用于鉴定胞内细菌蛋白质的方法

专利名称：用于鉴定胞内细菌蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及一种新的组合方法，该方法能够鉴定以任意分泌途径由胞内细菌分泌的蛋白质。本发明进一步提供了由这些方法鉴定出的蛋白质。已知分泌蛋白质是适于包含于免疫原性组合物中和/或诊断目的的合适候选物。本发明还提供了源自被鉴定的分泌蛋白质的肽表位(T-细胞表位)以及编码所述蛋白质的核酸物质。本发明进一步包括所述蛋白质或其片段的多种应用，诸如药物或诊断应用。
背景技术：
衣原体(chlamydia)是专性胞内细菌，其在真核宿主细胞中繁殖并是重要的人类病原体。衣原体目包括一个含有一个属(衣原体属)的科，该属被分成四个种沙眼衣原体(C.trachomatis)、肺炎衣原体(C.pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)和猫心衣原体(C.pecorum)。
沙眼衣原体的人类病原的血清型被分为导致眼疾的A-C；和通过性传播的和引起尿道炎或并发症如输卵管炎、附睾炎和异位妊娠的D至K；以及引起全身严重感染、性病性淋巴肉芽肿(LGV)的L1至L3。人类病原体肺炎衣原体导致引起支气管炎和肺炎的呼吸道感染，且最近认为与引发动脉粥样硬化有关(Saikku等，1988[1.]，Shor等，1992[2.])。
如果衣原体感染不经治疗可能会发展为慢性疾病并伴有严重并发症如不孕、失明以及可能引起血栓的形成。
由于胞内生长循环持续的衣原体感染可能引起异常免疫应答，其不能清除生物体。许多免疫原性衣原体蛋白质已被考虑作为疫苗候选物，尤其是在沙眼衣原体中免疫显性的表面暴露的蛋白质如主要外膜蛋白质(MOMP)[7.]，还有应激蛋白质如Hsp60[8.]。然而，这些候选物中没有一种在疫苗试验中被证明有效。
对于有限的体液应答和保护性微弱的免疫的一种可能性解释是生物体的胞内性质。因此一种可供选择的方法是寻找能被细胞介导的免疫系统识别的、被证实在主要通过细胞毒T淋巴细胞(CTL)的作用消除衣原体感染的过程中起关键作用的蛋白质(Iguitseme等，1994[9.])。
由于这些分泌蛋白质可以在宿主细胞蛋白质酶体(proteasome)中进行加工并作为MHC-I型抗原被提呈到细胞表面从而具有明显的疫苗靶作用，所以这些分泌蛋白质引起了人们的很大关注(Hess和Kaufmann，1993[45])。有关这方面的一个实例是被耶尔森氏菌感染的细胞，该细胞提呈YopH效应物的表位至MHC限制性细胞毒T淋巴细胞(CTL)(Starnbach & Bevan，1995[14.])。衣原体和宿主细胞之间的相互作用对于细菌在胞内存活和繁殖是必需的。
已经有了针对沙眼衣原体血清型D(Stephens等，1998 [4.])(包含894个预测可读框(ORF))和肺炎衣原体VR1310(包含1073个ORF)(Kalman等，1999[5.])的完整和可检索的衣原体基因组。另外，沙眼衣原体MoPn(Read等，2000[12.])、肺炎衣原体AR39(Read等[12.]和肺炎衣原体J138(Shirai等，2000[13.])的完整基因组是公众能够得到的。从基因组序列可以得知衣原体具有与分泌机制有关的基因，包括几种与源自其它生物体的III型分泌基因具有同源性的基因(Stephens等，1998[4.]和Kalman等，1999[5.])。
候选的分泌的效应蛋白质可能存在于III型分泌亚群(subclusters)中(Subtil等，2000)[10.])。该观点最近通过发现CopN的III型分泌特性得到阐明(Fields & Hackstadt，2000)[11.]。然而，III型分泌蛋白质缺乏可识别的信号肽酶切割位点，而且还没有已确定的由衣原体中的该系统分泌的蛋白质的共有序列，这可能局限于特定的待测生物体。而且，分泌蛋白质可能是定位在基因组中不可预测位点上的功能不同的蛋白质组(Subtil，2000)[10.]。
与被分泌的衣原体效应蛋白质相关的现有知识局限于存在于包括Inc家族的成员(Rockey等，1995)[1 5.][16.]、CopN(Fields &Hackstadt，.2000[11.])和CT529(Fling等，2001)[37.]在内的内含膜中的蛋白质。
已经证实特异于衣原体的CD8+T-细胞在感染过程中出现，意味着衣原体蛋白质暴露给宿主细胞的胞质是提呈MHC I型抗原的先决条件。通过在真核细胞中进行表达和由衣原体特异性T细胞系进行识别已经从基因组文库中鉴定出CT529(Probst)[41]。已经证实CT529含有表位，该表位在小鼠疫苗实验中能够提供抗感染的保护作用。
国际专利申请WO 00/34483中已经记载了通过利用病毒载体进行转染而在真核细胞中表达沙眼衣原体血清型L2的基因组文库并随后利用衣原体特异性T细胞进行筛选来测定含有I型MHC限制性表位的蛋白质(Probst)[41]。通过该方法鉴定出五个阳性克隆，其中一个克隆含有CT529，另一个克隆含有三个可读框而其余三个克隆还没有得到进一步的描述。这种筛选方法的缺点是细菌蛋白质的真核表达不同于细菌表达，这种真核表达的方式改变了蛋白质酶体的加工和作为MHC抗原提呈的机率，而且T细胞克隆的维持和刺激不同于体内状况，以及在常规感染过程中不易接近的克隆识别蛋白质可能产生假阳性。上述专利申请中的其它方法涉及针对体液免疫防御的候选疫苗的鉴定。
在寻找由胞内细菌分泌的蛋白质时，简单的方法是从受感染的宿主细胞中分离出胞质，然后寻找细菌蛋白质。然而，由于衣原体网状体的脆弱性，而使得这种方案不能用于衣原体。另一种方法是通过转座子分析来鉴定致病因子，该致病因子通常是分泌蛋白质。然而，转染衣原体是不可能的。还没有可以预测哪种蛋白质是被分泌的方法，而且编码适于研制疫苗的效应蛋白质的基因可能定位于基因组中的未知位点上。
因此，需要一种可靠的系统，该系统能够以成本经济有效的方式限制候选疫苗的数目而且包括最少的实验步骤。
在[18]中，通过[35S]-蛋氨酸/半胱氨酸标记沙眼衣原体蛋白质并在2D凝胶电泳后进行放射自显影来研究IFN-γ对沙眼衣原体A和L2蛋白质表达的作用。在用沙眼衣原体A感染HeLa细胞培养物的过程中加入的IFN-γ对几种沙眼衣原体A蛋白质产生明显的下调作用，而这种作用对于沙眼衣原体L2不明显。在沙眼衣原体A和L2中都观察到了～30和～40kDa蛋白质的IFN-γ依赖性诱导现象。这些蛋白质的诱导通过向生长培养基加入超生理(super-fysiological)量的L-色氨酸而得到抑制。这表明由IFN-γ介导的对这些沙眼衣原体蛋白质的诱导作用与由IFN-γ介导的色氨酸降解宿主细胞酶吲哆胺2，3双加氧酶的上调有关。与沙眼衣原体L2相比，沙眼衣原体A中的一种IFN诱导的沙眼衣原体蛋白质以比较低的分子量迁移。
在[19]中，上述IFN-γ诱导的沙眼衣原体A和L2蛋白质(Shaw等，1999)被进一步定性。通过制备型2D凝胶利用MALDI-TOF质谱测定法和随后进行的数据库检索将蛋白质确定为沙眼衣原体色氨酸合成酶α(TrpA)和β(TrpB)亚基。所述蛋白质还可以在沙眼衣原体D中由IFN-γ诱导，并且所述诱导通过加入超生理量的L-色氨酸而在三种血清型中得到抑制。与沙眼衣原体D和L2相比，沙眼衣原体A中的TrpA以较低的分子量迁移。通过对来源于这些沙眼衣原体血清型的trpA基因进行分析，表明与沙眼衣原体D和L2TrpA相比，沙眼衣原体A和C TrpA被截短～7.7kDa。在引起沙眼的血清型(沙眼衣原体A，B和C)中色氨酸合成酶的截短或缺失可能会降低色氨酸的合成能力并且使得这些血清型更易受到IFN-γ介导的色氨酸的缺失的影响。这一点可以用来解释人类沙眼衣原体血清型之间致病机理的差别。
在[43]中，研究了宿主蛋白质酶体对前述胞内细菌单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的分泌蛋白质(p60)的降解作用。通常使用的方法是在有或无两种肽醛(peptidealdehude)存在的情况下利用[35S]-蛋氨酸/半胱氨酸标记的脉冲追踪法的基础上进行的，所述两种肽醛是N-乙酰-Leu-Leu-正亮氨酸(LLnL)和(苯氧基羰基)-Leu-Leu-苯丙氨酸(Z-LLF)，其抑制真核蛋白质酶体的蛋白质水解活性。针对p60产生的多克隆抗体被用来从通过蛋白质酶体抑制剂处理的和未处理的经单核细胞增生利斯特氏菌感染的J774细胞的裂解物中免疫沉淀p60。对通过单维(one-dimensional)SDS PAGE分离的免疫沉淀标记p60进行的放射自显影分析表明蛋白质酶体抑制剂能够抑制p60的蛋白质酶体降解作用。通过利用LLnL和Z-LLF进行处理，每个感染细胞上的p60-CTL表位数目减少。这表明p60的蛋白质酶体降解作用与p60-CTL表位的产生之间有关。
在[44]中，记载了防御性免疫机制和针对胞内微生物的细胞免疫应答的一般特性，目的在于研制针对胞内微生物的有效重组疫苗。以牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)BCG和伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)aroA-为重点讨论了开发抗原传递系统的方法。可以对这些无毒力胞内细菌进行遗传改造以便于传递抗原，从而可以作为疫苗免疫识别的靶物。文献作者指出了以分泌蛋白质作为研制疫苗的靶物具有优势是因为这些蛋白质可被加工并提呈给由细胞介导的免疫系统，而细菌仍然可以在宿主细胞中进行复制。
发明简述本发明包括通过新的组合方法鉴定分泌蛋白质。所述组合方法通过从存在于感染细胞中的细菌蛋白质的总蛋白质组(proteome)中减去胞内细菌蛋白质的蛋白质组而构成分泌蛋白质组(secretome)(分泌蛋白质的集合体)。
在有真核蛋白质合成抑制剂存在的情况下通过脉冲标记并随后通过两维电泳和放射自显影对细菌蛋白质进行选择性显示。将纯化的细菌蛋白质的图形(profile)与被感染细胞的总裂解物的蛋白质图形(profile)进行比较，通过先进的质谱测定方法从加载了感染细胞的总裂解物的凝胶中鉴定出存在于差示图像中的蛋白质斑点，分泌蛋白质组。
通过先进的人工神经网络进一步分析鉴定出的分泌蛋白质从而提供预计是有效T细胞表位的肽序列。
而且，选择其更新(turnover)受到宿主细胞蛋白质酶体抑制剂延迟的蛋白质，因为这些蛋白质非常有可能在宿主细胞蛋白质酶体中发生降解并作为MHC I型抗原被提呈到宿主细胞表面。
与鉴定疫苗候选蛋白质和表位的其它方法相比，本发明实现了对候选蛋白质数目的限制，其仅能通过新的组合方法来达到。
本发明基于以下观察结果●从胞内细菌分泌到宿主细胞中的蛋白质将不存在于纯化的细菌中却存在于被感染细胞的完整裂解物中。
●纯化细菌的2D蛋白质图形以及被感染细胞的完整裂解物可以利用细菌蛋白质特殊脉冲标记进行两维电泳而得到显示。
●从存在于宿主细胞中的细菌蛋白质的2D蛋白质图形中减去纯化细菌的2D蛋白质图形能够通过质谱测定方法鉴定出分泌蛋白质。
●由胞内细菌分泌的蛋白质通过宿主细胞蛋白质酶体的加工可能产生能够激活T细胞的MHC I型抗原。
●由于真核蛋白质酶体的抑制剂的加入而延迟更新的分泌蛋白质可能被提呈到宿主细胞表面。这种蛋白质的鉴定通过2D蛋白质图像分析而实现。
●T-细胞表位可通过人工神经网络来预测，能改造成能够识别对I型MHC复合物具有高度亲合力的表位。
本发明使用了下列定义定义分泌蛋白质组(Secretome)很有可能是从胞内细菌分泌出来的蛋白质。
(III型)分泌亚群一组衣原体基因，包括与来源于其它生物体的III型分泌基因具有很大同源性的基因。分泌群的定义是指具有抑制或未知功能的ORF(可读框)的集合体，其定位在四个基因的上游，所述四个基因远离和其它细菌(例如沙门氏菌、志贺氏菌、耶尔森氏菌)的III型分泌蛋白质有关的基因具有已知同源性的任何基因。
蛋白质酶体抑制剂任何能够可逆或不可逆抑制被激活的26S真核蛋白质酶体蛋白质水解活性的化学合成的或天然存在的化合物。本技术领域的技术人员能够得知蛋白质酶体的蛋白质水解活性包括几种不同活性(例如在大的疏水性残基后进行切割的胰凝乳蛋白质酶-样活性，在碱性残基后进行切割的胰蛋白质酶-样活性，在酸性残基后进行切割的后-谷氨酰水解酶活性，优先在支链氨基酸后进行切割的BrAAP，在亚基的小的中性氨基酸后进行切割的SNAAP)。已知抑制蛋白质酶体的几种化合物可以由商业途径得到，并且大都含有细胞可渗透的基于肽的抑制剂(例如肽醛、肽聚乙烯醇砜)。基于肽的抑制剂作为过渡态类似物能够形成一种具有蛋白质酶体活性位点的加合物，然而天然存在的clasto-Lactacystin-β-内酯通过对蛋白质酶体亚基的活性位点进行不可逆修饰而对蛋白质酶体具有抑制作用。这些化合物及其组合物可能被用来有效地抑制蛋白质酶体的功能和I型MHC-抗原的加工(例如MG115，MG132，MG262，PSI，clasto-Lactacystin-β-内酯，环氧菌素(Epoxymycin))。蛋白质酶体抑制剂可在进行脉冲标记或追踪前、过程中或后的衣原体的整个生长周期的任何时间点使用。
宿主细胞宿主细胞是任何真核细胞，该真核细胞可被胞内细菌感染。本领域的技术人员可以得知道包括上皮细胞系(例如HeLa，Hep-2，BHK细胞)或无限增殖单核细胞系，例如U-937在内的许多无限增殖细胞系都是衣原体感染的合适宿主。无限增殖细胞可以由自然发生的癌得到或通过利用携带致癌性基因的病毒转化初级细胞、结果导致细胞的无限分化和生长(例如SV40)得到。宿主细胞的定义还包括初级上皮或内皮哺乳动物细胞系，这些细胞系可由活的哺乳动物得到或通过尸检得到，在体外繁殖一定时间，以及器官细胞培养物。
遗传修饰宿主细胞本领域的技术人员应知晓合适的宿主细胞还包括经遗传修饰能进行过量表达或抑制基因的宿主细胞，所述基因与衣原体疫苗研制有关，例如编码蛋白质酶体亚基的基因或其它编码在I型MHC提呈过程中起重要作用的蛋白质的基因。
蛋白质酶体蛋白质酶体是非溶酶体蛋白质降解的重要酶复合物，是ATP-依赖性蛋白质酶水解途径中的一个必需组分，催化多种限速酶、转录调节剂和重要调节蛋白质的快速降解。在真核生物体内，有必要快速清除非正常蛋白质、凝集的、非折叠的或正常的得自宿主细胞蛋白质以及源于定位在宿主细胞中的胞内细菌体内的蛋白质。高等真核生物体内的蛋白质酶体通过将蛋白质降解成肽而将肽传递到宿主细胞表面来作为被提呈的T-细胞表位而参与MHC I型抗原的加工过程。
脉冲标记标记蛋白质是指在一段时间内(例如0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时)将含有放射性同位素(例如L-[35S]-蛋氨酸，L-[甲基-3H]-蛋氨酸，L[甲基-14C]-蛋氨酸，[35S]-半胱氨酸，[3H]-色氨酸或其组合物)的氨基酸掺入到细菌蛋白质中，在该过程中，采用足够高浓度的真核生物蛋白质合成抑制剂来抑制宿主细胞蛋白质的合成。标记可以在衣原体的整个生长周期内进行。标记培养基必须具有足够的营养从而使得宿主细胞和病原体在被感染细胞生长期间进行生长。在标记过程中可以通过加入环己酰胺或宿主细胞蛋白质合成的其它抑制剂(例如吐根碱)来实现对宿主细胞蛋白质合成的抑制，从而使得放射性氨基酸仅仅被掺入到合成蛋白质的胞内细菌中。在标记期间可以通过向培养基中加入蛋白质降解的细胞-渗透性抑制剂来延长蛋白质的降解。应当注意本发明并不局限于放射性标记的使用。
脉冲追踪蛋白质合成后通过追踪被标记的蛋白质可评估更新时间，例如在标记期间合成的蛋白质量优选地75％以上(例如80％，90％，95％，99％，100％)被降解的时间范围。所述评估通过测定追踪期间前或后的凝胶中的给定蛋白质斑点的光密度来进行，并且显示了蛋白质在被感染细胞中存在的时间长短。通过用不含放射性氨基酸的培养基取代标记培养基以及在标记后的不同时间点回收被感染细胞来进行所述追踪。可以在标记后的不同时期(例如0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、6小时、12小时、24小时、72小时)以及标记后的不同时间点进行追踪以便确定蛋白质在被感染细胞中存在的时间长短。某些成熟状态的蛋白质可以由前肽加工而成，因而在追踪期间发生量积累而不降低。这种情况下，可以在追踪期间中观察到成熟蛋白质降解之前进行积累。蛋白质发生降解的时间范围可以通过在追踪过程中向培养基中加入细胞渗透性蛋白质降解抑制剂而被延长。
裂解缓冲液本发明使用的裂解缓冲液是在进行两维凝胶电泳前用于裂解被感染细胞和使蛋白质增溶的缓冲液。
所述裂解缓冲液含有9M的尿素、4％w/v的3-[(3-胆酰胺丙基)二甲铵]-1-丙磺酸盐(CHAPS；Roche，德国)、40mM的Tris Base、65mM的DTE和2％v/v的Pharmalyte 3-10(Amersham Pharmacia Biotech)。为了富集高分子量的疏水性蛋白质，裂解缓冲液可选地含有7M的尿素、2M的硫尿、4％w/v的3-[(3-胆酰胺丙基)二甲铵]-1-丙磺酸盐(CHAPS；Boehringer Mannheim，德国)，40mM的Tris Base、65mM的二硫赤藓糖醇(DTE)和2％v/v的Pharmalyte 3-10(AmershamPharmacia Biotech)。
已知可通过改变裂解缓冲液来增加某些蛋白质的溶解度(例如硫尿可增加疏水性的和高分子量蛋白质的溶解度)。
分泌的效应蛋白质术语分泌的效应蛋白质是指任何由细菌分泌到宿主细胞胞质或任何胞内细胞器中的蛋白质。分泌的效应蛋白质可能会对宿主/病原体之间的关系产生很大的影响，并由于在宿主细胞胞质中的存在可能被靶向蛋白质酶体并作为MHC I型抗原被提呈到宿主细胞的表面。分泌的效应蛋白质可以由文献中记载的若干种Sec-依赖性或非依赖性系统(例如I型、II型、III型、IV型)进行分泌。
胞内细菌任何在真核宿主细胞(例如衣原体、沙门氏菌、志贺氏菌、利斯特氏菌、军团菌、耶尔森氏菌)中具有感染和繁殖能力的细菌。该定义包括胞内细菌，该胞内细菌是胞内专性的，其含义是它们仅能利用真核宿主细胞存活或繁殖，或者是胞内兼性的，其含义是其既可在胞外存活也可在胞内环境存活。
原体(EB)通过超速离心纯化得到的并通过电子显微术定性为直径约300nm且具有稠核(condensed nucleus)的衣原体细菌的集合。
网状体(RB)通过超速离心纯化得到的并通过电子显微术定性为直径约1000nm且具有标准细菌核的衣原体细菌的集合。
分析凝胶任何加载了显示蛋白质需要量的蛋白质样品的2D-PAGE凝胶。在本文所记载的实施例中用于分析目的的量通常是200.000至300.000个读数/分钟(cpm)或＞100ug的用于染色凝胶的蛋白质(例如银染、考马斯染色)。
显著降低的强度/含量优选大于10％(例如20％、35％、50％、65％、80％、90％、100％)的能够重复可测光密度减少量，所述光密度是对定位于2D-PAGE凝胶上的给定斑点总面积的积分值。
显著增加的强度/含量优选大于10％(例如20％、30％、45％、60％、75％、90％、100％、150％、200％、300％或更高)的能够重复可测光密度增加量，所述光密度是对定位于2D-PAGE凝胶上的给定斑点总面积的积分值。
制备型凝胶一种2D-PAGE凝胶，其上加载了能够通过本文记载的鉴定方法(例如MALDI-MS，ESI-Q-TOF，Edman降解法)之一来进行鉴定特定蛋白质斑点所需量的蛋白质样品。根据所采用的固定pH梯度，通常在用于制备目的的凝胶上加载大于500μg的量。本发明中使用的制备型凝胶的定义包括含有未固定的、利用染色方法(例如银染、考马斯染色)或电印记到PVDF膜上而固定的蛋白质的凝胶。通过将标记蛋白质背景应用到制备型凝胶上，有可能观测到制备型凝胶上的蛋白质，其与非标记蛋白质是分开的。还可以将该凝胶与分析凝胶进行比较从而准确切割目的蛋白质。
候选疫苗基于通过本发明方法获得的结果可能由胞内细菌分泌的蛋白质。分泌蛋白质容易受到宿主细胞蛋白质酶体和由这些蛋白质衍生的肽的作用而发生降解，因此可作为MHC I型抗原被提呈到被感染细胞的表面，从而被T-细胞所识别。这种蛋白质因而会成为研制抗胞内细菌疫苗的明确靶物质。被描述为候选疫苗的蛋白质还可以作为诊断试验的有用成分。
疫苗在本发明中，术语疫苗应以最广泛的含义被理解为一种能够激发获得性免疫应答(体液的或细胞的)的免疫原性组合物。能够激发获得性免疫应答的候选疫苗可以采用可注射的溶液、混悬液或乳液形式被施用于动物或人接受者。作为免疫原性组合物活性成分的候选疫苗在注射给接受者之前可以与药用赋形剂如水、盐水、甘油和乙醇混合。可以采用不同的方式进行注射(例如皮下注射或肌内注射)。候选疫苗可以i)以全长的形式，或者ii)以提供免疫原性片段，例如T-细胞表位的来源形式作为疫苗。已知可以将特异性蛋白质或肽单独或与其它蛋白质或肽组合施用于动物或人接受者并作为疫苗。
而且，可以将编码候选疫苗蛋白质的DNA片段克隆到载体中，然后通过注射将其引入动物或人接受者。所述DNA片段被例如肌肉细胞吸收并在可在真核生物体内有活性的启动子的控制下进行表达。在这种所谓的DNA疫苗中，表达的DNA片段能够刺激免疫系统。
MHC I型抗原主要组织相容性I型抗原，含有与暴露于宿主细胞胞质的蛋白质不同的肽，该肽与内质网内的异二聚的MHC I型分子缀合并被提呈到细胞表面作为T-细胞表位，所述细胞被连接在HLA复合物(人体内)的沟槽(grove)内。大多数的MHC-I型提呈肽与在宿主细胞胞质中通过激活26S-蛋白质酶体而被加工的蛋白质不同。
HLA人白细胞抗原，人主要组织相容性复合物的名称。
T-细胞表位与细胞表面二聚体形式的MHC I型分子结合的短肽，可以被特异性细胞毒T细胞的受体识别，例如通常由8-10个氨基酸组成。
全细胞裂解物直接在裂解缓冲液中回收的、未预先纯化或分离的被感染宿主细胞。已知全细胞的裂解物可以在衣原体生长周期中的任何时间点获得，所述全细胞的裂解物含有存在于被感染细胞中的全部蛋白质的混合物，包括那些来源于细菌的。
纯化的细菌从被感染细胞中纯化的细菌。以衣原体为例，根据回收衣原体的生长周期中的不同时间点，通过密度梯度超离心法可以纯化RB和EB以及中间体形式的衣原体。纯度可以通过电子显微镜检来测定。在本发明中通过在银染2D凝胶上评估高度感染的大量宿主细胞蛋白质(例如肌动蛋白质、β-微管蛋白质、α-微管蛋白质、钙网蛋白质)占凝胶上的所有蛋白质的总光密度的比例而迅速地检测出纯度。
鉴定的蛋白质利用基于质谱或Edman降解法的鉴定方法所鉴定的蛋白质的名称是按照与用于衣原体基因组计划http//socrates.berkeley.edu4231/中得到的基因的命名法相应和相适的命名法进行标示的，所述基因被记载在以下文献中i)Stephens，R.S.，Kalman，S.，Lammel，C.，Fan，J.，Marathe，R.，Aravind，L.，Mitchell，W.，Olinger，L.，Tatusov，R.L.，Zhao，Q.，Koonin，E.V.，Davis，R.W.(1998)Genome sequence of an obligateintracellular pathogen of humansChlamydia trachomatis.Science282754-759ii)Kalman，S.，Mitchell，W.，Marathe，R.，Lammel，C.，Fan，J.，Hyman，R.W.，Olinger，L.，Grimwood，J.，Davis，R.W.，Stephens，R.S(1999).Comparative genomes of Chlamydia pneumoniae and C.trachomatis.Nat Gent.21385-389。
EIISPOT在ELISPOT方法中，在预先包被了抗细胞因子(例如IFN-g，IL-6，TNF-a)-抗体的微滴孔(microtitter wells)中培养在体外经抗原刺激的T-细胞。培养一段时间后，通过加入缀合了酶如辣根过氧化物酶碱性过氧化物酶的第二抗体可以显示在激活的T-细胞周围局部产生了细胞因子。最后通过加入可以被酶转化为有色产物的底物由此显示产生细胞因子的细胞来估测细胞因子的产量。
佐剂佐剂是指一种含有特定免疫原的、在哺乳动物受者体内能够引起免疫应答的乳剂(例如弗氏佐剂)。已经认识到与免疫原一起的佐剂可以添加诸如干燥细菌或细菌产物等成分以便增强在被免疫的哺乳动物体内的免疫应答。或者，还可以将免疫调节物如淋巴因子(例如IFNg，IL12)或聚肌胞苷酸(poly IC)与免疫原和佐剂一起施用。
血清转变响应抗原而形成不同类型的或亚型的抗体。
微量免疫荧光(MIF或微-IF)一种利用免疫荧光显微术测量针对固定化细菌或蛋白质的抗体的检测方法。
免疫原性如果蛋白质或肽被注射到人体或动物体内能够引发适应性免疫应答那么所述蛋白质或肽就是免疫原性的。
附图描述

图1A表示源于全细胞的裂解物的沙眼衣原体D蛋白质的凝胶图实例，所述沙眼衣原体D蛋白质是在感染后(h.p.i.)22-24小时进行了[35S]-标记而且在标记后迅速回收并通过2D-PAGE进行了分离。黑箭头指的是源于纯化的EB(原体)的蛋白质在凝胶上的强度显著降低的蛋白质，所述纯化的EB是在感染后(h.p.i.)22-24小时进行标记的以及感染后72小时进行纯化的。指示斑点(DT1-77)的PI和Mw特性被列在表I当中。
图1B-E表示被鉴定的候选疫苗及其在合成后的不同时间出现在眼衣原体体内的实例，是通过将从图1A中选择的面积放大后显示出来的。通过在整个生长周期至纯化EB的过程中于标记后的不同时间进行追踪来评估蛋白质的更新时间。上面的刻度表示从零点起标记后的时间点；下面的刻度代表从24小时起感染后的小时数。图1BDT1和DT2(CT668)。图1CDT8。图1DDT7(上面的箭头)和DT11(下面的箭头)(两者被确定为CT610)。图1EDT3(下面的箭头，CT783)，DT4(上面的箭头，CT858)。
图2A表示源于全细胞的裂解物的肺炎衣原体VR1310蛋白质的凝胶图实例，所述肺炎衣原体VR1310蛋白质是在感染后(h.p.i.)55-57小时被[35S]-标记的而且在标记后迅速回收并通过2D-PAGE进行了分离。黑箭头指的是在源于EB的蛋白质的凝胶上强度显著降低的蛋白质，该蛋白质是在感染后6、12、24、36、42、48、54、60小时的整个生长周期中以两个小时的周期进行标记的以及感染后72小时进行纯化的。箭头指的是在源于纯EB的蛋白质的凝胶上强度显著降低的蛋白质。指示斑点(CP1-91)的PI和Mw特性被列在表II当中。
图2B表示图2A的部分放大。
图2C表示2D-PAGE分离的EB蛋白质的相应放大图像，其中EB蛋白质按照上述方法进行了标记。图2B和图2C的放大部分给出了两种蛋白质CP63(被确定为CPN1016)和CP65的实例，所述两种蛋白质都存在于全细胞的裂解产物中而不存在于EB中。被圈起来的斑点既存在于EB当中也存在于全细胞的裂解物中并被鉴定为多肽去甲酰酶。
图3A表示用于将DT1号斑点鉴定为假设蛋白质CT668的肽质酶解图谱(peptide mass fingerprint)。虚线箭头表示通过胰蛋白质酶的自身消化而产生的肽。这些峰被用来制作光谱内标。黑箭头表示相当于CT668序列的肽物质。双箭头表示得自人感染蛋白质的肽。
图3B表示利用鉴定软件MS-Fit通过分析由图3A获得的肽物质得到的结果，表明最高的(higest-ranking)沙眼衣原体蛋白质是CT668。
图4A表示由斑点DT1的ESI-Q-TOF MS产生的肽质谱，其中所述斑点DT1含有带双电荷的1744.9Da母离子(parention)(R)KIVDWVSSGEEILNR(A)(黑箭头)，相当于CT668的氨基酸序列。虚线是指由母离子裂解产生的Y-肽离子离子。推测的氨基酸序列以粗体单字母密码表示。
图4B表示由斑点CP63的PSD MALDI MS产生的肽质谱。1919.8Da母离子(K)ELLFGWDLSQQTQQAR(L)被裂解并产生几种展示序列的肽。其中两种肽被例示为质量有别于亮氨酸质量(113Da)的243.35Da b2-离子(EL)和356.34Da b3-离子(ELL)。
图5表示新型沙眼衣原体特异性候选疫苗蛋白质DT8的核苷酸序列和由单字母密码表示的相应氨基酸序列。粗体氨基酸序列带有由ESI-Q-TOF MS获得的序列标记物。
图6表示同时利用一种蛋白质酶体抑制剂MG-132进行的脉冲追踪研究。图6.1加载了沙眼衣原体D蛋白质的2D-凝胶的完整凝胶图，所述沙眼衣原体D蛋白质在感染后的22-24小时进行了标记并在有20μM MG132存在条件下另外追踪4小时。图6A，6B和6C含有沙眼衣原体D蛋白质的局部放大图，该图表明当与采用(追踪的+MG-132)或不采用(追踪的)MG-132进行的追踪研究进行比较时，由于采用MG-132进行处理而使更新时间延长。第一排代表在两小时的标记期间后迅速回收的感染细胞的蛋白质图形(profiles)。表明与加载了没有MG132存在的条件下标记后迅速回收的全细胞裂解物的凝胶相比，在加载了有MG132存在的条件下进行标记和追踪的全细胞裂解物的凝胶上的DT9，DT10和DT11强度有了显著的提高。
图7A表示利用PAb 245的全细胞裂解物的IMB完整凝胶图。A1IMB表示与DT4号斑点和DT48号斑点的反应，DT4号斑点和DT48号斑点分别是CT858的C-端和N-端片段。A2IMB的相应放射性标记背景。
图7B抗YscN(B1)的PAb241以及抗CT668的PAb238的IMB(斑点DT1和DT2)(B4)。IMB的相应放射自显影，表示与B2YscN和B5CT668的共-定位。YscN(B3)和CT668(B6)在分析2D-凝胶上的定位。
图7C表示抗CT610的PAb255的IMB。C12D凝胶印迹的放大图表明PAb255对排列的斑点进行染色，上排代表DT7以及下排代表DT9、10、11和12。C2放大图表明在感染后30小时进行细胞回收前用MG132将被感染细胞处理6小时的效果。注意MG132处理使得DT9、DT10和DT11的量相对于代表DT7一排的量有了明显的增加。C3相应的被标记分析凝胶。C4PAb255的IMB的SDS-PAGE泳道a和c20μg和10μg(分别)的感染后30小时回收的完整被感染细胞裂解产物。泳道b和d10μg和5μg(分别)的完整被感染细胞裂解产物，该完整被感染细胞裂解产物在感染后30小时进行回收前用50μMMG132处理了6小时。
图8表示间接的免疫荧光显微术的检测结果，该结果表明了候选疫苗的亚细胞定位。A和B被沙眼衣原体D感染并在感染后24小时用福尔马林固定的HeLa 229细胞。C被肺炎衣原体感染并在感染后72小时用福尔马林固定的HEp-2细胞。第1排表示Normasky图像。第2排表示与抗沙眼衣原体MOMP的MAb 32.3的反应，该反应是通过采用缀合了GAM IgG抗体的罗丹明进行显示的。第3排表示与特异于待候选疫苗的兔多克隆抗体的反应，该反应是通过采用缀合了GAR IgG抗体的FITCH进行显示的。被研究的候选疫苗是ADT8，BCT858，CCPN1016(肺炎衣原体中的CT858同系物(homologue))。白色单头箭头指向被感染细胞中的衣原体包函体的边缘。空箭头指未感染细胞。注意CPN1016表示与CT858相同的亚细胞定位和分泌特性。
图9表示从沙眼衣原体D中鉴定的候选疫苗实例的基因组定位，所述疫苗包括被鉴定的蛋白质，该蛋白质定位在III型分泌亚簇1、2和3中。
图10表示沙眼衣原体D候选分泌物在2D凝胶图像中的位置，所述候选分泌物得自完整被感染细胞的裂解物，该被感染细胞在感染后22-24小时进行了标记，在相同的时间点进行了RB标记和纯化并在感染后72小时进行了EB纯化。所有凝胶是采用非线性pH3-10Immobiline Drystrips制备的。22-24hpi图1A中所示的来源于完整被感染细胞的裂解物的沙眼衣原体D蛋白质凝胶图的放大图像，所述被感染细胞是在感染后22-24小时进行了[35S]-标记，标记后被迅速回收并通过2D-PAGE进行了分离。
纯化的RB来源于细菌的沙眼衣原体D蛋白质的凝胶图像上的相应区域，所述沙眼衣原体D蛋白质在感染后22-24小时进行了标记以后即刻于感染后24小时被纯化为RB。
纯化的EB细菌蛋白质的凝胶图像上的相应区域，该蛋白质在感染后22-24小时进行了标记并在感染后72小时被纯化为EB。
在排A-G中，分泌候选物DT4，DT48，DT23，DT76，DT77，DT47和DT75被圈起来。
图11显示了肺炎衣原体VR1310候选分泌物在2D-凝胶图像上的位置，所述候选分泌物得自完整被感染细胞的裂解物，所述被感染细胞在感染后55-57小时进标记，纯化的EB、完整被感染细胞的裂解物在感染后34-36小时进行了标记并在相同的时间点进行了RB标记和纯化55-57hpi图2A中所示的得自全细胞裂解物的肺炎衣原体VR1310蛋白质的凝胶图的放大图像，所述细胞在感染后55-57小时进行了[35S]-标记，标记后被迅速回收并利用非线性pH3-10ImmobilineDrystrip通过2D-PAGE进行了分离。
纯化的EB细菌蛋白质凝胶图像上的相应区域(非线性pH3-10Immobiline Drystrip)，所述细菌在整个生长周期即感染后6、12、24、36、42、48、54、60小时中以两个小时的时期进行标记并在感染后72小时被纯化为EB。
34-36hpi得自完整被感染细胞的裂解物的肺炎衣原体VR1310蛋白质的凝胶图像上的相应区域(线性pH4-7Immobiline Drystrip)，所述被感染细胞在感染后34-36小时进行了标记并在标记后被迅速回收。
RB 36hpi得自细菌的肺炎衣原体VR1310蛋白质的凝胶图像上的相应区域(线性pH4-7Immobiline Drystrip)，所述蛋白质在感染后34-36小时进行标记后即刻在感染后36小时被纯化为RB。
在A-F中，分泌候选物CP34、CP37、CP46、CP47、CP52、CP63和CP75被圈起来。
G表示在A-F中不含分泌候选物的区域的原图像上的区域。
发明详述得自全细胞裂解物和纯化的细菌的2D-PAGE蛋白质图形(profile)的比较存在于完整被感染细胞中而不存在于纯化细菌中的蛋白质可能由细菌，例如衣原体来分泌。因此，本发明的初始方法是将得自在生长周期的不同时间点进行了标记的被感染细胞的全细胞裂解物的[35S]-标记的衣原体蛋白质的2D-PAGE蛋白质图形与在相应时间点进行[35S]-标记的纯化细菌的2D-PAGE的蛋白质图形进行比较。该方法提供了数种蛋白质的检测方法，所述蛋白质清晰地出现在全细胞裂解物的蛋白质图形上，而在纯化细菌的蛋白质图形上只能微弱检测到或者检测不到。
对总共约600个通过高分辨率的2D-PAGE(IPG)在感染后22-24小时于全细胞裂解物中显示的蛋白质斑点进行的研究表明其中存在着77种沙眼衣原体D蛋白质，其在原体(EB)中的强度明显减小。类似地，当将感染后55-57小时标记的全细胞裂解物与纯化EB进行比较时，91种蛋白质在肺炎衣原体VR1310中的强度显著减小。被检测和注释的蛋白质具有描述如表I中列出的沙眼衣原体D的DT1-DT77号蛋白质的Mw和pI和表II中列出的肺炎衣原体的CP1-CP91号蛋白质的Mw和pI。
该方法概述了进一步研究所必需的可能的分泌蛋白质。实施例对全细胞裂解物和纯化的EB进行了比较，所述全细胞裂解物和纯化的EB或者在i)与全细胞裂解物进行标记相对应的时间点(沙眼衣原体，图1)或者ii)在整个生长周期中的各个时间点(肺炎衣原体，图2)被标记。
RB的纯化能够鉴别分泌蛋白质与RB-特异性蛋白质。可以将感染细胞的完整裂解物的蛋白质图形与在相同时间点纯化的RB蛋白质图形进行比较以便鉴定出分泌蛋白质。在该方法中，没有检测到假阳性的RB特异性蛋白质。检测在进行研究的时间点合成和分泌的蛋白质。蛋白质也可能在其它时间点合成和分泌。
所述方法还包括对感染后即刻分泌的蛋白质的检测，所述分泌的蛋白质可能在生长周期的前期就被合成了出来。这些蛋白质通过采用在生长周期的前期被标记的EB进行感染、接着对全部细胞裂解产物进行2D-PAGE来观测。在EB分化成RB前的生长周期早期，通过皂甙穿透细胞膜来获得宿主细胞胞质[30，31]。由于此时不会发生来自破坏RB的衣原体蛋白质的污染，所以这仅仅是一种可能。
候选疫苗的鉴定从制备型2D-凝胶切出的候选疫苗蛋白质通过先进的质谱方法鉴定。
被切下的斑点用酶如胰蛋白质酶进行消化，从而产生许多胰蛋白质酶分解的肽。借助MALDI-MS或其它方法，这些肽的质量可以高于百万分之100的精确度(ppm)被确定。利用MS-Fit或Peptidesearch软件将获得的质量与数据库中全部蛋白质的理论上的胰蛋白质酶裂解产物进行比较，从而在统计学基础上对被分析蛋白质进行鉴定。
当蛋白质斑点被从加载了全细胞裂解物的凝胶上切出时，污染宿主细胞蛋白质可能与细菌蛋白质位于相同的位置上，而且作为更复杂的情况，一个斑点可以含有一种以上的细菌蛋白质。为了避免污染物的干扰以便进行清楚的鉴定，如果必要，例如可以采用ESI-Q-TOF或后源衰退(post source decay)(PSD)来获得细菌蛋白质的序列信息。
所述方法包括通过质谱鉴定的蛋白质，如表III中由沙眼衣原体D或肺炎衣原体VR1310所例示(分别是A和B)。
因此，本发明第一方面涉及鉴定胞内细菌分泌的蛋白质的方法，包括下列步骤1)通过胞内细菌感染宿主细胞，2)标记存在于被感染细胞内的胞内细菌，3)制备a)被感染细胞的全细胞裂解物b)从被感染细胞中纯化和裂解的细菌，4)对i)由步骤3a)获得的全细胞裂解物和ii)由步骤3b)获得的纯化和裂解细菌的2D-凝胶电泳蛋白质图形进行比较，5)检测由步骤4)得到的蛋白质斑点，所述蛋白质斑点存在于完整的细胞裂解物中而不存在于纯化的细菌中或者在纯化的细菌中的含量非常低，6)鉴定在步骤5)中选择的斑点中的蛋白质。
候选疫苗的脉冲/追踪分析该方法的目的是检测在宿主细胞中被降解的分泌蛋白质。为了评估鉴定的候选疫苗在宿主细胞内存在的时间，进行了一系列的脉冲/追踪研究。[35S]-标记蛋白质的更新时间通过在标记后对蛋白质进行不同时间的追踪分析在2D-凝胶上进行监控。该更新时间为确定蛋白质的降解速率，以及由此确定所述蛋白质在被感染细胞中存在的时间提供了有价值的信息。
该方法提供了表I中所列举的可能分泌的沙眼衣原体蛋白质的估计更新时间。
因此，本发明的另一方面涉及用于鉴定由胞内细菌分泌的蛋白质的方法，包括下列步骤1)用胞内细菌感染宿主细胞，2)脉冲标记存在于被感染细胞内的胞内细菌，3)接着步骤2)，在进行了不同时间的追踪分析后，制备被感染细胞的全细胞裂解物，4)比较步骤3)制备的不同时间的追踪分析后的全细胞裂解物的2D-凝胶电泳蛋白质图形，5)检测由步骤4)得到的蛋白质斑点，该蛋白质斑点随着步骤3)中的追踪时间的延长其含量也在降低，6)鉴定在步骤5)中选择的斑点中的蛋白质。
结合蛋白质酶体抑制剂的脉冲追踪分析为了限制适于用作疫苗的候选物的数量，本发明包括结合脉冲追踪研究的蛋白质酶体抑制剂方法。这些实验为监控宿主细胞蛋白质酶体对分泌的衣原体蛋白质的更新时间的影响提供了有利的工具。
被提呈到真核细胞表面作为MHC-I型抗原的免疫原性蛋白质必须是通过在多-催化蛋白质复合体，即蛋白质酶体中蛋白质水解而被遍在蛋白质化(abiquitiny-lated)和裂解的。所述蛋白质酶体将免疫原性蛋白质裂解成8-10个氨基酸典型长度的肽。这些肽被转运到ER(内质网)后与异二聚MHC I型分子结合，然后MHC-抗原复合物被转运到细胞表面。在细胞表面，MHC-抗原复合物被细胞毒T-淋巴细胞上的特异性受体所识别(在Rock和Goldberg中进行了评述[6.])。
通过向细胞培养物中加入细胞穿透性蛋白质酶体抑制剂如肽醛，有可能抑制真核蛋白质酶体的活性并抑制MHC I型的提呈(Rock等，1994)[36.]。通过加入蛋白质酶体抑制剂而被延长了更新时间的衣原体蛋白质可从细菌分泌，然后由蛋白质酶体进行加工。另外，本发明的这部分内容能够检测衣原体蛋白质，由于这些衣原体蛋白质被分泌到宿主细胞中后被蛋白质酶迅速降解，所以只有在有蛋白质酶体抑制剂存在的条件下才能被检测到。
本发明包括沙眼衣原体D和肺炎衣原体VR1310候选疫苗，其受蛋白质酶体抑制剂的影响。
蛋白质DT1、DT2、DT3、DT5、DT9、DT10、DT11、DT13、DT14、DT36、DT47、DT59、DT60、DT61、DT62(列于下面的表IV中)是沙眼衣原体D候选疫苗的例子，在追踪分析期间通过加入蛋白质酶体抑制剂来延长这些蛋白质的更新时间。
本发明还提供了纯化RB的方法，在收获之前该RB在标记期间经蛋白质酶体处理。对经蛋白质酶体处理并同时进行了标记的全细胞裂解物与蛋白质酶体抑制剂处理的纯化RB进行比较，进一步说明蛋白质被分泌到宿主细胞胞质中并被蛋白质酶体所降解。另外，这些实验中的宿主细胞系可被遗传改造成能够对基因进行过表达，这在MHCI型限制性T-细胞表位的加工过程中非常重要[38，39，40](Sijts，2000，Van Hall，2000，Shockett，1995)。通过利用这种细胞系更加明确了蛋白质酶体抑制剂的作用。因此本发明还包括商购得到的宿主细胞系的用途，这些宿主细胞系进行了基因遗传改造，与MHC I型抗原的提呈有关。
因此，本发明另一方面涉及用于鉴定由胞内细菌分泌的蛋白质的方法，包括下列步骤1)用胞内细菌感染宿主细胞，2)分别在有和没有蛋白质酶体抑制剂存在的条件下培养宿主细胞，3)标记被感染细胞中的胞内细菌，该被感染细胞分别在有和没有蛋白质酶体抑制剂存在的条件下进行培养，4)制备被感染细胞的全细胞裂解物，5)比较分别在有和没有蛋白质酶体抑制剂存在的条件下进行培养的被感染细胞的全细胞裂解物的2D-凝胶电泳蛋白质图形，6)检测由步骤5)得到的蛋白质斑点，该蛋白质斑点存在于在有蛋白质酶体抑制剂存在下进行培养的全细胞裂解物中，而在无蛋白质酶体抑制剂存在下进行培养的全细胞裂解物中不存在或存在的量明显降低，7)鉴定在步骤6)中选择的斑点中的蛋白质。
多克隆抗体的产生本发明提供了特异于候选疫苗的多克隆抗体。利用例如连接非依赖性克隆(LIC)-系统克隆编码候选疫苗蛋白质的基因。被表达的含有候选疫苗序列的融合蛋白质被用来免疫兔子从而获得含有特异于候选疫苗的多克隆抗体(PAb)的血清。本发明在2D-PAGE免疫印迹中利用Pab以通过共定位来证实所述抗体的正确特异性或者鉴定未知的同种型候选疫苗。本发明提供了通过免疫印迹和共定位来验证/鉴定候选疫苗，如表III所列。本发明借助例如间接免疫荧光显微术利用PAb来测定候选疫苗的亚细胞定位。
因此本发明还提供了上述方法的一种替代方法，该方法还包括下列步骤1)获取抗所述按照上述任何一种方法鉴定的胞内细菌蛋白质的抗，2)利用步骤1)获得的抗体对被细菌感染的细胞的全细胞裂解物进行2D-PAGE免疫印迹，3)测定在步骤2)中进行反应的蛋白质斑点，4)鉴定在步骤3)中选择出的斑点中的蛋白质。
所述四种选择方法的组合也属于本发明的一部分。
在本发明方法的优选技术方案中，胞内细菌的标记是通过放射的方法进行的，如[35S]半胱氨酸，[35S]蛋氨酸，[14C]标记的氨基酸或其组合物。
用于鉴定在选择出的蛋白质斑点中的蛋白质的方法可以基于Edman降解法或任何质谱测定方法，如MALDI TOF MS(Matrix-Assisted Laser Desorption/lonisation Time-Of-Flight MassSpectrometry)，ESI Q-TOF MS(Electrospray lonisation QuadrupIeTime-Of-Flight Mass Spectrometry)、PSD-MALDI MS(Post SourceDecay MALDI Mass Spectrometry)或这些方法的组合。而且，所述蛋白质可以在鉴定前进行化学法裂解，如溴化氰处理或羟胺处理，或者利用任何适当的酶如胰蛋白质酶、slymotrypsin、胰凝乳蛋白质酶或胃蛋白质酶或其组合物进行酶促裂解。
所述胞内细菌可以是兼性胞内细菌或专性胞内细菌，以及源自衣原体属如肺炎衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体或猫心衣原体的细菌，包括这些细菌的任何特异性血清型或菌株尤其受到关注。然而，其它胞内细菌如沙门氏菌、志贺氏菌、耶尔森氏菌或李斯特菌也受到本发明的关注。
本发明使用的宿主细胞可以是本技术领域中已知的普通宿主细胞，诸如无限增殖化细胞系，例如HeLa，Hep2，McCoy或U937，由哺乳动物供体或通过尸解得到的初级细胞系，遗传改造的细胞系，或器官细胞培养物或者甚至其它生长着细菌的细胞。所述宿主细胞可以在被胞内细菌感染之前或期间利用IFN-γ进行处理和/或已被遗传改造成过表达基因或抑制该基因表达，所述基因与衣原体疫苗的研制有关。
当本发明的方法使用了一种或多种蛋白质酶体抑制剂时，任何已知抑制剂如MG132、MG262、MG115、环氧霉素、PSI和clasto-Lactacystin-β-内酯都适合于使用。
本发明的方法尤其适于鉴定蛋白质，该蛋白质的全长形式或其免疫原性片段形式都适于包含在免疫原性组合物中和/或用于诊断目的，尤其是这样的蛋白质，其含有T-细胞表位，作为MHC-I型或II型、更优选的-I型限制性抗原进行提呈的候选物，适于包含在免疫原性组合物中。
因此，本发明的另一个重要方面涉及可由任何所要求的方法进行鉴定的蛋白质或其免疫原性片段，优选的这种蛋白质或其片段是适于包含在免疫原性组合物和/或适于诊断目的。
本发明的蛋白质可以是由沙眼衣原体和肺炎衣原体分泌的蛋白质。这种蛋白质是例如那些分别被鉴定为如表I所示的DT1-77以及如表II所示的CP1-CP91的蛋白质或其免疫原性片段，分别具有表I和表II中所示的pI和Mw值，所测定的pI和Mw值的平均误差为+/-10％。
表I




列出了在感染24小时后可能由全细胞裂解物中含有的沙眼衣原体D分泌的蛋白质，但在EB中显著降低，以及所评估的pi/Mw，+/-10％的平均误差。
表II




列出了在感染55小时后可能由全细胞裂解物中含有的肺炎衣原体分泌的蛋白质，但在EB中显著降低，以及所评估的pI/Mw，+/-10％的平均误差。
本发明更优选的蛋白质是沙眼衣原体蛋白质和肺炎衣原体蛋白质及其免疫原性片段，所述沙眼衣原体蛋白质诸如那些表IIIA中给出的由衣原体基因组计划中的相应基因号确定为CT017(基因名称CT017)、CT044(基因名称ssp)、CT243(基因名称lpxD)、CT263(基因名称CT263)、CT265(基因名称accA)、CT286(基因名称clpC)、CT292(基因名称dut)、CT407(基因名称dksA)、CT446(基因名称euo)、CT460(基因名称SWIB)、CT541(基因名称mip)、CT610(基因名称CT610)、CT650(基因名称recA)、CT655(基因名称kdsA)、CT668(基因名称CT668)、CT691(基因名称CT691)、CT734(基因名称CT734)、CT783(基因名称CT783)、CT858(基因名称CT858)、CT875(基因名称CT875)或ORF5(基因名称ORF5)的蛋白质，或者是蛋白质名称为DT8的蛋白质，所述肺炎衣原体是诸如那些如表IIIB中给出的由相应基因号命名为CPN0152(基因名称CPN0152)、CPN0702、CPN0705(基因名称CPN0705)、CPN0711(基因名称CPN0711)、CPN0998(基因名称ftsH)、CPN0104(基因名称CPN0104)、CPN0495(基因名称aspC)、CPN0684(基因名称parB)，CPN0796(基因名称CPN0796)、CPN0414(基因名称accA)、CPN1016(基因名称CPN1016)、CPN1040(基因名称CPN1040)、CPN0079(基因名称R110)、CPN0534(基因名称dksA)、CPN0619(基因名称ndk)、CPN0711(基因名称CPN0711)、CPN0628(基因名称rs13)、CPN0926(基因名称CPN0926)、CPN1063(基因名称tpiS)或CPN0302(基因名称IpxD)的蛋白质。
表IIIA


表IIIB


列出了鉴定的A沙眼衣原体D和B肺炎衣原体候选疫苗的实例。MMALDI-MS，QESI-Q-TOFMS，PPSD-MALDI MS，I蛋白质印迹(Western blotting)。
*DT8代表由新型可读框编码的表达蛋白质，其没有在沙眼衣原体D基因组中发现。
图10中所示的蛋白质DT4、DT23、DT47、DT48、DT75、DT76和DT 77以及图11中所示的CP34、CP37、CP46、CP47、CP52、CP63、和CP75是特别相关的。
本发明的其它优选蛋白质是沙眼衣原体蛋白质，该蛋白质是在蛋白质酶体抑制剂存在的条件下具有延长的更新时间的蛋白质，其特征在于具有表IV中给出的DT1、DT2、DT3、DT5、DT9、DT10、DT11、DT13、DT14、DT17、DT47、DT59、DT60，DT61或DT62中的一种蛋白质的pI和Mw，平均误差为+/-10％。由蛋白质酶体抑制剂以同样方式进行调节的肺炎衣原体蛋白质也是本发明的优选技术方案。
表IV

列出了鉴定的沙眼衣原体D蛋白质的实例，在标记和追踪分析过程中，该蛋白质通过采用不同的蛋白质酶体抑制剂进行处理使得更新时间被延长。
本发明的另一个优选的蛋白质是沙眼衣原体多肽DT8，该多肽含有在权利要求中所定义的序列SEQ ID NO1及其免疫原性片段。
在本发明这方面的其它优选技术方案中，所述蛋白质与本发明的蛋白质或其片段具有至少40％的序列相同性、优选地至少60％、更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、更进一步优选地90％、最优选地至少95％的序列相同性，或者所述蛋白质含有本发明蛋白质的至少7个连续氨基酸。
本发明的另一个方面涉及核酸化合物，该化合物含有编码本发明的蛋白质或其免疫原性片段的序列。
优选的核酸化合物是一种含有编码多肽TD8的序列(SEQ ID NO2)的核酸化合物，所述多肽TD8含有序列SEQ ID NO1。
本发明的另一方面涉及含有本发明核酸化合物的载体以及用该载体转化或转染的宿主细胞。
本发明还提供了本发明的蛋白质或其免疫原性片段用于生产抗所述蛋白质的抗体的用途，制备抗胞内细菌的抗体的方法以及可由这种方法获得的抗体，其中本发明的蛋白质或其免疫原性片段被施用于生产动物体内，然后从该动物体内纯化出所述的抗体。
而且，另一方面本发明提供了含有本发明蛋白质或其片段、本发明的抗体或核酸化合物的药物或诊断组合物，以及所述蛋白质或其片段、所述抗体或核酸化合物用于制备诊断试剂的用途。
候选疫苗上的T-细胞表位的鉴定本发明提供了T-细胞表位，该表位可被表面表达为MHC I型抗原并且具有刺激T-细胞的作用，如通过基于计算机的方法由本发明鉴定的蛋白质所预测的，或者是通过进一步由实施例记载的分析试验验证的。
因此，本发明的另一个重要方面涉及可能被表面表达为MHC I型抗原的且具有T-细胞刺激作用的肽表位。根据本发明，提供了一种用于鉴定胞内细菌分泌蛋白质上的T-细胞表位的方法，该方法包括这样的步骤，诸如对经本发明的方法鉴定的蛋白质或其免疫原性片段以及肽表位进行计算机预测、MHC型分子结合试验和/或ELISPOT试验。作为本发明的一部分还提供了核酸化合物，该化合物含有编码所述肽表位的序列，以及含有所述核酸化合物的载体和由所述载体转化的宿主细胞。
本发明的优选肽表位含有4至25个连续氨基酸、优选地6至15个、甚至更优选地7至10个本发明蛋白质的氨基酸。
在本发明的一个更优选的技术方案中，所述表位含有沙眼衣原体或肺炎衣原体蛋白质的7至10个连续氨基酸。
本发明的另一个优选肽表位是一种含有包含序列SEQ ID NO1的多肽的4至25个连续氨基酸、更优选地6至15个和最优选地7至10个氨基酸的表位。
含有选自序列SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.45的氨基酸序列的沙眼衣原体肽表位，含有选自序列SEQ ID NO.46-SEQ ID NO.121的氨基酸序列的肺炎衣原体肽表位，含有选自序列SEQ ID NO.122-SEQ IDNO.148的氨基酸序列的肺炎衣原体肽表位以及含有选自序列SEQ IDNO.149-SEQ ID NO.194的氨基酸序列的沙眼衣原体肽表位是特别相关的。本发明鉴定的表位在表V-VIII中进一步的性质描述。
表V


预测的鉴定的沙眼衣原体蛋白质的表位表VI



预测的鉴定的肺炎衣原体蛋白质的表位表VII

预测的鉴定的沙眼衣原体蛋白质的肺炎衣原体同系物的表位表VIII


预测的鉴定的肺炎衣原体蛋白质的沙眼衣原体同系物的表位肽表位可以作为融合蛋白质的一部分或与载体部分进行偶联。
一种被通常用来预测与MHC结合的表位的方法包括基序检索(motifsearch)。最复杂精确的基序检索利用了代表MHC延长基序的全部矩阵(entive matrices)。尽管序列非依赖性组合特异性作为平均考虑因素可能是正确的，但是对个体肽而言显然是不正确的。而且，晶体结构已经表明一个亚位点上的相互作用可以影响其它亚位点上的相互作用。
人造神经网络(ANN)尤其适合于处理和识别任何非线性序列信息。信息可被进行加工处理而后被分配到配有输入层、隐藏层和输出层的计算机系统当中，所述各层通过加权关系被连接在一个特定结构中。这种ANN可被处理成能够识别与特定输出信号(即MHC结合)有关的输入信号(肽)。一旦处理后，该网络应当识别适于结合的复杂肽模式。利用ANN方法，处理装置的大小和质量成了一个重要因素。这对于HLA尤其重要，因为只有约1％的一套随机肽才能与任何给定的HLA结合。
因此，如果对随机肽进行筛选，为了产生少至100个结合肽将需要合成并测试约10000个肽。即使对于处理装置中数目适当结合物，这也是一个耗费很大财力和劳力的方法，而且这个方法需要对每个待测HLA进行重复。
因此，与本发明有关的矩阵预测法被用来扫描SWISS-PROT(http//www.expasy.ch/sprot/)数据库从而找到潜在高亲合力结合表位。在生物化学结合试验中已经合成和测试了大量的这种表位。正如所预计的，获得了较高比例的高亲合力结合物(binder)(约80％)。这些数据接下来被用来处理ANN。
对于被检测的四种MHC I型分子中的四种，ANN比矩阵-驱动预测法表现得更好。该预测法形成一种模式，可以预测结合IC50的实际值而不是任意分类成“结合物”与“非结合物”。实际上，已有可能在一个大范围内预测结合物从而识别出高亲合力的结合物以及低亲合力和非结合物。
本发明进一步包括本发明的肽表位用于制备疫苗的用途，以及含有本发明的肽表位的疫苗，该疫苗选择性地含有可接受的赋形剂。
本发明的另一方面涉及本发明的蛋白质、本发明的抗体、本发明的核酸化合物或本发明的肽表位在制备用于治疗或预防由胞内细菌引起的感染如衣原体感染的药物组合物中的用途，或者在制备用于检测是否存在胞内细菌如衣原体的诊断试剂或针对胞内细菌产生的抗体中的用途。
本发明进一步提供了在人体内诱导免疫应答的方法，包括对所述人体施用免疫学有效量的本发明的蛋白质、抗体、核酸化合物或肽表位，特别提供了这样一种用于治疗或预防胞内细菌如肺炎衣原体或沙眼衣原体引起人体感染的方法。
最后，本发明提供了分别生产本发明的蛋白质或其片段或者本发明的肽表位的方法，所述方法包括用含有编码所述蛋白质或肽表位的核酸化合物的载体转化、转染感染宿主细胞，在所述宿主细胞能够表达所述蛋白质或其片段的条件下培养宿主细胞。
本发明通过下列非限制性实施例得到进一步说明。
实施例实施例1哺乳动物细胞培养物的感染按照[19.]和[17.]中已经记载的方法，用肺炎衣原体VR1310、沙眼衣原体血清型A(HAR-13)、D(UW-3/Cx)或L2.(434/Bu)(ATCC)的一包函体形成单位(IFU)感染半-汇合的HeLa、HEp-2或McCoy(ATCC，Rockville，MD，USA)细胞单层。用于沙眼衣原体A和D的感染培养基由RPMI 1640、25mM HEPES、10％FCS、1％w/v谷氨酰胺、10mg/ml庆大霉素组成，用于沙眼衣原体L2的感染培养基由RPMI 1640、25mM HEPES、5％FCS、1％w/v谷氨酰胺、10mg/ml庆大霉素组成。
实施例2脉冲标记/追踪分析为了将衣原体蛋白质标记两个小时的时间，按照上述方法(Shaw等，1999，2000)[18.][19.]，在含有RPMI 1640、10mg/ml庆大霉素、40μg/ml放线菌酮、100μCi/ml[35S]-蛋氨酸/半胱氨酸(Promix，Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)的培养基中培养被感染细胞。标记后，通过用普通培养基冲洗两次后将标记培养基换成普通培养基，并在标记后的不同时间点收集被感染细胞。类似地，通过将衣原体标记两小时后培养到感染后的72小时来获得标记的EB蛋白质。然后收集标记的EB，并利用两个连续步骤的密度梯度超速离心对所述EB进行纯化，所述密度梯度超速离心基本上按照用于沙眼衣原体(Schacter and Wyrick，1994)[22.]和肺炎衣原体(Knudsen et al.1999[17.])的密度梯度超速离心方法来进行。EB制剂和脉冲追踪制剂中的蛋白质以与源自完整裂解物制剂中的蛋白质相同的时间间隔进行标记，从而有利于正确进行2D-PAGE蛋白质图形的比较。
实施例3样品的制备[35S]-标记后，细胞用PBS冲洗两次后被溶解在标准裂解缓冲液中，该缓冲液含9M尿素、4％w/v 3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐(CHAPS；Roche，Germany)、40mM Tris Base、65mM DTE和Pharmalyte 3-10(Amersham Pharmacia Biotech)。为了富集高分子量的疏水性的蛋白质，采用7M尿素、2M硫脲、4％w/v 3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐(CHAPS；Boehringer Mannheim，德国)、40mM Tris Base、65mM二硫赤藓糖醇(DTE)和2％v/vPharmalyte 3-10(Amersham Pharmacia Biotech)，基本上按照(Harder等.1999[23.])所述的进行。超声处理含完整细裂解物的样品或纯化的EB，并以10000×g离心10分钟。将样品贮存在-70℃下直至使用。
实施例4衣原体蛋白质的分离通过基本上如(Shaw et al.，1999，2000)[18.][19.]中所述的双向凝胶电泳分离源自全细胞裂解物和纯化的EB的衣原体蛋白质。
为了进行第一个方向上的等电聚焦，通过IPGphorTm将18cm长的pH3-10NL(非线性)、4-7L(线性)或6-11(线性)固定的pH-梯度干条带(Amersham Pharmacia Biotech)用每分钟200.00个读数的样品量(cpm)标记的蛋白质(在350μl裂解缓冲液中)20℃下反复溶胀(reswelled)12小时。本发明使用的其它条带包括超窄IPG条带。该条带如Table IX所述。如果必要，这使得我们聚焦在含有目的蛋白质的特定pH间隔上。当利用3-10NL、4-7L和6-11L干条带时20℃下进行等电聚焦的电压程序如下300V下1小时，300-500V下2小时(线性增加)，1000V下1小时，2000V下1小时，3500V下3小时和5000V下24小时。
表IX

列出了本发明使用的商购IPG干条带的实例进行了第一个方向的电泳后，将干条带在含有6M尿素、30％v/v甘油、2％w/v DTE、2％w/v SDS、0.05M Tris-Hci pH6.8的缓冲液中平衡15分钟。然后所述条带在其中的DTE被2.5％w/v碘乙酰胺取代了的缓冲液中再平衡15分钟。为了进行第二个方向的电泳，用Protean II xi Multicell系统(Bio-Rad，Richmond，CA，USA)来在9-16％线性梯度SDS-PAGE凝胶(18cm×20cm×1mm)上分离蛋白质。将分析凝胶在含有10％醋酸和25％2-丙醇的溶液中固定30分钟并用AmpIlfy(Amersham Pharmacia Biotech)处理30分钟。于-70下℃经Kodak Biomax-MR胶片(Amersham Pharmacia Biotech)曝光8-10天后，通过放射自显影法显示被标记的蛋白质。
图1A是感染后22-24小时标记的沙眼衣原体D蛋白质的高分辨率分析3-10 IPG 2D-凝胶(使用了标准的裂解缓冲液)的放射自显影的实例。图2A是感染后55-57小时标记的肺炎衣原体蛋白质的3-10IPG2D-凝胶(使用了含硫脲的裂解缓冲液)的放射自显影的实例。如通过Melanie II软件所估计的一样，在每块凝胶上可总共显示约600个蛋白质斑点。
为了制备用于质谱分析的样品，用500-1000μg的全细胞裂解物进行2D-凝胶电泳。为了在X-射线胶片上显示制备凝胶上的蛋白质，2×106cpm的[35S]-蛋白质标记的蛋白质在同样的凝胶上跑胶，所述[35S]-蛋白质标记的蛋白质来源于与未标记样品平行培养的细胞。用ddH2O将制备型凝胶冲洗10分钟并干燥成不固定形式。用放射性墨来在凝胶侧面上作标记，以便在曝光后能够对干燥凝胶与相应的X-射线胶片进行准确的比较。从至少三块相同的凝胶上切下目的蛋白质并合并在一起。如果宿主细胞污染物是质谱鉴定当中存在的一个问题，使用窄或超窄干条带(表IX)的凝胶来增加分离距离。
实施例5利用MAIDI MS、ESI-Q-TOF MS、PSD MAIDI MS和Edman降解法鉴定候选疫苗用胰蛋白质酶对全细胞裂解产物的制备型凝胶上的代表候选疫苗的蛋白质斑点进行凝胶内消化。得到的肽利用由Poros R2材料组成的反相柱(Gobom等，1999[20.])或珠子(Gevaert等，1997[21.])进行纯化。随后利用以电子模式操作的Bruker REFLEX MALDI飞行时间(timeof flight)质谱(Bruker-Daltonik，GmbH，Bremen，德国)对样品进行分析。通过已经记载的肽作图法(Schevchenko 1996[24.])对所得物质和通过理论胰蛋白质酶裂解数据库中的蛋白质而产生的肽物质进行比较。
利用MALDI-MS将DT1鉴定为CT668的实例如图3所示。图3A表示通过MALDI质谱获得的肽质酶解图谱。利用Prospector软件MS-Fit对所获得的物质和数据库中的所有蛋白质的理论胰蛋白质酶裂解产物进行比较。如果将检索限制在与凝胶上发现的蛋白质接近pI/Mw范围，最高的(higest-ranking)蛋白质是CT668(图3B)。然而，宿主细胞的蛋白质有时存在于全细胞裂解物的凝胶上的斑点中，鉴定可能是正确的。因此，如果必要，采用串联质谱和后源衰退(post sourcedecay)(PSD)分析法来验证所述结果(Mann和Wilm的评述，1995[25.]，Gevaert，1997[21.])。
利用Electrospray Ionization Quadrupie Time-Of-Flight(ESI-QTOF)质谱(Micromass，Manchester，UK)对由凝胶内消化产生的肽进行串联质谱分析。利用该方法，可以从样品中分离出单离子化的肽。通过与空气进行碰撞裂解该母离子产生了几种新离子，并且这几种新离子被记录在新肽物质的酶解图谱上。这些新离子在大小上只差一个氨基酸，因此提供了原始肽的详细氨基酸序列(Mann和Wilm，1995)[25.]。
图4A表示由DT1裂解的肽母离子的实例，利用BLAST或MS Tag检索数据库发现得到的序列与CT668的片段相对应。从CT668样品中还鉴定出由人孕酮结合蛋白质产生的序列标记。
如果将检索限定到人蛋白质，还可在MALDI MS肽物质酶解图谱(双箭头，图3A)中检测到由该蛋白质得到的肽。这表明含有一种以上蛋白质的待定斑点能够通过ESI-Q-TOF得到准确的鉴定，因而证实了存在疑问的MALDI MS鉴定。
本发明使用的另一种证实MALDI的方法是PSD。PSD利用了离子化后进行亚稳态衰变的肽，即意味着具有相同速率的肽片段具有不同的质量，因而具有不同的动能。动能方面的差异可通过在磁场中反射片段来决定。高能片段比低能片段穿透磁场更深因而被延时。正如主要发生在肽键上的裂解一样，由单肽的分离得到的图谱可被用来推测肽序列标记物(PST)的氨基酸序列(Mann等，1993)[28.]。PST可与蛋白质数据库进行对比，因而能够鉴定出从中产生的蛋白质(Wilkins等，1996 [27.])。
通过PSD MALDI MS将CP63号斑点鉴定为CPN1016的实例示于图4B。在PSD图谱中总共观察到的36种物质中，其中16种在一个质量单位范围内与由理论裂解具有1919.80Da母离子序列(R)ELLFGWDLSQQTQQAR(L)的肽产生的物质相当，即相当于肺炎衣原体的CPN1016蛋白质。
利用质谱法，提供了沙眼衣原体D(表IIIA)和肺炎衣原体(表IIIb)候选疫苗的鉴定实例。通过电泳测定的Mw和Pi值具有+/-10％的平均误差。
CT858具有67kDa的理论Mw，因此表明被鉴定的蛋白质是大分子蛋白质的加工片段。实际上，通过对DT4进行ESI-Q-TOF分析得到的全部三种肽定位在所述蛋白质的C-端部分。
另一个处于凝胶碱性区域中的斑点DT48也含有CT858。所有将DT48鉴定为CT858的肽相当于所述蛋白质的N-端部分，表明DT48代表CT858的N-端片段。
通过MALDI MS和Edman降解法在沙眼衣原体D和L2中由EB鉴定出CT610。然而，与全细胞裂解物相比，该蛋白质在EB中明显减少，因而仍被考虑用作候选疫苗。通过Edman降解法从沙眼衣原体L2 CT610中鉴定出CT610。所述N-端被测定为MNFLDQ，其不同于由衣原体基因组工程预测出的MMEVFMNFLDQ序列(Stephens等，1998b)[35.]。
在由ESI TOF MS产生的四种序列标记物的基础上鉴定出DT8。这些序列不与沙眼衣原体D基因组中的任何预测可读框相对应[35.]。然而，通过利用BLAST检索所有6个可读框中的衣原体基因组，可以产生与四种序列标记相当匹配的配对物。对编码所述肽的DNA序列及其周围序列的分析结果表明包含核糖体结合位点的新型可读框含有一种7.2kDa蛋白质。被翻译的DT8的DNA序列如图5所示。这一发现说明本发明采用的质谱方法如何识别潜在的编码候选疫苗的重要的ORF，该ORF在大的基因组测序计划中可能被忽略。
来源于肺炎衣原体的斑点CP63被确认是CPN1016的N-端片段，CT858的肺炎衣原体同系物(图2B和C，表IIIB)，表明这些蛋白质在衣原体的两个种中进行了加工。
下列实施例显示了对被鉴定蛋白质实例的特性进行更加详细的研究。
实施例6感染细胞的全部裂解物与纯化的RB的比较按照实施例2所述的方法，在有放线菌酮存在的条件下，用[35S]蛋氨酸/半胱氨酸将沙眼衣原体或肺炎衣原体感染的细胞标记两个小时。标记完后，感染细胞(如实施例3中所述)直接在裂解缓冲液中收集或者用于直接纯化衣原体RB。基本上按照Schachter和Wyrick，1994[22.]所描述的密度梯度超离心方法进行RB的纯化。
在图10中，将沙眼衣原体D蛋白质的凝胶图片上的实例区域与RB和EB的凝胶图片上的相应区域进行比较，其中沙眼衣原体D蛋白质来源于在感染后22-24小时进行了标记的被感染HeLa细胞的全部裂解物，所述RB和EB是从沙眼衣原体感染的并在感染后22-24小时进行了标记的HeLa细胞中纯化的。通过质谱鉴定出了如表III所列的DT4(CT858的C-端片段)、DT48(CT858的N-端片段)、DT23(Mip)、DT76(假设蛋白质CT691)和DT77(假设蛋白质CT263)。
在图11中，将分别来源于肺炎衣原体感染的并在感染后55-57小时进行了标记的HEp-2细胞的凝胶图片和在整个生长周期的各个时间点标记的纯化的EB的凝胶图片的实例区域与来源于肺炎衣原体感染的细胞培养物的凝胶图片的相应区域进行比较，其中所述肺炎衣原体感染的细胞培养物在感染后34-36小时进行了标记并在感染后36小时以被感染细胞的全部裂解物形式被收集或者在感染后36小时被纯化为RB。
图11中圈起来的蛋白质斑点按照以下方式进行鉴定。图11A和E表示CP34和CP63，其被鉴定为是CPN1016的两个片段。图11B表示CP37，其被鉴定为CPN0998。图11C表示CP46和CP47，其被分别鉴定为CPN0796和CPN0705。图11D表示CP52，其被鉴定为CPN0152。图11F表示CP75，其被鉴定为CPN0619。
实施例7定位在III型分泌基因亚簇中的蛋白质的检测和鉴定由于大多数胞内细菌的III型分泌基因作为致病岛(island)定位于一个基因簇中，所以衣原体III型分泌基因被确定存在于沙眼衣原体和肺炎衣原体的基因组中不同位点上的三个不同亚簇中(Stephens等，1998[4.]和Kalman等，1999[5.])。作为沙眼衣原体A、D和L2以及肺炎衣原体VR1310的整个蛋白质分析的一部分，存在于III型分泌簇中的蛋白质从纯化的EB凝胶中而得到鉴定。
被鉴定的沙眼衣原体的III型分泌蛋白质包括Yop分泌ATP酶(yscN)、Yop转运蛋白质L(YscL)和分泌伴侣蛋白质(SycE)，这些蛋白质是将蛋白质从细菌胞质转运到分泌系统所必需的。被另外鉴定的功能未知但定位于III型分泌亚簇中的沙眼衣原体D蛋白质包括CT560和大量的CT577以及CT579。CT668明显存在于全细胞裂解物中，但不存在于纯化的EB中，并且由于其位置近邻YscN，所以该蛋白质可能被分泌。所述蛋白质在基因组中的位置如图9所示。
已经鉴定出了肺炎衣原体III型分泌器蛋白质LcrE(CPN0324)、YscC(CPN0702)、YscN(CPN0707)和YscL(CPN0826)。YscC(CP89图II，表II)不存在于纯化的EB中，这可能是由于YscC定位在包函体膜中，从此暴露于宿主细胞的胞质。存在于III型簇中、定位在YscC(CPN0702)和YscN(CPN0707)周围的的两种蛋白质在全细胞裂解物中的含量明显高于在被纯化的EB中的含量。这两种蛋白质是CPN0705(CP90，图II，表II)和CPN0711(CP76，图II，表11)。这些蛋白质还可能定位于包函体膜中或存在于宿主细胞的胞质中，并且在这两种情况下，这两种蛋白质可能易受到蛋白质酶体的作用。
实施例8候选分泌蛋白质的脉冲追踪研究为了评估鉴定的候选蛋白质在被感染细胞中的存在时间，本发明提供了一系列的脉冲追踪研究。在下列实施例中，被感染细胞培养物被[35S]标记22-24小时。标记后，将培养基换成不含[35S]-蛋氨酸的普通RPMI培养基并在标记后的不同时间收集细胞。通过几种独立的研究的结果表明可能由于宿主细胞密度和/或感染的效力方面的细微差异而产生了较小的变异。
图1B，C，D和E提供了脉冲/追踪实验的实例。CT668和DT8强度(分别是图1A，B)在合成后1.5小时明显降低并在4.5小时的时候完全从凝胶上消失而直至EB阶段。CT610和CT783(图1C，D)明显降低，但在4.5小时的时候仍能够被检测到而直至EB阶段。CT858(D)的C-端片段(和CT858的N-端片段)在追踪初期逐步增大，但不存在EB中，表明裂解产物在衣原体生长过程中进行了积累。CT858的肺炎衣原体同系物的N-端片段CPN1016也不存在EB中(图2)。
实施例9结合使用蛋白质酶体抑制剂进行的脉冲追踪研究该实施例表明如何确定哪些候选疫苗在蛋白质酶体中进行了加工。在标记和追踪阶段将细胞穿透性蛋白质酶体抑制剂加到被感染的细胞培养物中，并对蛋白质的更新时间和没有加入蛋白质酶体抑制剂时进行标记/追踪所观察到的蛋白质更新时间进行比较。该方法的重要实例如图6所示。于感染后的22-24小时，在有10-100μM的蛋白质酶体抑制剂MG-132存在的条件下或者没有蛋白质酶体抑制剂存在的条件下对所述蛋白质进行标记。感染后的24-28小时，用普通生长培养基冲洗两次后将标记培养基换成含有或不含MG132的生长培养基并进行追踪。细胞裂解物进行2D-PAGE(IPG)分析，与不含MG-132的对照进行比较，并与标记后即刻回收的蛋白质的凝胶进行比较(图6A，B和C)。本发明提供了十五种沙眼衣原体D蛋白质的实例，这些蛋白质由于经过蛋白质酶体抑制剂的处理而使得更新时间得到延长。
DT9、DT10和DT11在被追踪的+MG132凝胶中的含量实际上比标记后即刻回收的对照样品中的含量高。这表明DT9、DT10和DT11被蛋白质酶体很快地降解了。相反，通过添加蛋白质酶体抑制剂对DT7的含量影响不大。
本发明包括其它几种蛋白质酶体抑制剂(例如MG115，MG262，PSI和lactocystein)的用途，这几种蛋白质酶体抑制剂抑制蛋白质酶体的不同催化活性部分，其可以阐明被蛋白质酶体降解的其它蛋白质(表IV)。
实施例10利用遗传改变的细胞系来分析蛋白质酶体抑制剂对衣原体蛋白质的更新时间的影响本发明还提供了商购小鼠胚胎细胞系MEC-PA28细胞系PW8875的用途。MEC-PA28被蛋白质酶体的IFN-γ诱导型PA28α和β亚单位所转染，而MEC217细胞系被蛋白质酶体的IFN-γ诱导型LMP2、LMP7和MECL所转染。MEC-PA28和MEC217培养到半汇合度并用沙眼衣原体或肺炎衣原体感染。没有被蛋白质酶体亚单位转染的对照小鼠胚胎细胞系被同时感染。
因为编码细胞系MEC-PA28和MEC217的过表达亚单位的转染基因是MHC I型抗原加工和提呈所必需的，如前所述对这些宿主细胞进行利用蛋白质体抑制剂结合脉冲标记/追踪的实验。
实施例11编码候选疫苗可读框(ORF)的克隆和表达利用pET-30LIC载体试剂盒(Novagen，Madison，USA)按照厂商提供的使用说明书进行编码候选疫苗可读框(ORF)的克隆和表达。
用于基因PCR的引物具有下列5′端和3′-端的LIC突出端正向引物5′GACGACGACAAGATX-基因特异序列3′反向引物5′GAGGAGAAGCCCGGT-基因特异序列3′(X插入特异序列的第一个核苷酸)
全长基因或不含引导序列的基因通过利用扩增高保真PCR(Expand High Fidelity PCR)(Roche，德国)的PCR来进行扩增。利用DNA热循环仪(GeneAmp PCR system 9600，Perkin Elmer)按照下列程序进行35个PCR-循环92℃15秒(变性)，55℃15秒(引物退火)以及68℃4分钟(延伸)。得到的PCR产物包括与基因特异序列邻近的LIC-突出端。PCR产物进行Wizard(Promega，Madison，USA)纯化以及被连接在pET-30载体中。所述pET-30载体含有编码卡那霉素抗性的基因和LIC克隆位点的上游组氨酸标记物。
含有候选基因的pET-30载体被转化到感受态的E.coli NovaBlue菌株中。在卡那霉素琼脂平板上选择克隆，并且利用载体特异引物和插入片段特异引物对被选择的克隆进行对照PCR。从含有候选基因特异插入片段的阳性克隆中纯化质粒DNA。质粒DNA然后被转化到E.coli(BL21)中。在卡那琼脂平板上选择插入阳性克隆。在500ml的LB培养基中通过加入1mM的IPTG(Apollo Scientific，GB)诱导含有基因特定插入序列(包括位于N-端的组氨酸标记物)的融合蛋白质的表达。
产生了表达沙眼衣原体的CT668、CT858、CT783、CT610、YscN和DT8和肺炎衣原体VR1310的CPN1016和YscC的重组融合蛋白质的E.coli(BL21)。
利用如前所述的镍树脂柱(High Trap Sepharose，AmershamPharmacia Biotech)从裂解的细菌中纯化所述重组融合蛋白质。对纯化蛋白质进行考马斯染色的SDS-PAGE。代表融合蛋白质的考马斯染色电泳带通过MALDI MS进行了明确的鉴定从而证明产生了正确的融合蛋白质。如Knudsen等的[17]中所述，通过三次肌内注射溶解在弗氏佐剂中的50μg融合蛋白质和两次静脉注射溶解在PBS中的50μg融合蛋白质来对新西兰白兔进行免疫，从而获得含多克隆抗体的血清。
实施例12利用抗候选疫苗的PAb进行的蛋白质印迹为了确定PAb识别正确候选疫苗以及为了显示可能发生的翻译后修饰或加工，进行了2D-PAGE免疫印迹。通过2D-PAGE分离来自全细胞裂解物的500μg未被标记的和2×106cpm标记的沙眼衣原体D或肺炎衣原体蛋白质，并将蛋白质电印迹到PVDF膜上。用在含150mM NaCl(或高盐浓度，400mM)、20mM Tris、0.2％w/v明胶、0.05％v/v Tween 20(Bio-Rad)和2％v/v标准山羊血清(Dako，GlostrupDenmark)的缓冲液中1/500-1/1000稀释的PAb来进行免疫印迹。
所使用的第二抗体是缀合了碱性磷酸酯酶的山羊抗-兔的IgG(Bio-Rad)，该IgG在抗体缓冲液中以1/2000稀释。印迹用5-溴-4-氯-3-吲哆磷酸甲苯铵(BCIP)/氮蓝四唑(NBT)(Bio-Rad)进行染色直到能够检测到明显的反应。免疫印迹进行计算机扫描后对X-射线胶片曝光大约8天。用Melanie II软件来对被免疫染色的蛋白质和其[35S]-标记的对应物进行比较。
在图7A1和7A2中显示了用抗CT858的PAb245的完整2D-PAGEIMB图像的实例。如相应被标记背景(Fig 7A2)所示，PAb245与DT4(CT858C-端片段)和DT48(CT858N-端片段)(图7A1)发生重复性反应。
图7B1和7B4表示CT668和YscN的IMB。凝胶上的免疫反应蛋白质斑点及其在被标记背景(图7B2和B5)上的定位与分析凝胶(图7B3和B6)上的蛋白质位置相对应，由此证实了PAb与正确蛋白质发生了反应。
本发明提供了一个IMB实例，其表明与未处理对照相比，经MG132处理的感染细胞中的某些同种型CT610的含量明显增加。DT7被鉴定为CT610并正好定位在DT9、DT10、DT11和DT12的上方(图6A)。在全细胞裂解物的2D-凝胶印迹上的抗CT610的PAb255的IMB与两排斑点发生明显的反应，其中一排代表DT7以及另一排代表DT9、DT10、DT11和DT12。大概是由于不同的翻译后的修饰和加工，CT610以不同的同种型存在。如果细胞用蛋白质酶体抑制剂MG132来处理，DT9、DT10和DT11的量则明显增加(图7C2)。
在常规的SDS-PAGE PVDF印迹上进行PAb255的IMB，所述印迹含有来源于分别在有或无MG132存在的条件下处理的全细胞裂解物的蛋白质。图7C4清楚地表明与未处理的对照相比(泳道a和c)，在含有源于MG132处理的感染细胞的蛋白质的泳道(泳道b和d)中在代表DT7排斑点的电泳带的下方多出一条带。代表DT7排的上方带的水平经蛋白质酶体抑制剂的处理没有发生明显的变化。
实施例13候选物在不同沙眼衣原体血清型和不同宿主细胞中的表达本发明考虑了血清型/宿主细胞在可能分泌蛋白质表达水平方面存在的特异性差异，这是因为宿主细胞/衣原体间的相互作用对于其它血清型或通过在其它宿主细胞中进行培养来说可能不同。这与最可能为常规沙眼衣原体疫苗的候选疫苗的选择有关。
在沙眼衣原体A、D和L2中的相同位置上都检测到了CT668、CT858、CT783和CT610。这与编码这些蛋白质的基因在沙眼衣原体D和L2之间具有的高度保守性一致。另外，当在McCoy或Hep-2细胞而不是HeLa细胞中来培养沙眼衣原体A，D和L2时，表达所有蛋白质，这表明这些蛋白质的表达不依赖于所使用的细胞类型。然而，基于含有在感染后的22-24小时或34-36小时进行了标记的衣原体蛋白质的凝胶，在血清型A和D中检测到的DT8的pI为5.1以及Mw为7.5。然而，在血清型L2中，检测到的DT8的PI为6.4以及Mw为7.5，这大概是由于较少的氨基酸取代改变了蛋白质的静电荷和等电点。
实施例14候选疫苗的间接免疫荧光显微术带有盖玻片的小室(wells)含有半汇合度的单层HeLa细胞，用肺炎衣原体或沙眼衣原体D感染所述的单层HeLa细胞。由于使用了低滴度的衣原体所以只有约50％的细胞被感染，因此可以明显地区别开被感染的细胞和未被感染的细胞。在感染后的不同时间用PBS将细胞冲洗两次并用甲醛或甲醇进行固定并进行间接免疫荧光显微术。如果必要，用丙酮沉淀的HeLa蛋白质预吸收PAb以便使与人体蛋白质之间的交叉反应最小。
在图8所示的实例中，采用了稀释度为1/200的被预吸收的兔PAb和稀释度为1/25的小鼠单克隆抗体，其中该单克隆抗体抗沙眼衣原体MOMP(MAb 32.3)或抗肺炎衣原体的Mab 18.3。缀合了异硫氰酸荧光素(FITC)的山羊抗兔(GAR)IgG抗体和缀合了罗丹明的山羊抗-小鼠(GAM)IgG抗体(Jackson，Trichem，丹麦)被用作第二抗体。为了测定与衣原体包函体相关的候选疫苗的亚细胞定位而进行双免疫染色。
针对具有短的更新时间的DT8的PAb 249与衣原体包函体中的RB发生微弱的反应(图8A3)。在包函体外尽管与HeLa细胞蛋白质发生了最低限度的交叉反应，但是没有发现与宿主细胞结构之间有明显的反应。
相反，CT858对被感染细胞中的胞质染色明显而对未感染细胞的染色不明显(图8B3)。总之，在包函体的边缘染色更强。宿主细胞胞质的染色能够在感染后的12至72小时显现，这与由脉冲追踪分析所预测的长更新时间一致。当所产生的抗肺炎衣原体CPN1016的PAb与肺炎衣原体感染的Hep-2细胞发生反应时，观察到具有相同特征的反应，其中所述肺炎衣原体CPN1016与CT858同源。
对被鉴定蛋白质实例的描述实施例15斑点号CT668(DT1和DT2)将CT668置于一个亚簇中的YscN ATP酶的紧上游，其中所述亚簇含有与III型分泌基因具有同源性的基因而不含所预测的信号肽酶可识别的酶切位点。CT668只在沙眼衣原体D中存在约4-6小时，这期间其含量在逐步减少。抗CT668的PAb似乎只是与包函体中的RB在IMF中发生微弱的反应，但是考虑到该蛋白质的更新时间短，这可以被解释为在宿主细胞中发生了快速降解。在感染后的12-40小时检测到CT668，这表明在胞内生长的大部分时间内都产生了该蛋白质。因此可能沙眼衣原体不断地将CT668输送给宿主细胞，在这里它发挥了作用并被快速降解。
鉴定了两种CT668的变体。碱性变体在沙眼衣原体蛋白质的凝胶上含量最高，其中所述蛋白质在感染后的22-24小时进行了标记并随后被回收。有趣的是，在进行的所有研究中，随着时间酸性变体的强度增大而碱性变体的强度减小。当以30分钟的时间间隔追踪CT668时，在1小时时就已经检测到了酸性变异体的增加(图1B)。
该发现表明所述改变与跑胶的条件无关，跑胶条件只能产生诸如氨甲酰化或酰胺化这样的变化。相反，所述改变似乎是通过一种未知酶产生的，该未知酶对所述蛋白质进行修饰。
已在鹦鹉衣原体中描述过分泌蛋白质的改变，其中IncA在转位到包函体膜上后，被宿主细胞的Ser/Thr激酶所磷酰化(Rockey等，1997)[29.]。通过采用蛋白质酶体抑制剂进行处理，CT668的更新时间被延长了，表明至少有限量的CT668可以在蛋白质酶体中得到加工。
实施例16斑点号DT8(DT8)DT8是一种新型的7.2kDa蛋白质，通过同源检索，证明其是一种沙眼衣原体特异性蛋白质。PSORT分析结果表明不存在这种蛋白质的可识别引导序列。理论上的同等的pI5.21/7.2kDa与实验所测定的相当一致。已知的CT668的许多特性DT8也具有。发现更新时间很短，其小于6个小时，并且IMF表明只与RB发生微弱反应。
在DT8中的终止密码子后，可以预测到一个可能的茎-环区域，该区域是蛋白质的一个Rho-非依赖性转录终止。
实施例17斑点号DT7，DT9，DT10，DT11，DT12(CT610)CT610没有定位在任何与其它生物体内的分泌相关的基因同源的基因附近。从全细胞裂解物和EB中检测到了所述蛋白质，但是借助Melanie II软件进行评估后，发现全细胞裂解物中的蛋白质含量至少多出30倍。检测到所述蛋白质的几种同种型，其中这些同种型表现为两种分子量的多态性，该多态性是通过抗CT610的Pab255所确定的。这几排斑点代表DT7(上排)和DT9、10、11、12(下排)。在脉冲追踪研究中，这些排都具有短的更新时间。有趣的是，根据脉冲追踪/MG132研究，DT9、DT10和DT11的含量通过蛋白质酶体抑制剂的处理显著提高。通过Pab255的SDS PAGE IMB验证了脉冲追踪的研究结果。
因此本发明提供了关于CT610的某些同种型在蛋白质酶体中进行分泌和加工的证据。CT610同种型的不同结果表示利用抗候选疫苗的Pab检测这些同种型的关系。
实施例18斑点号DT3(CT783)CT783已被证明是一种沙眼衣原体蛋白质二硫键异构酶。CT783与硫氧还蛋白质二硫化物异构酶(CT780)具有同源性，并且与来源于热自养甲烷杆菌的蛋白质二硫化物异构酶也具有同源性。通过PSORT和SignalP可以预测33个氨基酸的引导序列，而且，裂解蛋白质的理论PI和分子量与实验测得的结果相符。另外，在利用4-7L IPG的2D-PAGE IMB中抗CT783产生的多克隆抗体对正确斑点进行染色。
由于N-端引导序列发生裂解，该蛋白质可能通过I或III型系统进行分泌，更可能地是通过III型系统进行分泌。尽管大多数的PDI通常定位在周质中，但弱的PSORT预测表明在细菌内膜上的亚细胞定位。CT783具有短的更新时间而且通过合成后的约4-6小时的追踪，发现衣原体中基本不含CT783。
CT783的更新时间通过蛋白质酶体抑制剂而被延长，表明在蛋白质酶体中可能进行了加工。
实施例19斑点号DT4和DT48(CT858)和CP63(CPN1016)CT858具有一个可切割的N-端引导序列并且被预测是一种67kDa的周质蛋白质，但是在凝胶上的两个不同位置上检测到了CT858。将DT4鉴定为CT858的序列标记物与CT858的C-端完全匹配。在含有全细胞裂解物的2D-PAGE PVDF膜上IMB中，PAb245与这种C-短片段发生了明显的重复性的反应。另外，Pab245与蛋白质斑点DT48反应，其在脉冲追踪研究过程中也具有与DT4一样的长的更新时间。
通过MALDI MS还将DT48确定为CT858的N-端片段。DT48的分子对应物(coordinate)是pI7.3/Mw25.8。CT858的N-端部分产生一种含有对应物的肽，其与利用pI/Mw工具对不同长度的N-端(不含信号肽)实验测定的对应物相符。该分析表明在K233S234M235附近存在着切割位点。
一直到EB期(感染后的72小时)都能在2D-凝胶上检测到CT858的N-端和C-端片段，而在纯化的EB中却没有检测到，这一事实表明在宿主细胞的胞质中具有很长的更新时间。这与在IMF分析中直到72小时都能在宿主细胞胞质中非常清楚地检测到CT858的结果一致。CT858与大肠杆菌的尾部-特异性蛋白质酶(tsp)具有很小的同源性，其中所述酶与青霉素结合蛋白质的加工有关并且包括来源于人中间光受体视网膜样-结合蛋白质(interphotoreceptor retionoid-bindingproteins)的IRBP结构域，其中所述结合蛋白质结合疏水性配基(Silber等，1992)[32.]。II型分泌与几种包括P.aeroginosa和嗜水气单胞菌在内的革兰氏阴性菌中的降解性蛋白质的输出有关(参见Hobbs和Mattick的评述，1993)[33.]。在Aerosiginosa hydrophila内，一种分泌的弹性蛋白质酶(ahpB)最近被证明对于微生物体的毒性非常重要(Cascon等，2000)[34.]。
这些蛋白质具有与CT858相似的结果。它们大都被合成为含有一个可切割信号肽的前肽形式，然后被加工成成熟蛋白质。另一种与尾特异性蛋白质酶也具有同源性的沙眼衣原体蛋白质是假拟蛋白质CT441。仍然需要确定该蛋白质是否具有与CT858相同的分泌特性。
利用抗CPN1016的Pab253观察到肺炎衣原体同系物CPN1016的CT858相同的亚细胞定位，因而表明该基因在两个衣原体种间是功能保守的。
实施例20
由其基因数确定的分泌的沙眼衣原体D和肺炎衣原体蛋白质通过ANN来进行分析，所述ANN能够识别与人HLA-A2具有亲合性的肽。在表V-VIII中，列出了由ANN选择的预计与HLA-A2结合的肽并给出了以nM表示的亲和力(Kd)。值愈低愈好。Kd低于50nM的肽大都是免疫原性的。Kd低于500nM(但高于50nM)的肽具有潜在的免疫原性。与给定肽的结合力可以通过取代P2或P9的锚定位置上的一个亚适度氨基酸来提高-一种通常保留针对天然肽的特异性的方案。
实施例21候选疫苗在实验动物模型体内产生特异性细胞毒CD8+T细胞的能力测定在一种方法中，使用全长重组蛋白质的所述候选疫苗免疫实验动物(小鼠或豚鼠)，其中所述实验动物包括表达人HLA I型分子的转基因A2小鼠。
在另一种方法中，通过计算机算法筛选候选疫苗的T-细胞表位，然后合成含有这些表位的肽，并按照用于全长候选疫苗的免疫方法用于免疫。
在第三种方法中，以一种重叠的方法合成8-10个氨基酸长的肽，因此这些肽覆盖了候选疫苗的全长序列，并用于与放射标记中间结合体产生竞争的MHC I型结合试验。按照用于全长候选疫苗的免疫方法将为良好结合物的肽用于免疫。
候选疫苗既可以以肽/蛋白质组合的形式进行施用也可以以在佐剂中的单肽/蛋白质形式进行施用。候选疫苗还可以作为DNA-疫苗进行施用或通过表达候选疫苗的病毒来进行施用。
通过密度梯度离心从免疫动物体内提纯外周血单核细胞(PBMC)并通过利用与磁珠子结合的抗体或通过其它方法来纯化CD8+细胞。CD8+细胞活性通过诸如ELISPOT和掺入氚化胸苷这样的增殖试验以及通过特异性裂解试验(铬释放)来测定。
从被免疫动物体内纯化的PBMC或CD8+细胞以有限稀释度被平铺置于微滴板上，连同照射的抗原提呈细胞、生长因子以及特异性或非特异性刺激物。为了进行特异性刺激，采用了被预测为是良好的T-细胞表位或被发现是MHC I型分子良好结合物的单一候选疫苗蛋白质或肽。为了进行非特异性刺激，使用了被衣原体感染的细胞。将细胞培养9-14天，这期间抗原特异性细胞进行了增殖。特异性细胞毒CD8+T-细胞的产生是通过利用ELISPOT试验测定被刺激细胞的细胞因子分泌来确定。T-细胞的增殖是通过掺入氚化胸苷、然后进行闪烁计数来测定。增殖细胞的细胞毒性利用细胞毒试验来测定，该试验如同以衣原体感染的细胞或表达候选疫苗蛋白质/肽的重组细胞作为靶细胞的铬释放试验一样[42]。
实施例21对候选疫苗保护小鼠和豚鼠抵抗衣原体感染的能力的检测采用单蛋白质/肽形式的候选疫苗或采用候选疫苗组合对实验动物进行免疫(如上所述)。免疫后，用衣原体对所述动物进行实验性感染(鼻内感染肺炎衣原体以及生殖器感染沙眼衣原体)。通过对衣原体进行培养、免疫组织化学、定量PCR和研究感染后的血清转化来测定抗感染的保护能力。
实施例23在人体内产生候选疫苗-特异性细胞毒CD8+T细胞的衣原体感染能力的测定采用ELISA(Medac)方法检测人血清样品中是否存在衣原体的抗体。选择出含有候选疫苗-特异性细胞毒CD8+T-细胞的血清-阳性个体。
利用密度梯度离心法从被检测是抗衣原体抗体样性人体中纯化外周血单核细胞(PBMC)并利用抗体和磁珠子或其它方法纯化CD8+细胞。CD8+T-细胞特异性抗候选疫苗蛋白质/肽的活性是通过实施例19中所述的方法测定的。
实施例24利用候选疫苗进行用于诊断目的的ELISA检测由于本发明的分泌蛋白质在被纯化的微生物体内不存在或含量非常低，因而基于纯化原体的免疫试验不能检测针对这种蛋白质的抗体。因此分泌蛋白质可以代表未被识别的主要抗原，该抗原还与体液免疫应答有关。另外，由于分泌蛋白质仅仅在衣原体生长的胞内阶段进行表达，所以基于被分泌衣原体蛋白质的ELISA可以检测到衣原体的持续感染。
1)分泌蛋白质以纯化的重组蛋白质形式产生。或者还产生代表分泌蛋白质的重叠合成肽。
2)ELISA平板包被了代表分泌蛋白质的纯化的重组蛋白质(或由分泌蛋白质产生的合成肽)。ELISA平板用15％的胎牛血清封闭以免发生非特异性结合。
3)利用微-IF或ELISA(Medac)筛选患者血清中的抗沙眼衣原体或肺炎衣原体的抗体。在包被了代表分泌蛋白质的重组抗原的ELISA平板上检测阳性血清。
4)使用抗人IgG、IgA或IgM检测抗体结合。将被感染小鼠的血清用作对照。
5)将由微-IF或ELISA(Medac)的到的结果与基于代表分泌蛋白质的重组蛋白质的ELISA进行比较。
参考文献1.Saikku P，Leinonen M，Mattila K，Ekman MR，Nieminen MS，Makela PH，Huttunen JK，Valtonen V，Serological evidence of an association of anovel Chlamydia，TWAR，with chronic coronary heart disease and acutemyocardial infarction.Lancet 1988 Oct 29；2(8618)983-62.Shor A，Kuo CC，Patton DL(1992)Detection of Chlamydia pneumoniae incoronary arterial fatty streaks and atheromatous plaques.S Afr MedJ.82(3)158-613.Hueck，C.J.(1998)Type III protein secretion systems in bacterialpathogens of animals and plants.Microbiol Mol Rev 62，379-4334.Stephens，R.S.，Kalman，S.，Lammel，C.，Fan，J.，Marathe，R.，Aravind，L.，Mitchell，W.，Olinger，L.，Tatusov，R.L.，Zhao，Q.，Koonin，E.V.，Davis，R.W.(1998)Genome sequence of an obligate intracellular pathogen ofhumansChlamydia trachomatis，Science 282，754-7595.Kalman，S.，Mitchell，W.，Marathe，R.，Lammel，C.，Fan，J.，Hyman，R.W.，Olinger，L.，Grimwood，J.，Davis，R.W.，Stephens，R.S(1999).Comparative genomes of Chlamydia pneumoniae and C.trachomatis，Nat.Gent.21，385-3896.Rock，K.L.，Alfred L.Goldberg(1999)Degradtion of cell proteins and thegeneration of MHC class I-presented peptides，Annu.Rev.Immunol，17，739-7797.Murdin AD，Su H，Manning DS，Klein MH，Parnell MJ，Caldwell HD(1993)Apoliovirus hybrid expressing a neutralization epitope from the major outermembrane protein of Chlamydia trachomatis is highlyimmunogenic.Infect Immun，61(10)4406-148.Cerrone MC，Ma JJ，Stephens RS(1991)Cloning and sequence of the genefor heat shock protein 60 from Chlamydia trachomatis and immunologicalreactivity of the protein.Infect Immun，59(1)79-909.Igietseme JU，Magee DM，Williams DM，Rank RG(1994)Role for CD8+Tcells in antichlamydial immunity defined by Chlamydia-specific T-lymphocyte clones.Infect Immun 62(11)5195-7
10.Subtil A，Blocker A，Dautry-Varsat A(2000)Type III secretion system inChlamydia speciesidentified members and candidates.Microbes Infect2(4)367-911.Fields KA，Hackstadt T(2000)Evidence for the secretion of Chlamydiatrachomatis CopN by a type III secretion mechanismMol Microbiol 2000Dec；38(5)1048-6012.Read，T.D，Brunham，R.C.，Shen，C.，Gill，S.R.，Heidelberg，J.F.，White，O.，Hickey，E.K.，Peterson，J.，Utterback，T.，Berry，K.，Bass，S.，Linher，K.，Weidman，J.，Khouri，H.，Craven，B.，Bowman，C.，Dodson，R.，Gwinn，M.，Nelson，W.，DeBoy，R.，Kolonay，J.，McClarty，G.，Salzberg，S.L.，Eisen，J.，Fraser，C.M.(2000)Genome sequences of Chlamydiatrachomatis MoPn and Chlamydia pneumoniae AR39.Nucleic Acids Res28，1397-140613.Shirai M，Hirakawa H，Kimoto M，Tabuchi M，Kishi F，Ouchi K，Shiba T，Ishii，K，Hattori M，Kuhara S，Nakazawa T(2000)Comparison of wholegenome sequences of Chlamydia pneumoniae J138 from Japan andCWL029 from USA.Nucleic Acids Res 152311-231414.Starnbach，M.N.，Bevan，M.J.(1994)，Cells infected with Yersinia presentan epitope to class I MHC-restricted CTL.，J Immunol，153，1603-1215.Rockey，D.D，Heinzen，R.A，and Hackstadt，T.(1995)Cloning andcharacterisation of a Chlamydia psittaci gene coding for a proteinlocalized in the inclusion membrane of infected cells.Mol.Mcirobiol 15，617-62616.Bannantine，J.，Stamm，W.，Suchland，R.，Rockey，D.(1998)，Chlamydiatrachomatis IncA is localized to the inclusion membrane and is recognizedby antisera from infected humans and primates，Inct.immun，66，6017-602117.Knudsen K，Madsen AS，Mygind P，Christiansen G，BirkelundS(1999)Identification of two novel genes encoding 97-to 99-kilodaltonouter membrang proteins of Chlamydia pneumoniae.Infect Immun67(1)375-83
18.Shaw，A.C.，Christiansen，G.，Birkelund，S.(1999)Effects of interferongamma on Chlamydia trachomatis serovar A and L2 protein expressioninvestigated by two-dimensional gel electrophoresis.Electrophoresis20(4-5)775-80.
19.Shaw，A.C.，Christiansen，G.，Roepstorff，P.，Birkelun，S.(2000)Geneticdifferences in the Chlamydia trachomatis tryptophan synthase a-subunitcan explain variations in serovar pathogenesis.Microbes Infect 2581-59220.Gobom J，Nordhoff E，Mirgorodskaya E，Ekman R，RoepstorffP(1999)Sample purification and preparation technique based on nano-scale reversed-phase columns for the sensitive analysis of complexpeptide mixtures by matrix-assisted laser desorption/ionization massspectrometry.J Mass Spectrom 34(2)105-1621.Gevaert，K.，Demol，H.，Puype，M.，Broekaert，D.，De Boeck，S.，Houthaeve，T.，Vandekerckhove，J.(1997)Peptides adsorbed on reverse-phase chromatographic beads as targets for femtomolesequencing bypost-source decay matrix assisted laser desorption ionization-reflectrontime of flight mass spectrometry(MALDI-RETOF-MS).Electrophoresis182950-296022.Schachter，J.，Wyrick，P.B(1994)Culture and isolation of Chlamydiatrachomatis.Methods Enzymol 236377-39023.Harder，A.，Wildgruber，R.，Nawrocki，A.，Fey，S.J.，Larsen，P.M.，Gorg，A.(1999)Comparison of yeast cell protein solubilization procedures for two-dimensional electrophoresis.Electrophoresis 20826-82924.Shevchenko A，Jensen ON，Podtelejnikov AV，Sagliocco F，Wilm M，VormO，Mortensen P，S，Boucherie H，Mann M(1996)Linking genome andproteome by mass spectrometrylarge-scale identification of yeastproteins from two dimensional gels.Proc Natl Acad Sci USA9314440-1444525.Mann，M，Wilm，M(1995)Electrospray mass spectrometry for proteincharacterization.Trends Biochem Sci.，20219-24
26.Wilm M，Mann M(1996)Analytical properties of the nanoelectrospray ionsource Anal Chem 68(1)1-827.Wilkins MR，Gasteiger E，Sanchez JC，Appel RD，Hochstrasser DF.Protein identification with sequence tags.Curr Biol.1996 Dec1；6(12)1543-4.
28.Mann M，Hojrup P，Roepstorff P.Use of mass spectrometric molecularweight information to identify proteins in sequence databases.Biol MassSpectrom.1993 Jun；22(6)338-45.
29.Rockey，D.D.，Grosenbach，D.，Hruby，D.E.，Peacock，M.G.，Heinzen，R.A.，Hackstadt，T.(1997)Chlamydia psittaci IncA is phosphorylated bythe host cell and is exposed on the cytoplasmic face of the developinginclusion，Mol.Microbiol.，24，217-22830.Forster C，Marienfeld S，Wilhelm R，Kramer R(1998)Organelle purificationand selective permeabilisation of the plasma membranetwo differentapproaches to study vacuoles of the filamentous fungus Ashbyagossy pii.，EMS Microbiol Lett 1998 Oct 15；167(2)209-1431.Melan MA(1999)Overview of cell fixatives and cell membrane permeants.Methods Mol Biol 1999；11545-5532.Silber，K.R.，Keiler，K.C.，Sauer，R.T.(1992)Tspa tail-specific proteasethat selectively degrades proteins with nonpolar C termini.Proc Natl AcadSci U S A，89，295-933.Hobbs，M，Mattick，J.S.(1993)Common components in the assembly oftype 4 fimbraie，DNA transfer systems，filamentous phage and proteinsecretion apparatusa general system for the formation of surface-associated protein complexes.Mol.Microbiol.10，233-24334.Cascon，A.，Yugueros，J.，Temprano，A.，Sanchez，M.，Hernanz，C.，Luengo，J.M.，Naharro，G.(2000)A major secreted elastase is essentialfor pathogenicity of Aeromonas hydrophila.Infect Immun，68，3233-4135.Stephens，R.S.，Kalman，S.，Fenner，C.，Davis，R.，(1998b)TheChlamydia Genome Project，http//socrates.berkeley.edu4231/.
36.Rock，K.L.，Gramm，C.，Rothstein，L.，Clark，K.，Stein，R.，Dick，L.，Hwang，D.，Goldberg，A.L.(1994)Inhibitors of the proteasome Block thedegradation of Most Cell Proteins and the Generation of PeptidesPresented on MHC Class I Molecules.Cell，78，761，77137.Fling，S.P.，Sutherland，R.A.，Steele，L.N.，Hess，B.，D′O rizio，S.E.F，Maisonneuve，J.-L.，Lampe，M.，Probst，P.，Starnbach，M.N.(2001)CD8 Tcells recoqnize an inclusion membrane associated protein from thevacuolar pathogen Chlamydia trachomatis，PNAS，98，1160-116538.Siits，A.J.，S.Standera，R.E.Toes，T.Ruppert，N.J.Beekman，P.A.vanVeelen，F.A.Ossendorp，C.J.Melief，and P.M.Kloetzel(2000).MHCclass I antigen processing of an adenovirus CTL epitope is linked to thelevels of immunoproteasomes in infected cells.J.Immunol.，164，450039.Van Hall，T.，A.Sijts，M.Camps，R.Offringa，C.Melief，P.M.Kloetzel，and F.Ossendorp(2000)Differential Influence on Cytotoxic TLymphocyte Epitope Presentation by Controlled Expression of EitherProteasome Immunosubunits or PA28.J.Exp.Med.，192，483.
40.Shockett，P.，M.Difilippantonio，N.Hellman，and D.G.Schatz(1995).Amodified tetracycline-regulated system provides autoregulatory，induciblegene expression in cultured cells and transgenic mice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，652241.Probst，P.，Bhatia，A.，Skeiky，Y.，Jen，S.(1999)，International publicationnumberWO 00/34483，PCT/US99/2901242.Hickling K.H.(1998)，Measuring human T-lymphocyte function，ExpertReviews in Molecular Medicine ISSN 1462-399443.Siits，A.J.，Villanueva，M.S.，Pamer，E.GCTL epitope generation istightly linked to cellular proteolysis of a Listeria monocytogenes antigen，TheJournal of immunology，1996，156，1497-150344.Hess，J.，Kaufmann，S.HVaccination strategies against intracellularmicrobes，FEMS Immunology and Medical Microbiology，1993，7，95-104
序列表<110> Vandahl，Brian Berg<120> 用于鉴定胞内细菌蛋白质的方法<130> P200100157WO<150> DK PA 200100581<151> 2001-04-09<160> 194<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 67<212> PRT<213> 沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)<400> 1Met Gln His Thr Ile Met Leu Ser Leu Glu Asn Asp Asn Asp Lys Leu1 5 10 15Ala Ser Met Met Asp Arg Val Val Ala Ala Ser Ser Ser Ile Leu Ser20 25 30Ala Ser Lys Asp Ser Glu Ser Asn Arg Gln Phe Thr Ile Ser Lys Ala35 40 45Pro Asp Lys Glu Ala Pro Cys Arg Val Ser Tyr Val Ala Ala Ser Ala50 55 60Leu Ser Glu65<210>2<211>204<212>DNA<213>沙眼衣原体<400>2atgcaacaea caattatgct gtctttagag aacgataatg ataagcttgc ttctatgatg60gatcgagttg ttgctgcgtc atcaagcatt ctttctgctt ccaaagattc tgagtccaat
120agacagttta ctatttctaa agctccggat aaagaagctc cttgcagagt atcttatgta180gctgcaagtg cactttcaga atag204<210>3<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT263免疫原性肽<400>3Lys Leu Ala Glu Ala Ile Phe Pro Ile1 5<210>4<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT263免疫原性肽<400>4Phe Leu Lys Asn Asn Lys Val Lys Leu1 5<210>5<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT263免疫原性肽
<400>5Ala Leu Ser Pro Pro Pro Ser Gly Tyr1 5<210>6<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT263免疫原性肽<400>6Phe Ile Ala Lys Gln Ala Ser Leu Val1 5<210>7<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT263免疫原性肽<400>7Thr Leu Ser Leu Phe Pro Phe Ser Leu1 5<210>8<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT263免疫原性肽<400>8
Ser Leu Val Ala Cys Pro Cys Ser Met1 5<210>9<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT263免疫原性肽<400>9Leu Ile Phe Ala Asp Pro Ala Glu Ala1 5<210>10<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT263免疫原性肽<400>10Leu Leu Leu Ile Phe Ala Asp Pro Ala1 5<210>11<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT263免疫原性肽<400>11Ile Leu Ser Trp Met Leu Met Phe Ala
1 5<210>12<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT541免疫原性肽<400>12Lys Gln Met Ala Glu Val Gln Lys Ala1 5<210>13<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT541免疫原性肽<400>13Leu Met Phe Ala Val Ala Leu Pro Ile1 5<210>14<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT541免疫原性肽<400>14Lys Leu Gln Tyr Arg Val Val Lys Glu1 5
<210>15<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT541免疫原性肽<400>15Phe Leu Lys Glu Asn Lys Glu Lys Ala1 5<210>16<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT541免疫原性肽<400>16Lys Leu Ser Arg Thr Phe Gly His Leu1 5<210>17<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT541免疫原性肽<400>17Ser Leu Leu Ile Phe Glu Val Lys Leu1 5<210>18
<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT541免疫原性肽<400>18Val Leu Ser Gly Lys Pro Thr Ala Leu1 5<210>19<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT541免疫原性肽<400>19Val Leu Tyr Ile His Pro Asp Leu Ala1 5<210>20<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT541免疫原性肽<400>20Leu Leu Ser Arg Gln Leu Ser Arg Thr1 5<210>21<211>9<212>PRT
<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT691免疫原性肽<400>21Leu Leu Gln Arg Glu Leu Met Lys Val1 5<210>22<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT691免疫原性肽<400>22Ser Thr Ile Asn Val Leu Phe Pro Leu1 5<210>23<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT691免疫原性肽<400>23Pro Leu Gln Ala His Leu Glu Leu Val1 5<210>24<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体
<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT691免疫原性肽<400>24Ser Leu Phe Gly Gln Ser Pro Phe Ala1 5<210>25<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT691免疫原性肽<400>25Lys Leu Ala Tyr Arg Val Ser Met Thr1 5<210>26<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT691免疫原性肽<400>26Val Leu Trp Met Gln Ile Ile Lys Gly1 5<210>27<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合
<222>(1)..(9)<223>CT691免疫原性肽<400>27Val Leu Phe Pro Leu Phe Ser Ala Leu1 5<210>28<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT691免疫原性肽<400>28Phe Leu Gln Lys Thr Val Gln Ser Phe1 5<210>29<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT691免疫原性肽<400>29Phe Gly Gln Ser Pro Phe Ala Pro Leu1 5<210>30<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT858免疫原性肽
<400>30Val Leu Ala Asp Phe Ile Gly Gly Leu1 5<210>31<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT858免疫原性肽<400>31Arg Met Ala Ser Leu Gly His Lys Val1 5<210>32<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT858免疫原性肽<400>32Gly Leu Asn Asp Phe His Ala Gly Val1 5<210>33<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT858免疫原性肽
<400>33Phe Ser Cys Ala Asp Phe Phe Pro Val1 5<210>34<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT858免疫原性肽<400>34Met Leu Thr Asp Arg Pro Leu Glu Leu1 5<210>35<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT858免疫原性肽<400>35Leu Leu Glu Asn Val Asp Thr Asn Val1 5<210>36<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT858免疫原性肽<400>36
Arg Met Ile Leu Thr Gln Asp Glu Val1 5<210>37<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT858免疫原性肽<400>37Ser Cys Ala Asp Phe Phe Pro Val Val1 5<210>38<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT858免疫原性肽<400>38Phe Val Phe Asn Val Gln Phe Pro Asn1 5<210>39<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT858免疫原性肽<400>39Tyr Leu Tyr Ala Leu Leu Ser Met Leu1 5
<210>40<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT858免疫原性肽<400>40Ser Leu Ala Val Arg Glu His Gly Ala1 5<210>41<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT858免疫原性肽<400>41Tyr Leu Pro Tyr Thr Val Gln Lys Ser1 5<210>42<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT858免疫原性肽<400>42Ala Thr Ile Ala Pro Ser Ile Arg Ala1 5
<210>43<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT858免疫原性肽<220>
<221>BINDING<222>(1)..(9)<223>
<400>43Leu Leu Glu Val Asp Gly Ala Pro Val1 5<210>44<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT858免疫原性肽<400>44Arg Thr Ala Gly Ala Gly Gly Phe Val1 5<210>45<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT858免疫原性肽<400>45
Ser Leu Phe Tyr Ser Pro Met Val Pro1 5<210>46<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0152免疫原性肽<400>46Phe Leu Val Ser Cys Leu Phe Ser Val1 5<210>47<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0152免疫原性肽<400>47Tyr Leu Arg Asp Ala Gln Thr Ile Leu1 5<210>48<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0152免疫原性肽<400>48Leu Leu Ile Arg Ile Gln Asp His Val1 5
<210>49<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0152免疫原性肽<400>49Lys Leu Gly Arg Lys Phe Ala Ala Val1 5<210>50<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0152免疫原性肽<400>50Leu Val Ser Arg Thr Gln Gln Thr Leu1 5<210>51<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0152免疫原性肽<400>51Cys Leu Phe Ser Val Ala Ile Gly Ala1 5
<210>52<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0152免疫原性肽<400>52Gly Phe Gly Pro Pro Pro Ile Ile Val1 5<210>53<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0152免疫原性肽<400>53Ser Leu Pro Thr Lys Pro Tyr Ile Leu1 5<210>54<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0152免疫原性肽<400>54Arg Ile Gln Asp His Val Thr Ala Asn1 5<210>55<211>9
<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0152免疫原性肽<400>55Ala Ile Gly Ala Ser Ala Ala Pro Val1 5<210>56<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0152免疫原性肽<400>56Arg Leu Gly Ile Ser Gly Phe Ser Leu1 5<210>57<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0619免疫原性肽<400>57Phe Met Val Ser Gly Pro Val Val Val1 5<210>58<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体
<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0619免疫原性肽<400>58Leu Val Leu Glu Gly Ala Asn Ala Val1 5<210>59<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0705免疫原性肽<400>59Phe Val Gly Ala Asn Leu Thr Leu Val1 5<210>60<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0619免疫原性肽<400>60Cys Leu Ala Glu Asn Ala Phe Ala Gly1 5<210>61<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0705免疫原性肽<400>61Lys Ile Glu Glu Val Gln Thr Pro Leu1 5<210>62<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0705免疫原性肽<400>62Ala Leu Lys Gly His Gln Leu Thr Leu1 5<210>63<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0705免疫原性肽<400>63Gln Met Ala Glu Ala Ala Asp Leu Val1 5<210>64<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)
<223>CPN0796免疫原性肽<400>64Phe Met Gly Ala His Val Phe Ala Ser1 5<210>65<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0796免疫原性肽<400>65Leu Leu Ile Gln His Ser Ala Lys Val1 5<210>66<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0796免疫原性肽<400>66Phe Leu Cys Pro Phe Gln Ala Pro Ser1 5<210>67<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0796免疫原性肽
<400>67Phe Gln Ala Pro Ser Pro Ala Pro Val1 5<210>68<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0796免疫原性肽<400>68Ala Met Asn Ala Cys Val Asn Gly Ile1 5<210>69<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0796免疫原性肽<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>
<400>69Phe Met Gly Ile Gln Val Leu His Leu1 5<210>70<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0796免疫原性肽<400>70Arg His Ala Ala Gln Ala Thr Gly Val1 5<210>71<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0796免疫原性肽<400>71Phe Gln Tyr Ala Asp Gly Gln Met Val1 5<210>72<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0796免疫原性肽<400>72Ser Val Ser Ala Met Gly Asn Phe Val1 5<210>73<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)
<223>CPN0796免疫原性肽<400>73Phe Leu Ser Tyr Arg Ser Gln Val His1 5<210>74<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0796免疫原性肽<400>74Phe Leu Leu Thr Ala Ile Pro Gly Ser1 5<210>75<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0796免疫原性肽<400>75Val Leu Thr Pro Trp Ile Tyr Arg Lys1 5<210>76<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0796免疫原性肽
<400>76Ser Val Val Met Asn Gln Gln Pro Leu1 5<210>77<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0796免疫原性肽<400>77Ser Leu Lys Asn Ser Gln Gln Gln Leu1 5<210>78<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0796免疫原性肽<400>78Met Leu Pro Asp Thr Leu Asp Ser Val1 5<210>79<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0796免疫原性肽<400>79
Ala Leu Pro Tyr Thr Glu Gln Gly Leu1 5<210>80<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0796免疫原性肽<400>80Val Leu Ser Gly Phe Gly Gly Gln Val1 5<210>81<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽<400>81Leu Leu Phe Gly Val Val Phe Gly Val1 5<210>82<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽<400>82Ser Leu Gln Glu Arg Tyr Pro Thr Leu
1 5<210>83<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽<400>83Met Leu Leu Lys Gly Gln Asn Lys Val1 5<210>84<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽<400>84Phe Thr Phe Leu Pro Ile Ile Leu Val1 5<210>85<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽<400>85Phe Leu Gly Asp Ile Ser Ser Gly Ala1 5
<210>86<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽<400>86Phe Leu Ala Gly Lys Lys Ala Arg Val1 5<210>87<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽<400>87Leu Leu Asp Ala Ala Tyr Gln Arg Ala1 5<210>88<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽<400>88Tyr Leu Gly Tyr Leu Phe Thr Phe Leu1 5<210>89
<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽<400>89Tyr Leu Phe Thr Phe Leu Pro Ile Ile1 5<210>90<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽<400>90Ser Leu Gly Ala Thr His Phe Leu Pro1 5<210>91<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽<400>91Glu Leu Ile Asp Gln Gly His Arg Leu1 5<210>92<211>9<212>PRT
<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽<400>92Phe Leu Pro Ile Ile Leu Val Leu Leu1 5<210>93<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽<400>93Leu Val Leu Leu Phe Val Tyr Leu Val1 5<210>94<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽<400>94Val Thr Gly Pro Ala Thr Pro Gln Leu1 5<210>95<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体
<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽<400>95Ser Leu Glu Lys Gln Asp Pro Glu Val1 5<210>96<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽<400>96Ile Leu Met Ala Ala Thr Asn Arg Pro1 5<210>97<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽<400>97Leu Thr Gln Glu Thr Asp Thr Glu Ala1 5<210>98<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合
<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽<400>98Met Leu Leu Asp Ala Ala Tyr Gln Arg1 5<210>99<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽<400>99Leu Leu Asn Glu Ala Ala Leu Leu Ala1 5<210>100<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽<400>100Glu Leu Tyr Asp Gln Leu Ala Val Leu1 5<210>101<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽
<400>101Leu Ile Gly Lys Tyr Leu Ser Pro Val1 5<210>102<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽<400>102Ser Leu Gly Gly Arg Ile Pro Lys Gly1 5<210>103<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽<400>103Gly Met Ser Pro Gln Leu Gly Asn Val1 5<210>104<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽
<400>104Leu Leu Ala Ala Arg Lys Asp Arg Thr1 5<210>105<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽<400>105Val Thr Phe Ala Asp Val Ala Gly Ile1 5<210>106<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽<400>106Val Leu Thr Glu Pro Leu Val Val Thr1 5<210>107<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0998免疫原性肽<400>107
Lys Ile Ala Leu Asn Asp Asn Leu Val1 5<210>108<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN1016免疫原性肽<400>108Lys Leu Gly Ala Ile Val Phe Gly Leu1 5<210>109<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN1016免疫原性肽<400>109Tyr Leu Gly Asp Glu Ile Leu Glu Val1 5<210>110<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN1016免疫原性肽<400>110Phe Leu Pro Thr Phe Gly Pro Ile Leu1 5
<210>111<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN1016免疫原性肽<400>111Ser Leu Gln Asn Phe Ser Gln Ser Val1 5<210>112<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN1016免疫原性肽<400>112Phe Thr Asp Glu Gln Ala Val Ala Val1 5<210>113<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN1016免疫原性肽<400>113Ser Leu Asn Asp Tyr His Ala Gly Ile1 5
<210>114<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN1016免疫原性肽<400>114Arg Met Ile Phe Thr Gln Asp Glu Val1 5<210>115<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN1016免疫原性肽<400>115Thr Gln Gln Ala Arg Leu Gln Leu Val1 5<210>116<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN1016免疫原性肽<400>116Ser Leu Val Ala Pro Leu Ile Pro Glu1 5<210>117<211>9
<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN1016免疫原性肽<400>117Tyr Met Val Pro Tyr Phe Trp Glu Glu1 5<210>118<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN1016免疫原性肽<400>118Tyr Val Glu Ala Val Lys Thr Ile Val1 5<210>119<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN1016免疫原性肽<400>119Phe Thr Gln Asp Glu Val Ser Ser Ala1 5<210>120<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体
<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN1016免疫原性肽<400>120Gly Ala Gly Gly Phe Val Phe Gln Val1 5<210>121<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN1016免疫原性肽<400>121Leu Leu Gly Phe Ala Gln Val Arg Pro1 5<210>122<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0412免疫原性肽<400>122Arg Leu Glu Glu Val Ser Gln Lys Leu1 5<210>123<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0412免疫原性肽<400>123Leu Thr Thr Asp Thr Pro Pro Val Leu1 5<210>124<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0412免疫原性肽<400>124Lys Leu Leu Asp Met Glu Gly Tyr Ala1 5<210>125<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0412免疫原性肽<400>125Val Leu Ser Glu Asp Pro Pro Tyr Ile1 5<210>126<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)
<223>CPN0412免疫原性肽<400>126Ala Leu Gln Ser Tyr Cys Gln Ala Tyr1 5<210>127<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0412免疫原性肽<400>127Lys Leu Thr Gln Thr Leu Val Glu Leu1 5<210>128<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0412免疫原性肽<400>128Phe Val Gly Ala Cys Ser Pro Glu Ile1 5<210>129<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0412免疫原性肽
<400>129Asn Leu Thr Thr Asp Thr Pro Pro Val1 5<210>130<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0412免疫原性肽<400>130Leu Met Glu Arg Ala Ile Pro Pro Lys1 5<210>131<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0661免疫原性肽<400>131Lys Met Ala Glu Val Gln Lys Leu Val1 5<210>132<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0661免疫原性肽
<400>132Ala Leu Gly Met Gln Gly Met Lys Glu1 5<210>133<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0661免疫原性肽<400>133Lys Leu Ser Arg Thr Phe Gly His Leu1 5<210>134<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0661免疫原性肽<400>134Leu Leu Ile Phe Glu Ile Asn Leu Ile1 5<210>135<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0661免疫原性肽<400>135
Val Leu Ala Thr Val Ala Leu Ala Leu1 5<210>136<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0661免疫原性肽<400>136Ile Leu Leu Pro Leu Gly Gln Thr Ile1 5<210>137<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0661免疫原性肽<400>137Val Leu Tyr Ile His Pro Asp Leu Ala1 5<210>138<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>HOMOLOGY<222>(1)..(9)<223>Homolog to CT541免疫原性肽<400>138Leu Val Leu Ala Thr Val Ala Leu Ala
1 5<210>139<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0681免疫原性肽<400>139Tyr Met Leu Pro Ile Phe Thr Ala Leu1 5<210>140<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0681免疫原性肽<400>140Leu Leu His Glu Phe Asn Gln Leu Leu1 5<210>141<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0681免疫原性肽<400>141Val Leu Gln Arg Glu Leu Met Gln Ile1 5
<210>142<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0681免疫原性肽<400>142Pro Leu Gln Ala His Leu Glu Met Val1 5<210>143<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0681免疫原性肽<400>143Arg Leu Phe Gly Gln Ser Pro Phe Ala1 5<210>144<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0681免疫原性肽<400>144Gly Leu Phe Met Pro Ile Ser Arg Ala1 5<210>145
<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0681免疫原性肽<400>145Lys Leu Ala His Arg Ile Asn Met Thr1 5<210>146<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0681免疫原性肽<400>146Tyr Leu Trp Leu Gln Val Ile Arg Arg1 5<210>147<211>9<212>PRT<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0681免疫原性肽<400>147Thr Leu Leu His Glu Phe Asn Gln Leu1 5<210>148<211>9<212>PRT
<213>肺炎衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0681免疫原性肽<400>148Phe Gly Gln Ser Pro Phe Ala Pro Leu1 5<210>149<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT149免疫原性肽<400>149Phe Leu Gly Ala Ala Pro Ala Gln Met1 5<210>150<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221> 结合<222>(1)..(9)<223>CT149免疫原性肽<400>150Phe Leu Gly Ile Gln Asp His Ile Leu1 5<210>151<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体
<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CPN0681免疫原性肽<400>151Leu Leu Thr Ala Asn Gly Ile Ala Val1 5<210>152<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT149免疫原性肽<400>152Ser Leu Pro Arg Arg Ile Pro Val Leu1 5<210>153<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT149免疫原性肽<400>153Gly Leu Gln Glu His Cys Arg Gly Val1 5<210>154<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合
<222>(1)..(9)<223>CT149免疫原性肽<400>154Ser Leu Gly Cys His Thr Thr Ile His1 5<210>155<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT149免疫原性肽<400>155Ile Leu Thr His Phe Gln Ser Asn Leu1 5<210>156<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT149免疫原性肽<400>156Val Leu Ser Cys Gly Tyr Asn Leu Val1 5<210>157<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT149免疫原性肽
<400>157Leu Leu Lys Glu Ile Cys Ala Thr Ile1 5<210>158<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT149免疫原性肽<400>158Arg Leu Phe Leu Gly Ala Ala Pro Ala1 5<210>159<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT149免疫原性肽<400>159Ala Thr Val Ala Lys Tyr Pro Glu Val1 5<210>160<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT149免疫原性肽
<400>160Leu Leu Ser Gly Ser Gly Phe Ala Ala1 5<210>161<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT149免疫原性肽<400>161Leu Thr Ala Asn Gly Ile Ala Val Ala1 5<210>162<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT149免疫原性肽<400>162Ser Gly Phe Ala Ala Pro Val Glu Val1 5<210>163<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT500免疫原性肽<400>163
Phe Met Ile Ser Gly Pro Val Val Val1 5<210>164<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT500免疫原性肽<400>164Ala Leu Phe Gly Glu Ser Ile Gly Val1 5<210>165<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT500免疫原性肽<400>165Ser Leu Glu Asn Ala Ala Ile Glu Val1 5<210>166<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT500免疫原性肽<400>166
Leu Met Gly Ala Thr Asn Pro Lys Glu1 5<210>167<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT500免疫原性肽<400>167Arg Ile Ala Ala Met Lys Met Val His1 5<210>168<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT671免疫原性肽<400>168Ala Leu Val Glu Thr Pro Met Ala Val1 5<210>169<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT671免疫原性肽<400>169Phe Cys Gly Ala Asn Leu Thr Leu Val1 5
<210>170<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT671免疫原性肽<400>170Ser Leu Lys Ala Arg Gln Leu Asn Leu1 5<210>171<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT671免疫原性肽<400>171Gln Leu Thr Glu Ala Thr Gln Leu Val1 5<210>172<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT671免疫原性肽<400>172Asp Leu Gln Trp Val Glu Gln Leu Val1 5
<210>173<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT671免疫原性肽<400>173Ile Val Leu Asp Asn Ser Asn Thr Val1 5<210>174<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合G<222>(1)..(9)<223>CT841免疫原性肽<400>174Leu Leu Phe Gly Val Ile Phe Gly Val1 5<210>175<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT841免疫原性肽<400>175Leu Leu Ala Lys Gly Gln Asn Lys Val1 5<210>176<211>9
<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT841免疫原性肽<400>176Phe Thr Phe Met Pro Ile Ile Leu Val1 5<210>177<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合G<222>(1)..(9)<223>CT841免疫原性肽<400>177Phe Leu Gly Asp Val Ser Ser Gly Ala1 5<210>178<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT841免疫原性肽<400>178Leu Leu Asp Ala Ala Tyr Gln Arg Ala1 5<210>179<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体
<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT841免疫原性肽<400>179Gly Met Ser Asp His Leu Gly Thr Val1 5<210>180<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合G<222>(1)..(9)<223>CT841免疫原性肽<400>180Ser Leu Gly Ala Thr His Phe Leu Pro1 5<210>181<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT841免疫原性肽<400>181Asn Leu Ala Ala Leu Glu Asn Arg Val1 5<210>182<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体
<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT841免疫原性肽<400>182Tyr Leu Phe Thr Phe Met Pro Ile Ile1 5<210>183<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合G<222>(1)..(9)<223>CT841免疫原性肽<400>183Phe Pro Thr Ala Phe Phe Phe Leu Leu1 5<210>184<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT841免疫原性肽<400>184Ile Leu Met Ala Ala Thr Asn Arg Pro1 5<210>185<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT841免疫原性肽<400>185Lys Thr Ala Leu Asn Asp Asn Leu Val1 5<210>186<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合G<222>(1)..(9)<223>CT841免疫原性肽<400>186Leu Leu Asn Glu Ala Ala Leu Leu Ala1 5<210>187<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT841免疫原性肽<400>187Glu Leu Tyr Asp Gln Leu Ala Val Leu1 5<210>188<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)
<223>CT841免疫原性肽<400>188Ala Leu Glu Lys Gln Asp Pro Glu Val1 5<210>189<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合G<222>(1)..(9)<223>CT841免疫原性肽<400>189Ser Leu Gly Gly Arg Ile Pro Lys Gly1 5<210>190<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT841免疫原性肽<400>190Phe Met Pro Ile Ile Leu Val Leu Leu1 5<210>191<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT841免疫原性肽
<400>191Leu Leu Ala Ala Arg Lys Asp Arg Thr1 5<210>192<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合G<222>(1)..(9)<223>CT841免疫原性肽<400>192Val Thr Phe Ala Asp Val Ala Gly Ile1 5<210>193<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT841免疫原性肽<400>193Tyr Thr Ile Ser Pro Arg Thr Asp Val1 5<210>194<211>9<212>PRT<213>沙眼衣原体<220>
<221>结合<222>(1)..(9)<223>CT841免疫原性肽
<400>194Leu Ile Gly Ala Pro Gly Thr Gly Lys1 权利要求
1.一种用于鉴定由胞内细菌分泌的蛋白质的方法，该方法包括下列步骤1)用胞内细菌感染宿主细胞，2)标记存在于被感染细胞中的胞内细菌，3)制备a)被感染细胞的全细胞裂解物b)纯化并裂解的得自被感染细胞的细菌，4)对i)得自步骤3a)的全细胞裂解物和ii)得自步骤3b)的被纯化和裂解的细菌的2D-凝胶电泳蛋白质图形进行比较，5)检测得自步骤4)的蛋白质斑点，其存在于全细胞裂解物中，而不存在于被纯化的细菌内或者在被纯化的细菌内的含量明显降低，6)鉴定步骤5)选择的斑点中的蛋白质。
2.一种用于鉴定由胞内细菌分泌的蛋白质的方法，该方法包括下列步骤1)用胞内细菌感染宿主细胞，2)脉冲标记存在于被感染细胞中的胞内细菌，3)制备在步骤2)后的不同追踪时间以后的被感染细胞的全细胞裂解物，4)比较在步骤3)中进行了不同时间的追踪以后制备的全细胞裂解物的2D-凝胶电泳蛋白质图形，5)检测得自步骤4)的蛋白质斑点，其含量随着步骤3)中的追踪时间的增加而降低，6)鉴定步骤5)选择的斑点中的蛋白质。
3.一种用于鉴定由胞内细菌分泌的蛋白质的方法，该方法包括下列步骤1)用胞内细菌感染宿主细胞，2)分别在有和没有蛋白质酶体抑制剂存在的条件下培养所述的宿主细胞，3)对分别在有和没有蛋白质酶体抑制剂存在的条件下培养的被感染细胞内的胞内细菌进行标记，4)制备被感染细胞的全细胞裂解物，5)对分别在有和没有蛋白质酶体抑制剂存在的条件下培养的被感染细胞的全细胞裂解物的2D-凝胶电泳蛋白质图形进行比较，6)检测得自步骤5)的蛋白质斑点，其存在于在有蛋白质酶体抑制剂存在下培养的全细胞裂解物中，但不存在于在没有蛋白质酶体抑制剂存在下培养的全细胞裂解物中，或者在没有蛋白质酶体抑制剂存在下培养的全细胞裂解物中的含量明显降低，7)鉴定步骤6)选择的斑点中的蛋白质。
4.权利要求1-3中的任一项所述的方法，进一步包括下列步骤1)获得抗权利要求1-3中任意一项鉴定的来自所述胞内细菌的蛋白质的抗体，2)利用步骤1)中获得的抗体对被所述细菌感染的细胞的全细胞裂解物进行2D-PAGE免疫印迹，3)检测步骤2)中反应的蛋白质斑点，4)鉴定步骤3)选择的斑点中的蛋白质。
5.一种用于鉴定由胞内细菌分泌的蛋白质的方法，包括权利要求1至4所述方法的组合。
6.权利要求1-5中的任一项所述的方法，其中所述标记使用了放射性手段如[35S]半胱氨酸、[35S]蛋氨酸、[14C]标记的氨基酸或其组合。
7.权利要求1-6中的任一项所述的用于鉴定蛋白质的方法，其中全长的蛋白质或其免疫原性片段适于包含在免疫原性组合物中和/或适用于诊断目的。
8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中鉴定方法是基于Edman降解法或任何质谱方法，诸如MALDI TOF MS(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-Of-Flight MassSpectrometry)、ESI Q-TOF MS(Electrospray Ionisation QuadrupoleTime-Of-Flight Mass Spectrometry)、PSD-MALDI MS(Post SourceDecay MALDI Mass Spectrometry)或这些方法的组合。
9.权利要求1-8中的任一项所述的方法，其中蛋白质于鉴定前通过化学方法如溴化氰处理或羟胺处理进行裂解，或者通过利用任何合适的酶如胰蛋白质酶、slymotrypsin、胰凝乳蛋白质酶或胃蛋白质酶或其组合物的酶促方法进行裂解。
10.权利要求1-9中的任一项所述的方法，其中所述胞内细菌是兼性胞内细菌或专性胞内细菌。
11.权利要求10所述的方法，其中所述细菌来源于衣原体属如肺炎衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉衣原体或猫心衣原体，包括这些衣原体的任何特异血清型或株。
12.权利要求11所述的方法，其中所述胞内细菌是沙眼衣原体。
13.权利要求11所述的方法，其中所述胞内细菌是肺炎衣原体。
14.权利要求1-13中的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是无限增殖化细胞系，诸如HeLa、Hep2、McCoy或U937，从哺乳动物供体得到的或通过尸解得到的初级细胞系，遗传修饰的细胞系或器官细胞培养物。
15.权利要求14所述的方法，其中宿主细胞被遗传修饰成过表达或抑制与衣原体疫苗研制相关的基因，诸如编码蛋白质酶体亚单位的基因或其它编码与MHC I型提呈有关的具有重要功能的蛋白质的基因。
16.权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞在用胞内细菌感染前或感染过程中经IFN-γ处理。
17.权利要求2或4-16中任一项所述的方法，其中使用了蛋白质酶体抑制剂如MG132、MG262、MG115、环氧霉素、PSI和clasto-Lactacystin-β-内酯或其组合物。
18.权利要求1-17中任一项所述的方法鉴定的蛋白质或其免疫原性片段。
19.权利要求18所述的蛋白质或其免疫原性片段，其适于包含在免疫原性组合物中和/或适用于诊断目的。
20.权利要求19所述的蛋白质，其含有T-细胞表位，该表位是以MHC-I型或II型限制性抗原形式进行提呈的候选物，适于包含在免疫原性组合物中。
21.权利要求20所述的蛋白质，其含有T-细胞表位，该表位是以MHC-I型限制性抗原形式进行提呈的候选物，适于包含在免疫原性组合物中。
22.权利要求18-21中的任一项所述的沙眼衣原体蛋白质或其免疫原性片段，具有表1所列蛋白质DT1-DT77之一的pI和Mw特征，测量平均误差为+/-10％。
23.权利要求18-21中的任一项所述的沙眼衣原体蛋白质或其免疫原性片段，其由如表IIIA中给出的相应的基因号被确定为CT017(基因名称CT017)、CT044(基因名称ssp)、CT243(基因名称lpxD)、CT263(基因名称CT263)、CT265(基因名称accA)、CT286(基因名称clpC)、CT292(基因名称dut)、CT407(基因名称dksA)、CT446(基因名称euo)、CT460(基因名称SWIB)、CT541(基因名称mip)、CT610(基因名称CT610)、CT650(基因名称recA)、CT655(基因名称kdsA)、CT668(基因名称CT668)、CT691(基因名称CT691)、CT734(基因名称CT734)、CT783(基因名称CT783)、CT858(基因名称CT858)、CT875(基因名称CT875)或ORF5(基因名称ORF5)，或由基因名称DT8而得到确定。
24.权利要求18-21中的任一项所述的沙眼衣原体蛋白质或其免疫原性片段，具有表IV所列蛋白质DT1、DT2、DT3、DT5、DT9、DT10、DT11、DT13、DT14、DT17、DT47、DT59、DT60、DT61或DT62之一的pI和Mw特征，测量平均误差为+/-10％。
25.权利要求22所述的沙眼衣原体蛋白质或其免疫原性片段，选自蛋白质DT4(基因名称CT858)、DT23(基因名称mip)、DT47、DT48(基因名称CT858)、DT75、DT76(基因名称CT691)和DT77(基因名称CT263)。
26.权利要求18-21中的任一项所述的肺炎衣原体蛋白质或其免疫原性片段，具有表II所列蛋白质CP1-CP91之一的pI和Mw特征，测量平均误差为+/-10％。
27.权利要求18-21中的任一项所述的肺炎衣原体蛋白质或其免疫原性片段，其由如表IIIB所列的相应的基因号被确定为CPN0152(基因名称CPN0152)、CPN0702、CPN0705(基因名称CPN0705)、CPN0711(基因名称CPN0711)、CPN0796(基因名称CPN0796)、CPN0998(基因名称ftsH)、CPN0104(基因名称CPN0104)、CPN0495(基因名称aspC)、CPN0684(基因名称parB)、CPN0414(基因名称accA)、CPN1016(基因名称CPN1016)、CPN1040(基因名称CPN1040)，CPN0079(基因名称rl10)、CPN0534(基因名称dksA)、CPN0619(基因名称ndk)、CPN0711(基因名称CPN0711)、CPN0628(基因名称rs13)、CPN0926(基因名称CPN0926)、CPN1016(基因名称CPN1016)CPN1063(基因名称tpiS)或CPN0302(基因名称lpxD)。
28.权利要求26所述的肺炎衣原体蛋白质或其免疫原性片段，选自蛋白质CP34(基因名称CPN1016)、CP37(基因名称CPN0998)、CP46(基因名称CPN0796)、CP47(基因名称CPN0705)、CP52(基因名称CPN0152)、CP63(基因名称CPN1016)和CP75(基因名称ndk)。
29.沙眼衣原体多肽或其免疫原性片段，其特征在于它是DT8，并含有下列序列(SEQ ID NO1)MQHTIMLSLENDNDKLASMMDRVVAASSSILSASKDSESNRQFTISKAPDKEAPCRVSYVAASALSE
30.蛋白质，其与权利要求18-29中的任一项所述的蛋白质或其免疫原性片段具有至少40％序列相同性、优选地至少60％、更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、进一步更优选地90％、以及最优选地至少95％的序列相同性。
31.一种蛋白质或其免疫原性片段，其含有权利要求18-30中的任一项所述的蛋白质的至少7个连续氨基酸。
32.权利要求31所述沙眼衣原体蛋白质或其免疫原性片段，其含有选自SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.45序列的氨基酸序列。
33.权利要求32所述的沙眼衣原体蛋白质的肺炎衣原体同系物或其免疫原性片段，其含有选自SEQ ID NO.122-SEQ ID NO.148序列的氨基酸序列。
34.权利要求31所述的肺炎衣原体蛋白质或其免疫原性片段，其含有选自SEQ ID NO.46-SEQ ID NO.121序列的氨基酸序列。
35.权利要求34所述的肺炎衣原体蛋白质的沙眼衣原体同系物或其免疫原性片段，其含有选自SEQ ID NO.149-SEQ ID NO.194序列的氨基酸序列。
36.一种核酸化合物，其含有编码权利要求18-35中的任一项所述的蛋白质或其免疫原性片段的序列。
37.一种核酸化合物，其含有编码权利要求29所述多肽的序列。
38.权利要求37所述的核酸化合物，其含有下列序列(SEQ IDNO2)ATGCAACACACAATTATGCTGTCTTTAGAGAACGATAATGATAAGCTTGCTTCTATGATGGATCGAGTTGTTGCTGCGTCATCAAGCATTCTTTCTGCTTCCAAAGATTCTGAGTCCAATAGACAGTTTACTATTTCTAAAGCTCCGGATAAAGAAGCTCCTTGCAGAGTATCTTATGTAGCTGCAAGTGCACTTTCAGAATAG或其片段或其简并序列。
39.含有权利要求36-38中的任一项所述的核酸化合物的载体。
40.用权利要求39的载体转化或转染的宿主细胞。
41.权利要求18-35中的任一项所述的蛋白质或其免疫原性片段用于生产抗所述蛋白质或片段的抗体的用途。
42.一种用于生产抗胞内细菌的抗体的方法，其中权利要求18-35中的任一项所述的蛋白质或其免疫原性片段被施用于生产动物，从中纯化抗体。
43.通过权利要求42所述的方法获得的抗体。
44.药物或诊断组合物，其含有权利要求18-35中的任一项所述的蛋白质或其片段、权利要求43所述的抗体或权利要求36-38中的任一项所述的核酸化合物。
45.权利要求18-35中的任一项所述的蛋白质或其片段、权利要求43所述的抗体或权利要求36-38中的任一项所述的核酸化合物在制备诊断试剂中的用途。
46.一种用于鉴定胞内细菌分泌蛋白质上的T-细胞表位的方法，包括步骤诸如对通过权利要求1-17中的任一项所述的方法鉴定的蛋白质或其免疫原性片段进行计算机预测、MHC型分子结合试验和/或ELISPOT试验。
47.通过权利要求46所述的方法获得的肽表位，该肽表位可以是表面提呈的。
48.一种肽表位，其含有权利要求18-31中的任一项所述的蛋白质的4至25个连续氨基酸、优选地6至15个氨基酸、以及最优选地7至10个氨基酸。
49.一种肽表位，其含有沙眼衣原体或衣原体p的7至10个连续氨基酸。
50.一种肽表位，其含有具有序列SEQ ID NO1的多肽的4至25个连续氨基酸、优选地6至15个氨基酸以及最优选地7至10个氨基酸。
51.权利要求47所述的沙眼衣原体肽表位，其含有选自SEQ IDNO.3-SEQ ID NO.45序列的氨基酸序列。
52.权利要求51的沙眼衣原体肽表位的肺炎衣原体肽表位，其含有选自SEQ ID NO.122-SEQ ID NO.148序列的氨基酸序列。
53.权利要求47所述的肺炎衣原体肽表位，其含有选自SEQ IDNO.46-SEQ ID NO.121序列的氨基酸序列。
54.权利要求53所述的肺炎衣原体肽表位的沙眼衣原体肽表位，其含有选自SEQ ID NO.149-SEQ ID NO.194序列的氨基酸序列。
55.权利要求47-54中的任一项所述的肽表位，其特征在于它是融个蛋白质的一部分。
56.权利要求47-54中的任一项所述的肽表位，其特征在于它缀合载体部分。
57.一种核酸化合物，其特征在于它含有编码权利要求47-56中的任一项所述的肽表位的序列。
58.含有权利要求57所述的核酸化合物的载体。
59.用权利要求58所述的载体转化或转染的宿主细胞。
60.权利要求47-56中的任一项所述的肽表位用于制备免疫原性组合物的用途。
61.免疫原性组合物，其含有权利要求47-56中的任一项权利要求所述的肽表位，该免疫原性组合物任选地含有药用赋形剂。
62.权利要求18-35中的任一项所述的蛋白质、权利要求43所述的抗体、权利要求36-38或57中的任一项所述的核酸化合物或权利要求47-56中的任一项所述的肽表位在制备用于治疗或预防由胞内细菌引起的感染的药物组合物中的用途。
63.权利要求22-35中的任一项所述的蛋白质、权利要求43所述的抗体、权利要求36-38或57中的任一项所述的核酸化合物或权利要求47-56中的任一项所述的肽表位在制备用于治疗或预防由衣原体引起的感染的药物组合物中的用途。
64.权利要求18-35中的任一项所述的蛋白质、权利要求43所述的抗体、权利要求36-38或57中的任一项所述的核酸化合物、或权利要求47-56中的任一项权利要求所述的肽表位在制备用于检测胞内细胞菌或抗胞内细菌的抗体的诊断试剂中的用途。
65.权利要求22-35中的任一项所述的蛋白质、权利要求43所述的抗体、权利要求36-38或57中的任一项所述的核酸化合物、或权利要求47-56中的任一项所述的肽表位在制备用于检测衣原体或抗衣原体的抗体的诊断试剂中的用途。
66.在人体内诱导免疫应答的方法，包括对所述人体施用一种免疫有效量的权利要求18-35中的任一项所述的蛋白质、权利要求43所述的抗体、权利要求36-38或57中的任一项所述的核酸化合物、或权利要求47-56中的任一项所述的肽表位。
67.权利要求66所述的的方法，用于治疗或预防由胞内细菌引起的人体或动物感染。
68.权利要求66-67中任一项所述的方法，其中胞内细菌源自衣原体属。
69.权利要求68所述的方法，其中胞内细菌是沙眼衣原体。
70.权利要求68所述的方法，其中胞内细菌是肺炎衣原体。
71.生产权利要求18-35中的任一项所述的蛋白质或其片段的方法，其包括用权利要求39所述的载体转化、转染或感染宿主细胞以及在使得宿主细胞能够表达所述蛋白质或其片段的条件下培养所述的宿主细胞。
72.一种生产权利要求47-54中的任一项所述肽表位的方法，其包括用权利要求58所述的载体转化、转染或感染宿主细胞以及在使得宿主细胞能够表达所述肽表位的条件下培养所述的宿主细胞。
全文摘要
本发明涉及一种新型组合方法，该方法能够鉴定由胞内细菌通过任意分泌途径分泌的蛋白质。本发明进一步提供了由这些方法鉴定的蛋白质。已知分泌蛋白质是适于包含于免疫原性组合物中和/或用于诊断目的的候选物。本发明还提供了来源于被鉴定的分泌蛋白质的肽表位(T－细胞表位)以及编码所述蛋白质的核酸化合物。本发明进一步包括所述蛋白质或其片段的多种应用，诸如药物和诊断应用。
文档编号G01N33/68GK1531653SQ02809114
公开日2004年9月22日 申请日期2002年4月9日 优先权日2001年4月9日
发明者阿兰·克里斯蒂安·肖, 布赖恩·伯格·旺达赫尔, 伯格 旺达赫尔, 阿兰 克里斯蒂安 肖 申请人:阿兰·克里斯蒂安·肖, 布赖恩·伯格·旺达赫尔, 阿兰 克里斯蒂安 肖