a)和步骤(b)均为允许的。依据本发明之一较佳实施例，进行本发明步骤(a)时，可将第一核酸分子植入至一可供宿主细胞表现的载体，而进行本发明步骤(b)时，可将第二核酸分子植入至植有第一核酸分子的载体。为控制第一核酸分子及第二核酸分子的转录，载体更具有一可操作地连接至第一核酸分子及第二核酸分子的启动子。文中使用的词组「可操作地连接」，意谓二基因片段相当接近，且其中一片段足以影响另一片段。于本较佳例中，启动子是位于第一核酸分子及第二核酸分子的5’端的位置。于本较佳例中，启动子可以为组合式启动子(constitutivepromoter)或可诱导性启动子(induciblepromoter)。启动子是依照宿主细胞来决定的,其可衍生自病毒、细菌细胞、酵母菌细胞、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞、动物细胞、昆虫细胞、人类细胞中之一者。来自于细菌细胞的启动子，如iac启动子、T7启动子、T7Al启动子、启动子、ir/7启动子、trc启动子、araBAD启动子或』PePl启动子。来自于植物细胞的启动子，如35SCaMV启动子、肌动蛋白启动子(actinpromoter)或泛素启动子(ubiquitinpromoter)。来自于动物细胞的启动子，如SV40启动子、RSV启动子、CMV启动子或HSV启动子。载体另含有其它表现控制要素，以进一步控制第一核酸分子及第二核酸分子的转录，如一转录起始位置(transcriptionstartsite)、一转录终止位置(transcriptionstopsite)、一核糖体结合位置(ribosomebindingsite)、一RNA剪切位置(RNAsplicingsite)、一聚腺苷酸化位置(polyadenylationsite)及一转译终止位置(translationstopsite)。这些表现控制要素是依照宿主细胞来决定的。载体尚含有一供筛选载体的标记基因(markergene)或报导基因(reportergene)。标记基因是依照宿主细胞来决定的，如真核生物细胞的二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase)基因、抗G418基因或抗新霉素(neomycin)基因、细菌细胞的抗胺节青霉素(ampicilin)基因、抗链霉素(streptomycin)基因或抗康那霉素(kanamycin)基因。报导基因，如绿色突光蛋白质(greenfluorescentprotein)基因、突光素酶(Iuciferase)基因、β-半乳糖苷酶基因或氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicolacetyltransferase)基因。依据本发明的另一较佳实施例，进行本发明步骤(a)时，可将第一核酸分子植入至一可供宿主细胞表现的第一载体，而进行本发明步骤(b)时，可将第二核酸分子植入至一可供宿主细胞表现的第二载体。为控制第一核酸分子及第二核酸分子的转录，第一载体更具有一可操作地连接至第一核酸分子的第一启动子，而第二载体更具有一可操作地连接至第二核酸分子的第二启动子。于本较佳例中，第一启动子是位于第一核酸分子的5’端的位置，而第二启动子是位于第二核酸分子的5’端的位置。于本较佳例中，第一启动子及第二启动子可分别为组合式启动子或可诱导性启动子。第一启动子及第二启动子是依照宿主细胞来决定的，其可衍生自病毒、细菌细胞、酵母菌细胞、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞、动物细胞、昆虫细胞、人类细胞中之一者。来自于细菌细胞的启动子，如iac启动子、T7启动子、T7Al启动子、he启动子、ir/7启动子、ire启动子、araBAO启动子或』PePl启动子。来自于植物细胞的启动子，如35SCaMV启动子、肌动蛋白启动子或泛素启动子。来自于动物细胞的启动子，如SV40启动子、RSV启动子、CMV启动子或HSV启动子。第一载体及第二载体还各自含有其它表现控制要素，以进一步控制第一核酸分子及第二核酸分子的转录，如一转录起始位置、一转录终止位置、一核糖体结合位置、一RNA剪切位置、一聚腺苷酸化位置及一转译终止位置。这些表现控制要素是依照宿主细胞来决定的。第一载体及第二载体另各自含有一供筛选这些载体的标记基因或报导基因。标记基因是依照宿主细胞来决定的，如真核生物细胞的二氢叶酸还原酶基因、抗G418基因或抗新霉素基因、细菌细胞的抗胺苄青霉素基因、抗链霉素基因或抗康那霉素基因。报导基因，如绿色荧光蛋白质基因、荧光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因或氯霉素乙酰转移酶基因。本发明步骤(C)中的宿主细胞可以为原核生物细胞或真核生物细胞。原核生物细胞的例子，可以为但不限于细菌、蓝绿藻或放射菌，其中细菌的代表例为大肠杆菌、枯草杆舊{BacillussubtiIis、舊MiiXactobaciIIussp.)、链霉菌属sp.)或沙门氏伤寒杆菌{Salmonellatyphimurium)真核生物细胞的例子，可以为但不限于真菌细胞、原生动物细胞、植物细胞、动物细胞、昆虫细胞或人类细胞。真菌细胞的代表例为酵母菌细胞，如面包酵母菌或嗜甲醇酵母菌。植物细胞可取自于裸子植物或被子植物。而且植物细胞可分离自上述植物的根、茎、叶或分生组织等部位，并以原生质体或愈合组织的形式培养。昆虫细胞的代表例为果蝇S2细胞或秋行军虫Sf21细胞或Sf9细胞。动物细胞不限于培养过的细胞或活体内的细胞,较佳地为取自于脊椎动物，更佳地为取自于哺乳动物。而且动物细胞可分离自肾脏、肝脏、肺脏、卵巢、乳房、皮肤、骨骼、肌肉或皮肤等器官或组织，其例子可以为CHO、COS、ΒΗΚ、HEK-293、Hela,NIH3T3、VERO、MDCK,MOLT-4、Jurkat、K562或H印G2。一般来说，当宿主细胞为原核生物细胞时，本发明步骤(C)的递送过程称为「转形(transformation)」。本
技术领域：
人士理应了解如何实施转形，如利用碳酸1丐、氯化I丐为媒介、基因枪、噬菌体感染，故不再赘述。—般来说，当宿主细胞为真核生物细胞时，本发明步骤(C)的递送过程称为「转染(transfection)」。本
技术领域：
人士理应了解如何实施转染,如利用微脂体(liposome)为媒介、电穿孔法(electroporation)、微注射法(microinjection)、动、植物病毒感染,故不再赘述。本发明步骤(d)的培养过程，乃为本
技术领域：
人士依选用的宿主细胞使用合适的培养基及培养条件则可轻易实现的。举例来说，当宿主细胞为大肠杆菌时，宿主细胞是培养于LB培养基中，并以摇晃方式置于30°C培养箱中。于本发明揭露范围内，亦提供一种宿主细胞，其包含一编码一锚定区域及一第一目标胜肽的第一核酸分子；以及一编码一黏附区域及一第二目标胜肽的第二核酸分子。特别指明的是，此处提及的宿主细胞、锚定区域及黏附区域系与前述制造方法中所提及者相同，故不再赘述。兹以下述实施例，以进一步例示说明本发明。<实验方法及材料>下述实施例采用的方法主要是参考本
技术领域：
人士熟悉的教科书SambrookJ.，etal.，2001，MolecularCloning:aLaboratoryManual,3rded.。细菌培养液浓度是使用分光光度计(V530，Jasco)测得的，使用的波长为550nm，测得的吸光值记录为0D55(i。总蛋白质浓度是使用蛋白质分析试剂(BioRadCo.)测得的。标的蛋白质浓度是利用影像分析仪(AlphalmagerEP,AlphaInnotechCo.)分析电泳分离的蛋白质测得的。细菌染色体(chromosome)、质体(plasmid)和DNA的纯化是分别使用WizardGenomicDNAPurificationKit(PromegaCo.)、High-SpeedPlasmidMiniKit(GeneaidCo.)及Gel/PCRDNAFragmentsExtractionKit(GeneaidCo.)等商业套组。限制酶是购自于NewEnglandBiolabs及FermentasLifeScience。T4接合酶及PfuDNA聚合酶是购自于PromegaCo.。用于聚合酶连锁反应的引子是委由明欣生物科技公司(台北)及源资生物科技公司(台北)合成的。DNA转殖是采用化学转形法完成的，其详细过程如下从LB固态培养基中选取单一菌落至LB液态培养基，并于适当温度下，以150rpm水平震荡培养12至16小时。将菌液接种到新鲜LB液态培养基，其起始浓度为OD55tl=O.08，并在适当温度下，以150rpm水平震荡培养。直到菌液浓度OD55tl=O.3-0.5，取出4mL的菌液置至无菌试管中，冰浴10分钟，然后以4，OOOrpm离心2分钟并移除上清液。将离心剩下的菌体与2mL的O.1MMgCl2均匀混合后，冰浴5分钟，再以4，OOOrpm离心2分钟并移除上清液。将离心剩余的菌体与1.5mL的O.05MCaCl2均匀混合后，冰浴20分钟，再以4，OOOrpm离心2分钟并移除上清液。加Λ300μL的O.05ΜCaCl2与离心残存的菌体均匀混合后，则制备完成胜任细胞(competentcell)。接着,取2ng/mL的质体与100μL的胜任细胞加入至无菌试管中并混合均勻。冰浴30分钟后，将无菌试管移至42°C恒温水浴槽中2分钟，再冰浴5分钟。最后加入ImL的新鲜LB液态培养基(4°C)至胜任细胞菌液后，置于适当温度中培养2小时，再以4，OOOrpm离心10分钟并移除上清液。将残存的LB液态培养基与离心下来的胜任细胞菌体混合均匀后，吸取适量的胜任细胞菌液，均匀涂布在含有抗生素的LB固态培养基，并将其放置于适当温度的恒温培养箱中，隔夜培养至长出菌落。酵素活性是采用高效率液相层析仪(High-pressureliquidchromatography,HPLC)测得的。AgrobacteriumradiobacterBI1291D型胺甲酸基水解酶(D-carbamoylase,AHL)的活性测试是将样品与反应溶液(最终浓度20mMCpHPG及IOmM磷酸钠缓冲液，PH6.6-6.8)混合，并于40°C中反应30分钟。100°C加热反应混合液10分钟终止反应后，以12，OOOrpm离心10分钟，再取上清液进行HPLC分析。HPLC分析使用的管柱为C18管柱(250mmX4.6mm,BosHypersil),使用的移动相为2mM醋酸铵(ρΗ3·2):甲醇=91:9体积比的溶液，并以波长280nmUV进行讯号侦测。AgrobacteriumradiobacterB11291D型乙内酰酶(D-hydantoinase，HDT)的活性测试与AHL相似，惟其所用的反应溶液为最终浓度10mMHPH,0.1MTrisbuffer,pH8.O及0.5mMMnCl2的溶液。酵素活性定义为每单位酵素活性(U)=产物生成量(μmole)/反应时间(min)。<实施例1:质体pETW_A2HCh的构筑>如图1所示，质体pETW-A2HCh含有T7启动子、受启动子驱动来编码办ro如cteriradiobacterB11291AHL及HDT(AHL-HDT)融合蛋白质的基因片段、大肠杆菌的ColEl复制起始点(replicationorigin)、抗胺节青霉素基因。其构筑流程如下,首先依据美国国家生物科技信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)基因体数据库中radiobacterB11291AHL的核酸序列(登记号U59376)来设计引子顺向弓I子5-tttgtgatatcgctaccaccaccaccggtcaggccaagccaagcttg-3，(SEQIDNO:1);反向引子5，-taacttctagaaggagatatacatatgac-3J(SEQIDNO:2)。顺向引子设计有限制酶^0抓的剪切位置，反向引子设计有油al的剪切位置(如底线所标示者)。以质体pChA203(请参阅ChiangC.J.etal.,J.Agr1.FoodChem.,2008，56:6348-6354)为模板，并使用此二引子进行PCR反应，增幅出一编码AHL的基因片段(约O.96kb)。利用Gel/PCRDNAFragmentsExtractionKit纯化增幅得到的基因片段后，使用限制酶及^PV及尬aI剪切增幅得到的基因片段，再利用Gel/PCRDNAFragmentsExtractionKit回收经剪切的基因片段。另一方面，利用High-SpeedPlasmidMinikit纯化质体pHDT(请参阅ChernJ.T.etal.,J.Biotechnol.,2005,117:267-275)。使用限制酶AcoTPV及处<31剪切质体pHDT后，利用Gel/PCRDNAFragmentsExtractionKit回收经剪切的质体pHDT。利用T4接合酶黏接上述二回收后的基因片段后，以上述「化学转形法」将黏接后的DNA产物送至大肠杆菌DH5α中，而得到质体pETW_A2HCh，其编码AHL-HDT融合蛋白质的基因片段则列示于SEQIDNO:3。<实施例2:质体pTH_ChA203的构筑>如图2所示，质体pTH-ChA203含有T7启动子、受启动子驱动来编码radiobacterB11291奶L及BacilluscirculansWL-12几丁质结合区域(chitinbindingdomain,ChBD)(AHL-ChBD)融合蛋白质的基因片段、大肠杆菌的pSClOl复制起始点、抗康那霉素基因。其构筑流程如下，首先依据美国国家生物科技信息中心基因体数据库中PTHlSKr的核酸序列(登记号AB019603)来设计引子顺向引子5，-taaccagatctgattagaaaaactcatcg-3J(SEQIDNO:5)；反向弓I子5’-agaacctgcagtcagatccttccgtatttagc-3J(SEQIDNO:6)。顺向引子设计有限制酶/^711的剪切位置，反向引子设计有AiI的剪切位置(如底线所标示者)。以质体pTH18Kr为模板，并使用此二引子进行PCR反应，增幅出一有pSClOl复制起始点及抗康那霉素基因的基因片段(约2.5kb)。利用Gel/PCRDNAFragmentsExtractionKit纯化增幅得到的基因片段后，使用限制酶SWIIRPstl剪切增幅得到的基因片段，再利用Gel/PCRDNAFragmentsExtractionKit回收经剪切的基因片段。另一方面，利用High-SpeedPlasmidMinikit纯化质体pChA203。使用限制酶/^711及剪切质体pChA203后，利用Gel/PCRDNAFragmentsExtractionKit回收经剪切的质体pChA203。利用T4接合酶黏接上述二回收后的基因片段后，以上述「化学转形法」将黏接后的DNA产物送至大肠杆菌DH5α中，而得到质体pTH_ChA203，其编码AHL-ChBD融合蛋白质的基因片段则列示于SEQIDNO:7。<实施例3:质体pTH_AL203Coh的构筑>如图3所示，质体pTH-AL203Coh含有T7启动子、受启动子驱动来编码radiobacterB11291AHL及Clostridiumthermocellum黏附区域CohI(AHL-CohI)融合蛋白质的基因片段、大肠杆菌的PSClOl复制起始点、抗康那霉素基因。其构筑流程如下，首先依据美国国家生物科技信息中心基因体数据库中ClostridiumthermocellumcipA基因的核酸序列(登记号X67406)来设计引子顺向引子5，-atcatctc￡agttatgcggccgcaagctttggtg-3>(SEQIDNO:9)；反向引子5，-attagaattcagatctcagccaaatgttcc-3’(SEQIDNO:10)。顺向引子设计有限制酶通Ol的剪切位置，反向引子设计有的剪切位置(如底线所标不者)。利用质体CZo1Sirit/iathermocellumDSM1237(取自DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)染色体为模板,并使用此二引子进行PCR反应，增幅出一编码黏附区域CohI的基因片段(约O.5kb)。利用Gel/PCRDNAFragmentsExtractionKit纯化增幅得到的基因片段后，使用限制酶通οI及及剪切增幅得到的基因片段，再利用Gel/PCRDNAFragmentsExtractionKit回收经剪切的基因片段。另一方面，利用High-SpeedPlasmidMinikit纯化质体pTH_ChA203。使用限制酶ZSoI及及0/1剪切质体pTH_ChA203后，利用Gel/PCRDNAFragmentsExtractionKit回收经剪切的质体pTH-ChA203。利用T4接合酶黏接上述二回收后的基因片段后，以上述「化学转形法」将黏接后的DNA产物送至大肠杆菌DH5α中，而得到质体pTH_AL203Coh，其编码AHL-CohI融合蛋白质的基因片段则列示于SEQIDNO:11。<实施例4:质体pTac-HDTDoCh的构筑>如图4所示，质体pTac-HDTDoCh含有Tac启动子、受启动子驱动来编码硫还原蛋白M(thioredoxin,TrxA)>AgrobacteriumradiobacterB11291HDT>ClostridiumthermocellumJkBacilluscirculansWL-12ChBD(TrxA-HDT-Docl-ChBD)融合蛋白质的基因片段、大肠杆菌的ColEl复制起始点、抗胺苄青霉素基因。其构筑流程如下，首先依据质体pET32a(NovagenCo.)的核酸序列来设计引子顺向弓I子5’-ggtgaataattttatcgctcatctgtatatctccttctagaggg-3>(SEQIDNO:`13)；反向弓I子5，-ccctctagaaggagatatacagatgagcgataaaattattcacc-3>(SEQIDNO:14)。此二引子均设计有突变限制酶的剪切位置(如底线所标示者)。以质体pET32a为模板，并使用QuickChangeSite-DirectedMutagenesisKit(StrategeneCo.)及此二引子进行PCR反应，增幅出一有T7启动子下游第I个剪切位置突变的质体pET32a的基因片段。利用Gel/PCRDNAFragmentsExtractionKit纯化增幅得到的基因片段后，以上述「化学转形法」将纯化后的DNA产物送至大肠杆菌DH5α中，而得到一质体ΡΕΤ32-Ν。接着，使用限制酶通ο及MfcI剪切质体ρΕΤ32-Ν后，利用Gel/PCRDNAFragmentsExtractionKit回收经剪切的质体pET32_N。另一方面，利用High-SpeedPlasmidMinikit纯化质体pChHDT(请参阅ChernJ.T.etal.,J.Biotechnol.,2005，117:267-275)。使用限制酶沿ol及剪切质体pChHDT后，利用Gel/PCRDNAFragmentsExtractionKit回收经剪切的质体pChHDT。利用T4接合酶黏接上述二回收后的基因片段后，以上述「化学转形法」将黏接后的DNA产物送至大肠杆菌DH5ci中，而得到质体pET-TrHDTCh。其次，依据美国国家生物科技信息中心基因体数据库中ClostridiumthermocelIumcipA基因的核酸序列(登记号X67406)来设计引子顺向引子5’_tgtga￡^￡g迎ttagagctcgttcttgtacggcaatgtatc-3’(SEQIDNO:15);反向引子5，-gcatgaagcttaaagtacctggtactccttc-3’(SEQIDNO:16)。顺向引子设计有限制酶通Ol的剪切位置，反向引子设计有的剪切位置(如底线所标示者)。认攝MClostridiumthermocellumDSM1237染色体为模板,并使用此二引子进行PCR反应，增幅出一编码锚定区域Docl的基因片段(约0.23kb)。利用Gel/PCRDNAFragmentsExtractionKit纯化增幅得到的基因片段后,使用限制酶ISoI及//iflt/III剪切增幅得到的基因片段，再利用Gel/PCRDNAFragmentsExtractionKit回收经剪切的基因片段。另一方面，利用High-SpeedPlasmidMinikit纯化质体pET-TrHDTCh。使用限制酶ZSoI及//iflt/III剪切质体pET-TrHDTCh后，利用Gel/PCRDNAFragmentsExtractionKit回收经剪切的质体pET-TrHDTCh。利用T4接合酶黏接上述二回收后的基因片段后，以上述「化学转形法」将黏接后的DNA产物送至大肠杆菌DH5α中，而得到质体pET_TrHDTDo。然后，依据质体pET-TrHDTCh的核酸序列来设计引子顺向引子5，-agatgcttttctgtgactgg-3’(SEQIDNO:17)；反向引子5，-agcatgagctcggcctgaccggtctgaac-3J(SEQIDNO:18)。反向引子设计有5^1的剪切位置(如底线所标示者)。以质体pET-TrHDTCh为模板，并使用此二引子进行PCR反应，增幅出一编码ChBD的基因片段(约1.3kb)。利用Gel/PCRDNAFragmentsExtractionKit纯化增幅得到的基因片段后，使用限制酶feci剪切增幅得到的基因片段，再利用Gel/PCRDNAFragmentsExtractionKit回收经剪切的基因片段。另一方面，利用High-SpeedPlasmidMinikit纯化质体pET-TrHDTDo。使用限制酶剪切质体pET-TrHDTDo后，利用Gel/PCRDNAFragmentsExtractionKit回收经剪切的质体PET-TrHDTDo。利用T4接合酶黏接上述二回收后的基因片段后，以上述「化学转形法」将黏接后的DNA产物送至大肠杆菌DH5α中，而得到质体pET_HDTDoCh。接着，依据质体pJF-Trxfus(请参阅ChaoY.P.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2000,54:348-353)的核酸序列来设计引子顺向引子5，-gaatttOtagacctgtgtgaaattgttatcc-3J(SEQIDNO:19)；反向引子5，-gagtgagatatttatgccag-3’(SEQIDNO:20)。顺向引子设计有油al的剪切位置(如底线所标示者)。以质体PJF-Trxfus为模板，并使用此二引子进行PCR反应，增幅出一有Tac启动子的基因片段(约lkb)。利用Gel/PCRDNAFragmentsExtractionKit纯化增幅得到的基因片段后,使用限制酶ZAaI及如al剪切增幅得到的基因片段，再利用Gel/PCRDNAFragmentsExtractionKit回收经剪切的基因片段。另一方面，利用High-SpeedPlasmidMinikit纯化质体pET32_N。使用限制酶Xbal及Apal剪切质体pET32_N后，利用Gel/PCRDNAFragmentsExtractionKit回收经剪切的质体PET32-N。利用T4接合酶黏接上述二回收后的基因片段后，以上述「化学转形法」将黏接后的DNA产物送至大肠杆菌DH5α中，而得到质体pTac_N。最后，使用限制酶^&<31及/5^1剪切质体口130-1')后,利用661/0DNAFragmentsExtractionKit回收经剪切的质体pTac_N。另一部分，使用限制酶油al及AiI剪切质体pET-HDTDoCh，以去除质体pET-HDTDoCh的T7启动子后，利用Gel/PCRDNAFragmentsExtractionKit回收剪切剩余的基因片段。利用T4接合酶黏接上述二回收后的基因片段后，以上述「化学转形法」将黏接后的DNA产物送至大肠杆菌DH5α中，而得到质体pTac-HDTDoCh，其编码TrxA-HDT-Docl-ChBD融合蛋白质的基因片段则列示于SEQIDNO:21。<实施例5:质体pTac-TrChHDT的构筑>如图5所示，质体pTac-TrChHDT含有Tac启动子、受启动子驱动来编码TrxA、AgrobacteriumradiobacterB11291HDT>BacilluscirculansWL-12ChBD(TrxA-HDT-ChBD)融合蛋白质的基因片段、大肠杆菌的ColEl复制起始点、抗胺苄青霉素基因。其构筑流程如下，使用限制酶RPstl剪切质体pTac-HDTDoCh，以保留质体pTac-HDTDoCh的Tac启动子后，利用Gel/PCRDNAFragmentsExtractionKit回收剪切剩余的基因片段。另一方面，使用限制酶油aIRPstl剪切质体pET-TrHDTCh，以去除质体pET-TrHDTCh的T7启动子后，利用Gel/PCRDNAFragmentsExtractionKit回收剪切剩余的基因片段。利用T4接合酶黏接上述二回收后的基因片段后，以上述「化学转形法」将黏接后的DNA产物送至大肠杆菌DH5α中，而得到质体pTac_TrChHDT，其编码TrxA-HDT-ChBD融合蛋白质的基因片段则列示于SEQIDNO:23。<实施例6:AHL-HDT融合蛋白质的表现>以上述「化学转形法」，将质体pETW-A2HCh送至大肠杆菌BL21(DE3)得到重组菌株BL21(DE3)/pETW-A2HCh。从LB固态培养基选取重组菌株的单一菌落至含有50μg/mL胺苄青霉素的LB培养液(5mL)后，在30°C及150rpm的恒温震荡箱中培养16小时，再接种至新鲜含有50μg/mL胺苄青霉素的LB培养液(25mL)，使得其起始浓度达OD55tl=O.08。接着，重组菌株菌液继续在30°C及150rpm的恒温震荡箱中培养，直到其浓度达OD55tl=O.3，再加A50μMIPTG(Isopropylβ-D-l-thiogalactopyranoside)诱导重组菌株生产蛋白质。当继续培养重组菌株4小时后，收集重组菌株并以0.OlM磷酸钠缓冲液(pH7.5)清洗细菌。最后，将细菌悬浮在ImL的磷酸钠缓冲液中，使得细菌浓度达OD55tl=10，再利用超音波打破细菌，并使用非原态硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳分析生产的蛋白质。如图6所示，IPTG诱导后，重组菌株BL21(DE3)/pETff-A2HCh可大量生产AHL-HDT融合蛋白质，惟其形成不可溶的包涵体(图6的径5)。<实施例7=AHL-ChBD融合蛋白质、TrxA-HDT-ChBD融合蛋白质的表现>以上述「化学转形法」，将质体pTH-ChA203及pTac-TrChHDT同时送至大肠杆菌BAD-5(请参阅WangZ.ff.etal.,J.Agr1.FoodChem.,2011,59:6534-6542)得到重组菌株BAD-5/pTH-ChA203/pTac-TrChHDT。从LB固态培养基选取重组菌株的单一菌落至含有50μg/mL胺节青霉素及50μg/mL康那霉素的LB培养液(5mL)后,在3(TC及150rpm的恒温震荡箱中培养16小时，再接种至新鲜含有50μg/mL胺苄青霉素及50μg/mL康那霉素的LB培养液(25mL)，使得其起始浓度达OD55tl=0.08。接着，重组菌株菌液继续在30°C及150rpm的恒温震荡箱中培养，直到其浓度达OD55tl=0.3，再加入30μML型阿拉伯糖诱导重组菌株生产蛋白质。当继续培养重组菌株4小时后，收集重组菌株并以0.OlM磷酸钠缓冲液(ρΗ7.5)清洗细菌。最后，将细菌悬浮在ImL的磷酸钠缓冲液中，使得细菌浓度达OD55tl=10，再利用超音波打破细菌，并使用非原态硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳分析生产的蛋白质。如图7所示，阿拉伯糖诱导后，重组菌株BAD-5/pTH-ChA203/pTac-TrChHDT可大量生产可溶的AHL-ChBD融合蛋白质、TrxA-HDT-ChBD融合蛋白质(图7的径2)。<实施例8=AHL-CohI融合蛋白质、TrxA-HDT-Docl-ChBD融合蛋白质的表现>以上述「化学转形法」，将质体pTH-AL203Coh及pTac-HDTDoCh同时送至大肠杆菌BAD-5得到重组菌株BAD-5/pTH-AL203Coh/pTac-HDTDoCh。从LB固态培养基选取重组菌株的单一菌落至含有50μg/mL胺节青霉素及50μg/mL康那霉素的LB培养液(5mL)后,在30°C及150rpm的恒温震荡箱中培养16小时，再接种至新鲜含有50μg/mL胺苄青霉素及50μg/mL康那霉素的LB培养液(25mL)，使得其起始浓度达OD55tl=O.08。接着，重组菌株菌液继续在30°C及150rpm的恒温震荡箱中培养，直到其浓度达OD55tl=O.3，再加入30μML型阿拉伯糖诱导重组菌株生产蛋白质。当继续培养重组菌株4小时后，收集重组菌株并以O.OlM磷酸钠缓冲液(ρΗ7.5)清洗细菌。最后，将细菌悬浮在ImL的磷酸钠缓冲液中，使得细菌浓度达OD55tl=10，再利用超音波打破细菌，并使用非原态硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳分析生产的蛋白质。如图7所示，阿拉伯糖诱导后，重组菌株BAD-5/pTH-AL203Coh/pTac-HDTDoCh可大量生产可溶的AHL-ChoI融合蛋白质、TrxA-HDT-Docl-ChBD融合蛋白质(图7的径3)。<实施例9:蛋白质的几丁质吸附分析>以上述「化学转形法」，将质体pTH-AL203Coh及pTac-TrChHDT同时送至大肠杆菌BAD-5得到重组菌株BAD-5/pTH-AL203Coh/pTac-TrChHDT。依实施例7或8的方法，培养重组菌株生产蛋白质。过去咸知circulansWL-12几丁质分解酵素(chitinaseAl)的ChBD与几丁质的结合非常专一且稳定，并可在广泛的pH范围中进行结合(请参阅Hashimotoetal.,J.Bacteriol.,2000,182:3045-3054;及ChernJ.T.etal.,J.Biotechnol.,2005,117:267-275)。本实施例为利用几丁质球吸附融合蛋白质，其操作过程如下所述将离心下来的细菌，以O.OlM磷酸钠缓冲液(pH7.5)清洗细菌二次。将细菌悬浮在ImL的磷酸钠缓冲液中，使得细菌浓度达OD55tl=10，再利用超音波打破细菌，离心并回收上清液，而得到细胞萃取液。另一部分，取O.5g的几丁质球(NewEnglandBiolabs)至1.5mL的离心管内。以ImL的O.OlM磷酸钠缓冲液(pH7.5)清洗几丁质球后，静待几丁质球沉降于离心管底部并移去上清液，重复上述步骤3次。接着，将含有50μg的蛋白质的细胞萃取液加入清洗后的几丁质球中，于4°C下进行吸附反应。反应12小时后，先静待几丁质球沉降于离心管底部，再移除上清液并同时以ImL的O.OlM磷酸钠缓冲液(pH7.5)清洗2次，以洗去未吸附于几丁质球的蛋白质。在吸附于几丁质球的蛋白质中加入2%SDS溶液，并于100°C加热5至10分钟，使吸附的蛋白质与几丁质球分离后，使用非原态硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳分析吸附的蛋白质。如图8(A)所示，于吸附反应后，重组菌株BAD-5/pTH-AL203Coh/pTac-TrChHDT生产的TrxA-HDT-ChBD融合蛋白质残留在细胞萃取液中的量明显变少(径2、3)。表示说TrxA-HDT-ChBD融合蛋白质因有ChBD而可被几丁质球吸附。反过来说，重组菌株BAD-5/pTH-AL203Coh/pTac-TrChHDT生产的AHL-CohI融合蛋白质，于吸附反应前后，其残留在细胞萃取液中的量并无明显改变(径2、3)。表示说AHL-CohI融合蛋白质因未有ChBD，故无法被几丁质球吸附。另外，加热使吸附的蛋白质与几丁质球分离后，仅得到TrxA-HDT-ChBD融合蛋白质(径6)，表示说TrxA-HDT-ChBD融合蛋白质与AHL-CohI融合蛋白质之间并无任何作用力，因此只有TrxA-HDT-ChBD融合蛋白质可被几丁质球吸附。如图8(B)所示，于吸附反应后，重组菌株BAD-5/pTH-AL203Coh/pTac-HDTDoCh生产的AHL-CohI融合蛋白质、TrxA-HDT-Docl-ChBD融合蛋白质残留在细胞萃取液中的量均明显变少(径2、3)。这代表着AHL-CohI融合蛋白质、TrxA-HDT-Docl-ChBD融合蛋白质均可被几丁质球吸附。然而，值得注意的是，AHL-CohI融合蛋白质未含有ChBD,但却可被几丁质球吸附。加热使吸附的蛋白质与几丁质球分离后，得到AHL-CohI融合蛋白质、TrxA-HDT-Doc1-ChBD融合蛋白质(径6)，表示说AHL-CohI融合蛋白质含有的黏附区域CohI以及TrxA-HDT-Docl-ChBD融合蛋白质含有的锚定区域Docl之间存在着结合力，因此透过TrxA-HDT-Docl-ChBD融合蛋白质含有的ChBD被几丁质球吸附，而间接地使AHL-CohI融合蛋白质亦被几丁质球吸附。<实施例10:蛋白质的活性分析>于实施例7的重组菌株BAD-5/pTH-ChA203/pTac-TrChHDT及实施例8的重组菌株BAD-5/pTH-AL203Coh/pTac-HDTDoCh培养完成后，先以4°C离心收集菌体。于使用去离子水将细菌浓度调整至OD55tl=10时，利用超音波打破细菌，再以4°C及12，OOOrpm离心并取上清液，而得到细胞萃取液。以上述「酵素活性」的检测，分别测量AHL及HDT的酵素活性。首先，加入含有5μg的蛋白质的细胞萃取液至ImL的反应液中反应,于反应后，使用高效率液相层析仪分析溶液中的反应物浓度。另一部分，使用非原态硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳分析细胞萃取液中的个别蛋白质，并搭配影像分析仪判定个别蛋白质的AHL及HDT酵素活性。再一部分，取含有15μg的蛋白质的细胞萃取液至ImL的含有20mM对羟基苯海因(DL-hydroxyIphenyIhydantoin,DL-HPH)及O.5mM憐酸钠缓冲液(ρΗ7·5)的反应液中，并于40°C下使细胞萃取液中的AHL及HDT进行酵素串联的全反应，而生成D型对羟苯基甘胺酸(D-HPG)。使用高效率液相层析仪分析溶液中生成的D-HPG浓度(mM)，并将浓度除以反应时间，而获得全反应速率。如表I所示，实施例7生产的AHL-ChBD融合蛋白质、TrxA-HDT-ChBD融合蛋白质各别表现出优于实施例8生产的AHL-CohI融合蛋白质、TrxA-HDT-Docl-ChBD融合蛋白质的HDT活性及AHL活性。但实施例8生产的AHL-CohI融合蛋白质、TrxA-HDT-Docl-ChBD融合蛋白质反而具有高于实施例7生产的AHL-ChBD融合蛋白质、TrxA-HDT-ChBD融合蛋白质1.6倍的全反应速率。这结果表示说，实施例8生产的AHL-CohI融合蛋白质、TrxA-HDT-Docl-ChBD融合蛋白质会透过黏附区域CohI及锚定区域Docl,而互相结合来形成酵素复合体，而造成所谓的「代谢物输送道(metaboIitechanneling)」现象,有效地提升反应速率。表I权利要求1.一种融合蛋白质的制造方法，系包括(a)构筑一编码一锚定区域及一第一目标胜肽的第一核酸分子；(b)构筑一编码一黏附区域及一第二目标胜肽的第二核酸分子；(c)递送该第一核酸分子及该第二核酸分子至一宿主细胞内；以及(d)培养该宿主细胞，以表现一第一融合胜肽及一第二融合胜肽，且该第一融合胜肽具有该锚定区域及该第一目标胜肽，该第二融合胜肽具有该黏附区域及该第二目标胜肽，藉此该锚定区域连接于该黏附区域，以容许该第一融合胜肽及该第二融合胜肽相互融合。2.如权利要求1所述的制造方法，其中该锚定区域系衍生自由下列微生物组成的^且\Acetivibriocellulolyticus、Bacteroidescellulosolvens、Butyrivibriofibrisolvens、Clostridiumacetobutylicum、Clostridiumcellobioparum、Clostridiumcellulolyticum、Clostridiumcellulovorans、ClostridiumJosuiΛClostridiumpapyrosolvensΛClostridiumthermocellum、Ruminococcusalbus、Ruminococcusflavefaciens^Neocallimastixpatriciarum、OrpinomycesJoyoni1、OrpinomycesPC_2、PiomycesequiΛPiomycesE2。3.如权利要求1所述的制造方法，其中该黏附区域系衍生自由下列微生物组成的^且\Acetivibriocellulolyticus、Bacteroidescellulosolvens、Butyrivibriofibrisolvens、Clostridiumacetobutylicum、Clostridiumcellobioparum、Clostridiumcellulolyticum、Clostridiumcellulovorans、ClostridiumJosuiΛClostridiumpapyrosolvensΛClostridiumthermocellum、Ruminococcusalbus、Ruminococcusflavefaciens^Neocallimastixpatriciarum、OrpinomycesJoyoni1、OrpinomycesPC_2、PiomycesequiΛPiomycesE2。4.如权利要求1所述的制造方法，其中该步骤(a)系包括将该第一核酸分子植入至一可供该宿主细胞表现的载体，该步骤(b)系包括将该第二核酸分子植入至该植有第一核酸分子的载体。5.如权利要求4所述的制造方法，其中该载体更具有一可操作地连接至该第一核酸分子及该第二核酸分子的启动子。6.如权利要求4所述的制造方法，其中该载体尚含有一供筛选该载体的标记基因(markergene)或报导基因(reportergene)。7.如权利要求1所述的制造方法，其中该步骤(a)系包括将该第一核酸分子植入至一可供该宿主细胞表现的第一载体，该步骤(b)系包括将该第二核酸分子植入至一可供该宿主细胞表现的第二载体。8.如权利要求7所述的制造方法，其中该第一载体更具有一可操作地连接至该第一核酸分子的第一启动子，该第二载体更具有一可操作地连接至该第二核酸分子的第二启动子。9.如权利要求7所述的制造方法，其中该第一载体及该第二载体还各自含有一供筛选该等载体的标记基因或报导基因。10.如权利要求1所述的制造方法，其中该宿主细胞系为原核生物细胞或真核生物细胞。11.一种宿主细胞，系包括一第一核酸分子，系编码一锚定区域及一第一目标胜肽；以及一第二核酸分子，系编码一黏附区域及一第二目标胜肽。12.如权利要求11所述的宿主细胞，系为原核生物细胞或真核生物细胞。13.如权利要求11所述的宿主细胞，其中该锚定区域系衍生自由下列微生物组成14.如权利要求11所述的宿主细胞，其中该黏附区域系衍生自由下列微生物组成全文摘要本发明涉及一种于细胞内制造融合蛋白质的方法。根据本发明，提出一种融合蛋白质的制造方法，系包括下列步骤构筑一编码一锚定区域及一第一目标胜肽的第一核酸分子；构筑一编码一黏附区域及一第二目标胜肽的第二核酸分子；递送第一核酸分子及第二核酸分子至一宿主细胞内；及培养宿主细胞，以表现一第一融合胜肽及一第二融合胜肽，且第一融合胜肽具有锚定区域及第一目标胜肽，第二融合胜肽具有黏附区域及第二目标胜肽，藉此锚定区域连接于黏附区域，以容许第一融合胜肽及第二融合胜肽相互融合。文档编号C12N15/63GK103045627SQ201210448470公开日2013年4月17日申请日期2012年11月9日优先权日2012年11月9日发明者赵云鹏,姜中人,林莉钧,王祉雯,陈柏庭申请人:逢甲大学