专利名称：无细胞蛋白质合成用胚芽的分选和无细胞蛋白质合成用胚芽提取物的制造方法
技术领域：
本发明涉及无细胞蛋白质合成用胚芽的分选和无细胞蛋白质合成用胚芽提取物的制造方法，并且详细介绍了高效率制造高合成效率无细胞蛋白质合成用胚芽提取物所需胚芽的分选方法，用该分选方法所得胚芽来制造胚芽提取物的方法，以及由该制造方法所得到的胚芽提取物。
背景技术：
在细胞内发生的蛋白质合成反应是按照下列工序进行的，首先是从具有遗传信息的DNA中将其信息复制给mRNA，然后核糖体将此mRNA的信息转换，进行蛋白质合成。把细胞内的蛋白质合成在试管内等生物体以外进行的方法，例如将核糖体从生物体内提取出来，然后用这些核糖体在试管内进行无细胞蛋白质合成，现在对此方法的研究非常盛行(特开平6-98790号公报，特开平6-225783号公报，特开平7-194号公报，特开平9-291号公报，特开平7-147992号公报等)。在这些方法中，核糖体的原料使用了大肠杆菌、胚芽、家兔网状红血球等。
无细胞蛋白质合成类是非常有用的，它在钛合成反应速度和转换反应的正确性上保持了与活细胞相匹配的性能，并且可以不用实施复杂的精细工程就可以得到目标蛋白质。因此，为了将该合成类更好地利用于产业上，已经公布了几项关于提高合成效率的发明。但是，为了提高对产业的有用性，不单单是合成效率，还需要使合成类中所使用的各种物质在保持稳定的高品质的同时，保持大量供给。
传统上，关于无细胞类蛋白质合成效率低下的现象，主要可以考虑以下三个原因，即(1)伴随着从生物体提取细胞液的操作蛋白质合成因子活性降低、(2)在体外合成反应中，参与蛋白质合成的各种因子活性和基质浓度降低、(3)上述(1)和(2)所产生的结果复合起来造成转换活性降低等。
A.S.Spirin等报告了在以传统的方法调制的无细胞蛋白质合成类中，通过介于限外过滤膜连续供给原料氨基酸和ATP、GTP(连续式无细胞类)，成功使得反应时间持续20小时以上，达到了超越传统20倍的蛋白质合成收量。(A.S.Spirin et al.(1988)，Science，242，1162-1164)。还有，横山等在含有浓缩大肠杆菌提取液的反应溶液中，使用透析膜尝试连续式无细胞合成，以反应类每1ml 3～5mg的高收量成功地合成了CAT和Ras等较小分子的蛋白质(木川等、第21届日本分子生物学会、WID6)这些成果表明了上述(2)的基质浓度降低是无细胞类蛋白质合成效率低下现象的原因之一。换句话说，也可以说明在防止氨基酸和能源下降的同时(反应中的基质浓度下降是因为有混在这些基质的代谢酶群的参与)，通过排除AMP和GMP等代谢物的积蓄，使得蛋白质合成效率提高。
另一方面，从对蓖麻种子中含有的细胞毒素蛋白质蛋白酶的核糖体非活性化原理的研究，说明了植物产生的一群抗病毒蛋白质和蛋白酶A链是同一RNA N-糖甙(Y.Endo et al.(1988)Biochem.Biophys.Acta，954，224-226)。这种酶是一种核糖体非活性化酶，它作用于核糖体，其RNA(大肠杆菌为23SrRNA，真核生物为28SrRNA)的肽链伸长因子对结合特定部位存在的一个N-糖甙结合的加水分解起催化作用，所以此反应的结果是，核糖体由于一个分子的腺嘌呤的分解造成肽链伸长功能消失。(Y.Endo.et al.(1992)，TIBS，17，266-269)。小麦种子的胚乳里大量存在着名叫三苯甲基的RNA N-糖甙(W.K.Roberts et al.(1989)Biochemistry，18，2615-2621)。还有，众所周知作为抗菌物质被离析的名叫硫堇的蛋白质以小麦为首广泛分布于植物界中，最近证实了小麦硫堇局部存在于胚乳中，以及因为这种蛋白质阻碍转换开始反应，所以强烈阻碍蛋白质合成(J.Brummer et al.(1994)Eur.J.Biochem，219，425-433，P. Hughes et al.(1997)Plant Physiol.，114，1568)。并且，小麦种子的胚乳中含有高浓度的RNA分解酶、DNA分解酶、蛋白质分解酶等。
以前，无细胞蛋白质合成用小麦胚芽的调制都是根据埃里克松、布罗贝尔等人(A.H.Erikson and G.Blobel(1983)，Methods in Enzymol.，96，38-50)的方法进行的，不过，这种方法混入含有白质合成阻碍物质的胚乳是不可避免的。
因此，作为上述(1)的改善手段，特开平7-203984号公报中登载了以下蛋白质合成方法，即在无细胞蛋白质合成系统中，通过抑制活性阻碍因子的活性使得反应效率提高的方法，这些活性阻碍因子是伴随细胞破坏所诱发的，是阻碍核酸合成以及蛋白质合成活性的一种因子。在此公报中作为抑制活性阻碍因子活性的，列举了将其从蛋白质合成系统中去除和在蛋白质合成系统中阻碍其活性的手段，不过一般考虑到从蛋白质合成系统中有选择的去除活性阻碍因子非常困难，所以推荐使用特异阻碍剂的方法。具体一点就是，通过三苯甲基抗体来抑制小麦胚芽中存在的名叫三苯甲基的阻碍因子。
还有，在特开平2000-236896号公报中登载了可以通过机械、化学的处理方法来更好的去除上述阻碍小麦种子胚乳中局部存在的蛋白质合成反应的内因性特异阻碍物质。在这种方法中，为了得到不含胚乳的胚芽，可以在水溶液中进行超声波处理。
从植物种子中取得无细胞蛋白质合成用细胞提取物通常是按下列方法进行，即通过对植物种子的粉碎、筛选、重液分选、目视等取得去除种皮、胚乳碎片的粗胚芽碎片，再通过洗净去除胚乳成分后进行粉碎提取分离。
但是，由于植物种子粉碎物中混有胚芽、细小种皮碎沫、胚乳等所以通过目视等方法很难只分选到胚芽，并且还要花费大量的时间，所以要想在短时间内取得大量的胚芽是很困难的。
发明内容
本发明的目的是为工业性高效率制造无细胞蛋白质合成类中使用的细胞提取物，以提供在短时间内从植物种子中取得大量胚芽的方法。
本发明者等人为了达成上述课题锐意商讨的结果得出，根据胚芽的光学信息分选胚芽、比如说使用色彩分选机和图片分选机来分选胚芽，就可以有效得到高纯度的植物种子胚芽，这样用这种胚芽碎片就可以有效制造无细胞蛋白质合成用胚芽提取物。本发明就是根据这些想法形成的。
也就是说根据本发明(1)可以提供无细胞蛋白质合成用胚芽的分选方法，该分选方法以下列内容为特征即从通过对植物种子施加机械力得到的胚芽和胚乳破碎物的混合物中，根据胚芽的光学信息来进行胚芽分选。
根据这点发明的乐观形态可以提供以下方法，(2)光学信息指色彩信息上述(1)中所提到、(3)根据光学信息进行胚芽分选通过色彩分选机来进行上述(1)中所提到、(4)色彩分选机至少是有以下功能的装置，即对粗胚芽碎片进行光照射、检验出粗胚芽碎片的反射光或者透过光、检验值与基准值相比较、以此来分选去除基准内的或者偏离基准的上述(1)中所提到。
还有，根据这点发明的另一乐观形态可以提供以下方法，(5)光学信息指图片信息上述(1)中所提到、(6)根据光学信息进行胚芽分选通过图片分选机来进行上述(1)中所提到、(7)图片分选机至少是具有以下功能的装置，即取得植物种子破碎物片的图像数据、通过所得数据来辨别植物种子破碎物片的形状、根据所得形状的不同来分选去除基准内的或者偏离基准的上述(6)中所提到、(8)形状的不同指植物种子破碎物片的面积、外周长、圆度、伸长度等方面的不同(7)中所提到。
根据本发明的另外一方面，(9)可以提供胚芽提取物的制造方法，该方法包括植物种子的粉碎、植物胚芽的分选、洗净、微粉碎、以及提取工序，其特征是植物胚芽的分选是根据胚芽的光学信息来进行的。
根据这点发明的乐观形态可以提供下列方法(10)光学信息指色彩信息上述(9)中所提到、(11)根据光学信息进行胚芽分选通过色彩分选机来进行上述(9)中所提到、(12)色彩分选机至少是有以下功能的装置，即对粗胚芽碎片进行光照射、检验出粗胚芽碎片的反射光或者透过光、检验值与基准值相比较、以此来分选去除基准内的或者偏离基准的上述(11)中所提到、(13)光学信息指图片信息上述(9)中所提到。
另外，根据这点发明的另一乐观形态可以提供下列方法，(14)根据光学信息进行胚芽分选通过图片分选机来进行上述(9)中所提到、(15)图片分选机至少是具有以下功能的装置，即取得植物种子破碎物片的图像数据、通过所得数据来辨别植物种子破碎物片的形状、根据所的形状的不同来分选去除基准内的或者偏离基准的上述(14)中所提到、(16)形状的不同指植物种子破碎物片的面积、外周长、圆度、伸长度等方面的不同(15)中所提到。
根据这些发明的形态(17)可以提供(1)～(16)中所提到的任意一种方法，植物种子指小麦、大麦、或者是水稻的种子。
并且，根据本发明的另一方面，(18)可以提供由上述(9)～(16)所提到的任何方法所制造的无细胞蛋白质合成用胚芽提取物。
图1是表示小麦种子胚乳的RGB辉度的频率分布(卤灯照射下)。图中，纵轴表示度数，横轴表示辉度。
图2是表示小麦种子胚芽的RGB辉度的频率分布(卤灯照射下)。图中，纵轴表示度数，横轴表示辉度。
图3是表示小麦种子种皮的RGB辉度的频率分布(卤灯照射下)。图中，纵轴表示度数，横轴表示辉度。
图4是一例模式化的从粗胚芽碎片中分选胚芽的装置概略图。图中符号1表示粗胚芽碎片供给方法、2表示粗胚芽碎片、3表示传送带、4表示光源、5表示CCD传感器、6表示吸引喷嘴。
图5是用CCD照相机下拍摄到的小麦种子胚芽的照片。
图6是用CCD照相机下拍摄到的胚芽以外的粉碎物的照片。
图7是分析用图片处理装置模式化的概略图。图中，符号7表示CCD照相机、8表示透镜、9表示样品、10表示载片、11表示照明、12表示图片处理用计算机。
图8表示实施例1和3中所得胚芽以及胚芽以外的粉碎物的圆度和伸长度。
具体实施例方式
适用于本发明中的种子，并没有任何特别的限制只要可以得到胚芽即可，一般用从小麦、大麦、水稻等稻科植物中所选的植物种子来举例说明。其中，以非常适合的植物种子小麦为例来说明。
本发明，从植物种子中取得以无损伤胚芽为主要成分的胚芽碎片。在这里，所谓的无损伤胚芽是指至少还具有发芽能力的胚芽，胚芽碎片是指以无损伤胚芽为主要成分，利用它可以进行无细胞蛋白质合成所用的细胞提取物的调制。由于植物种子中含有的胚芽量比较少，所以为了有效从种子中得到胚芽，最好是尽量去除胚芽以外的部分。一般，首先是通过对植物种子施加机械力得到含有胚芽、胚乳破碎物、种皮破碎物的混合物，然后从该混合物中去除胚乳破碎物和种皮破碎物得到粗胚芽碎片。这里，所谓的粗胚芽碎片是指以胚芽为主要成分，含有胚乳破碎物和种皮破碎物的混合物。给植物种子所施加力的强度只要是能将胚芽从植物种子中分离出来即可。
一般，使用众所周知的粉碎装置，通过粉碎植物种子，得到含有胚芽、胚乳破碎物和种皮破碎物的混合物。
植物种子的粉碎，可以使用一般众所周知的粉碎装置，但是最好使用轧棍、轧锤等对被粉碎物有冲击力类型的装置。粉碎的程度，根据所使用的植物种子胚芽的大小适当选择即可。比如用小麦种子的情况，一般粉碎大小，最长4mm以下、最好是长2mm以下。另外最好是干式粉碎。
接着是从得到的植物种子粉碎物中，用一般公认的分离装置，例如用筛子取得粗胚芽碎片。例如，用小麦种子时，通常取得的粗胚芽碎片，网眼尺寸是0.5mm～2.0mm最好是0.7mm～1.4mm。并且，根据需要，可以通过利用风力和静电去除所得粗胚芽碎片中含有的种皮、胚乳以及杂质等。
本发明，是从上述所得粗胚芽碎片中，根据胚芽的光学信息比如色彩信息和图片信息来分选胚芽。根据胚芽的光学信息进行胚芽的分选，可以使用比如根据色彩进行分选的色彩分选机和根据图片进行分选的图片分选机。这样，可以使胚芽碎片更加精纯。从种子粉碎物中也可以根据胚芽的光学信息进行胚芽的分选，但是由于种子粉碎物中含有大量的胚芽以外的成分，效率很低，所以最好是从胚芽碎片中分选。
首先，就使用根据胚芽的色彩信息进行分选的色彩分选机的方法作一说明。
粗胚芽碎片，比如小麦种子粗胚芽碎片的情况，如图1～3所示例如由于胚乳和胚芽的RGB辉度的频率分布不同，所以可以利用这点不同来区分胚乳和胚芽。这里，RGB是分别对应光的3种原色红(Red)绿(Green)蓝(Blue)。所谓的辉度是颜色信息的表现方式就像有RGB模型一样，是彩色摄像机和计算机图表系统所采用的方式，是通过把色彩信息分解到R，G，B的各成分中时分别用辉度表现出来。辉度一般是8比特，也就是说可以从0到255共有256个阶调来表示。图1是将胚乳、图2是将胚芽、图3是将种皮分别用彩色CCD照相机拍摄，就适当拍摄区域内的各画素分解到RGB各成分中，得到辉度的频率分布。胚芽和胚乳相比整体上辉度的分布比较低，尤其是蓝色的辉度分布特别低。这说明蓝色光大部分被胚芽所吸收。作为结果胚芽看起来是蓝色的补色黄色。所以，在蓝色光的照射下，胚芽和胚乳的辉度差异变大。这样，比如胚芽和胚乳的色彩差异从RGB辉度的频率分布不同中检验出来，根据这些就可以分选出胚芽和胚乳。还有，胚芽与种皮相比较就RGB所有成分来说辉度呈现高分布，所以，如果用白色光照射，辉度测试卡辉度会呈现差异，但是从胚芽和种皮绿色辉度差最高这一点来说，使用绿色光照射二者辉度差将更明显。或者，由于胚芽和种皮红色的辉度分布也能看出差别，所以使用绿色光和红色光的混合色即黄色光时两者的辉度差会变大。
本发明中可以使用的色彩分选机，使用什么装置都无所谓，只要具有利用色彩的不同来分选胚芽的功能即可。例如，可以举出至少有以下功能的装置，给粗胚芽碎片提供光照射，可以检测出来自于粗胚芽碎片的反射光或者透过光，检测值和基准值可以相比较，可以分选去除基准值之内的或偏离基准值的。
照射光可以使用可是光或者红外光。光源可以使用白热灯、荧光灯、卤灯等。
检测反射光或者透过光可以使用CCD传感器、硅辐透传感器、锗辐透传感器和InGaAs震裂传感器等受光传感器。
实际上构成分选机除了上述功能以外，还需要粗胚芽碎片的运送装置，因此，例如可以使用利用倾斜靠重力运送的滑行道或者是传送带。
例如，把粗胚芽碎片放到传送带上供给，可以给传送带运送中的粗胚芽碎片或者从传送带一端放出的粗胚芽碎片照射光，还可以对从供给口落下的粗胚芽碎片照射光。光源的种类、背景色(使用传送带时是传送带的颜色，使用背景时是背景的颜色)、还有受光传感器的种类，可根据要分选的种子的种类或者要去除的东西(胚芽或胚芽以外的东西)来适当选择。例如说，去除种皮时，可以采用和胚芽同程度辉度和色彩的背景色(比如米黄色)，可以采用绿色系或黄色系(比如灯泡)的光源。还有，去除胚乳时，可以采用比胚芽深的背景色和蓝色系的光源。
根据从粗胚芽碎片检测出的反射光或者透过光，比较检测值和基准值，可以判断对象物是应该分选的还是应该去除的。根据这个判断，粗胚芽碎片接受分选去除，这样就可以得到去除了胚芽以外部分的胚芽碎片。检测值和基准值相比较的装置可以使用其本身已知的。
作为分选去除基准值之内的或偏离基准值的手段比如可以采取空气等流体的喷射或者吸引来实施分选去除的方法。
图4是一例模式化的从粗胚芽碎片中分选胚芽的装置概略图。在图4中1表示粗胚芽碎片供给方法、2表示粗胚芽碎片、3表示传送带、4表示光源、5表示CCD传感器、6表示吸引喷嘴。例如，从粗胚芽碎片供给装置1中供给到传送带3上，通过对由传送带3运送中的粗胚芽碎片2照射光，再通过CCD传感器5检测出反射光，检测值和基准值相比较后通过吸引喷嘴6去除出偏离基准值的东西，来进行胚芽的分选。
小麦胚芽纵长2mm，横宽1mm，厚约0.5mm，重约0.5～0.6mg非常小非常轻。所以，为了提高分选精度最好采用下列方法，把粗胚芽碎片供给到传送带上，对由传送带一般是以5～100m/分，最好是10～90m/分的速度运送中的粗胚芽碎片进行光照射，来进行分选。另外，虽然传送带上供给的粗胚芽碎片量没有特别的限制，但是供给量的下限是一般是10粒/m2，最好是1000粒/m2，上限是1000粒/m2，更好是7000粒/m2，最好是1000～5000粒/m2。这样，可以提高分选精度。
吸引去除尽量要在短时间瞬间内完成，这样可以避免对去除物周边的胚芽的误吸引，可以提高分选精度。这时的吸引力，比如说可以用电磁阀门通过给喷射器供给空气压就可以产生。喷射器的动作时间也就是电磁阀门的打开时间要求尽量要短，给电磁阀门的打开信号通常是0.5～10毫秒，最好是0.5～2毫秒。另外还需要使用应答速度快的电磁阀门。
胚芽的分选方法，比如首先，从粗胚芽碎片中去除种皮等比胚芽颜色深的东西，然后去除胚乳等比胚芽浅的东西。这些操作也可以按相反的顺序进行，这些操作也可以多次重复进行。另外也可以只分选回收胚芽。
然后，就使用根据胚芽的图片信息进行分选的图片分选机的方法作一说明。
由于胚芽比胚芽以外的部分要坚硬，所以上述粉碎处理时胚芽以外的部分被粉碎，胚芽却未被粉碎而保持原状被分离出来。
本发明，从如上面所述得到含有胚芽、胚乳破碎物和种皮破碎物的粗胚芽碎片中，使用图片分选机根据形状的不同来分选胚芽。从种子粉碎物中可以分选胚芽，但是由于种子粉碎物中含有大量胚芽以外的成分，效率很低，所以最好从粗胚芽碎片中来分选。
粗胚芽碎片，比如小麦种子的情况，如图5和图6所示胚芽和胚芽以外的粉碎物由于其形状不同，利用从这些不同所获得的光学信息即图片信息，可以分辨胚芽和胚乳。
图5是将胚芽、图6是将胚芽以外的粉碎物分别用CCD照相机拍摄的。胚芽与胚芽以外的粉碎物相比比较接近椭圆形状。所以把根据形状的不同所得光学信息的不同，例如，作为面积、外周长、圆度、伸长度等图片信息的不同来判别，这样就可以来分选胚芽和胚芽以外的粉碎物。
本发明中可以使用的色彩分选机，可以为任何装置，只要具有根据形状的不同来分选胚芽的功能即可。比如，可以列举出图片分选机至少是具有以下功能的装置，即取得植物种子破碎物片的图像数据、通过所得数据来辨别植物种子破碎物片的形状、根据所得形状的不同来分选去除基准值内的或者是偏离基准值的。
具体来说，比如，将胚芽供给到传送带上，对由传送带运送中的粗胚芽碎片照射由白帜灯，荧光灯、卤灯等发出的可视光或者红外光，粗胚芽碎片的反射光或者透过光通过CCD传感器、CMOS传感器等受光传感器取得图片数据。光源的种类、背景色(使用传送带时是传送带的颜色，使用背景时是背景的颜色)、还有受光传感器的种类，可根据要分选的种子的种类或者要去除的东西(胚芽或胚芽以外的东西)来适当选择容易辨别形状差异的组合。
从所得到的图片数据来辨别植物种子粉碎物形状的差异。所得到的图片数据通过图片处理求得表示形状验出值，通过将此验出值与提前设定好的基准值相比较来辨别形状的不同。作为表示形状的验出值可以列举出面积、外周长、圆度、伸长度。辨别装置可以使用其本身已知的。
比如，使用适当的计算机系统，针对所的图片数据进行2进制处理以及实行喷嘴去除后，例如通过探测解析处理等解析手段来演算圆度和伸长度。根据探测解析处理圆度和伸长度分别可以按如下公式来求取。
这里，上述图片处理(图像解析处理)可以使用市场上销售的软件，比如National Instruments公司制作的计测、控制软件[LabVIEW 6.0版本]和LabVIEW用的置位图片处理工具[MAQ版本6.0.1]。探测解析的详细内容在IMAQ Vision使用说明书[IMAQ Vision Concept Manual](October2000 Edition)中的第九章[Binary Morphology]、第十章[Particle Manual]中有记载。
上述解析处理演算的圆度越是接近于圆形越接近1。伸长度越是细长形状值越大。
预先求得胚芽的圆度和伸长度，其值作为基准值和验出值相比较。面积、外周长、圆度、伸长度等表示形状的验出值可以单独应用，通过多变量解析组和应用更加提高分选精度。
为了适用多变量解析，可以按下列顺序进行。预先对复数的胚芽以及应该去除的胚芽以外的碎片进行探测解析，用所得m种类的验出值作下列回归式(3)。作为验出值，可以是一些值组合起来，例如除了上述的面积、外周长、圆度、伸长度以外，还有探测范围的最长轴、等面积椭圆长轴、动水半径或者是这些值的四则运算(比如说等面积椭圆长轴/等面积椭圆单轴)所得值等。
Y＝A0+A1×验出值1+A2×验出值2+…+Am×验出值m(3)这里的回归式(3)中，Y假如是已经进行了探测解析的样品，进行回归胚芽为1、胚芽以外的为0，来求得各验出值的重复A1～Am以及定数项A0。回归的方法可以用所知的线性重复回归，但是如果用所知的PLS部分最小2次方的话可以进一步提高分选的精度。
决定A0～Am后，对未知样品进行探测解析，从上述回归式(3)中求取Y值，因为其样品如果是胚芽将显示接近1的数值、如果不是胚芽将显示接近0的数值，所以可以进行分选。
根据上述方法所得形状的差异，通过分选去除基准值之内的或偏离基准值的，这样就可以得到去除胚芽以外部分的胚芽碎片。
作为分选去除基准值之内的或偏离基准值的方法，可以使用通过空气等流体的喷射或吸引来实施分选排除的方法。
具有上述功能的装置，例如以与图4表示的一例模式化的从粗胚芽碎片中分选胚芽的相同装置为例。在图4中1表示粗胚芽碎片供给方法、2表示粗胚芽碎片、3表示传送带、4表示光源、5表示CCD传感器、6表示吸引喷嘴。例如，从粗胚芽碎片供给装置1中供给到传送带3上，通过对由传送带3运送中的粗胚芽碎片2照射光，再通过CCD传感器5取得图片数据，从图片数据中所得检测值和基准值相比较后通过吸引喷嘴6吸引去除出偏离基准值的东西，来进行胚芽的分选。
如前面所述，小麦胚芽纵长2mm，横宽1mm，厚约0.5mm，重约0.5～0.6mg非常小非常轻。所以，为了提高分选精度最好采用下列分选方法，把粗胚芽碎片供给到传送带上，对由传送带一般是以5～100m/分，最好是10～90m/分的速度运送中的粗胚芽碎片进行光照射，来进行分选。另外，虽然传送带上供给的粗胚芽碎片量没有特别的限制，但是供给量的下限是一般是10粒/m2，最好是1000粒/m2，上限是1000粒/m2，更好是7000粒/m2，最好是5000粒/m2左右。供给量的具体范围通常是10～10000粒/m2，更好是1000～7000粒/m2，最适当的是1000～5000粒/m2左右。这样，可以提高分选精度。
根据需要这些操作也可以多次重复进行。另外也可以只分选回收胚芽。
如前面所述，吸引去除尽量在短时间瞬间内完成，这样可以避免对去除物周边的胚芽的误吸引，可以提高分选精度。这时的吸引力，比如说可以用电磁阀门通过给喷射器供给空气压就可以产生。喷射器的动作时间也就是电磁阀门的打开时间要求尽量要短，给电磁阀门的打开信号通常是0.5～10毫秒，最好是0.5～2毫秒。另外还需使用应答速度快的电磁阀门。
如上所讲，根据胚芽的光学信息可以有效地大量地净化分选胚芽。
这样所得的胚芽碎片中，有时候会沾有胚乳成分，所以通常为了实行胚芽净化，最好进一步进行洗净处理。
洗净处理，一般是在10℃以下，最好是在4℃以下的冷却水中或者水溶液中使胚芽碎片分散·悬浊，最好一直洗到洗净液变成白浊为止。或者，更好的是一般在10℃以下，最好是在4C以下的界面活性剂中使胚芽碎片分散·悬浊，最好一直洗到洗净液变成白浊为止。所使用界面活性剂最好是非离子性的界面活性剂，其中，比较适合的比如有聚氧化乙烯诱导体Brij、氚核(Triton)、Nonidet P40、Tween。其中最适合的是NonidetP40。这些非离子性界面活性剂可以按0.5％左右的浓度使用。
用水或水溶液的洗净处理以及用界面活性剂的洗净处理，这两种任何一种都可以，两者都实施也可以。还有，这些洗净处理和超声波处理组合起来实施也可以。
以上所得胚芽通过洗净、微粉碎、以及提取处理就可以得到胚芽提取物。取得胚芽提取物的方法，可以按传统公认的方法进行。例如，将液体氮所冷冻的胚芽微粉碎，加入提取溶剂搅拌后，通过将胚芽提取物含有液进行离心分离便可回收。然后根据需要通过凝胶过滤来精制也可以。
提取溶剂可以使用含有缓冲液、钾离子、镁离子以及硫醇基酸化防酸剂的水溶液。另外，根据需要可以再添加一些钙离子、L型氨基酸等。比如，提取溶剂可以使用含有N-2-水凝胶二乙烯二胺-N’-2-乙烷磺基酸(HEPES)-KON、醋酸钾、醋酸镁、L型氨基酸以及硫磺内脂的溶液，或者是部分改变Patterson等人方法的溶液((HEPES)-KON、醋酸钾、醋酸镁、氢化钙、L型氨基酸以及硫磺内脂的溶液)。提取溶剂中各成分的组成、浓度其本身已知，只要使用在无细胞蛋白质合成用胚芽的制造法中一般通用的即可。
凝胶过滤可以预先在溶液(含有(HEPES)-KON、醋酸钾、醋酸镁、硫磺内脂以及L型氨基酸的溶剂)中进行平衡，然后使用已放置好的凝胶过滤装置来进行。凝胶过滤溶液中各成分的组成、浓度都是本身已知的，只要使用在无细胞蛋白质合成用胚芽的制造法中一般通用的即可。
凝胶过滤可以预先在溶液(含有(HEPES)-KON、醋酸钾、醋酸镁、硫磺内脂以及L型氨基酸的溶剂)中进行平衡，然后再使用已放置好的凝胶过滤装置来进行。凝胶过滤溶液中各成分的组成、浓度都是本身已知的，只要使用在无细胞蛋白质合成用胚芽的制造法中一般通用的即可。
凝胶过滤后的胚芽提取物含有液中，有时候会混入微生物、特别是线状菌(霉)等的孢子，最好是去除这些微生物。特别是长时间的(1天以上)无细胞蛋白合成反应中可以看到微生物的繁殖，所以阻止它很重要。微生物的去除手段没有特别的规定，不过最好用过滤灭菌过滤器。过滤器的孔径尺寸一般是0.1至1微米、最好是0.2至0.5微米。顺便讲一下，小部类的枯草菌孢子的尺寸为0.5μm×1μm，所以使用0.20微米的过滤器(例如Sartorius公司生产的MinistartTM等)对于孢子的去除也是很有效的。在过滤时，最好是首先使用孔径较大的过滤器过滤，然后再使用可以去除有可能混入的微生物孔径尺寸的过滤器过滤。
这样所得的细胞提取物，是非常精纯的，是不含胚乳成分的细胞提取物。基本上完全被去除的胚乳成分中含有下列物质，原料细胞自身含有或者存有抑制蛋白质合成功能的物质即三苯甲基、硫堇、RNA分解酶、DNA分解酶、蛋白质分解酶等作用于核糖体抑制其机能的物质。这里所说的不含胚乳成分的细胞提取物是指去除胚乳成分的胚芽提取物，这可以通过核糖体实质上没有被三苯甲基上脱腺嘌呤化来判别。另外，所说的[核糖体实质上没有被脱腺嘌呤化]是指核糖体的脱腺嘌呤率未到7％，希望是1％以下，更好是0.1％，最好是脱腺嘌呤率在验出界限之下。
由无细胞蛋白质合成类所进行的蛋白质合成，除了使用上述方法所得的胚芽提取物这一点外，其它可以以与传统相同的方法来进行。这方法可以是公认的分批法，还可以是前面所提到的斯皮林等人的连续式无细胞蛋白质合成系统的氨基酸、能源的连续供给方法。
分批法因为有时候长时间进行蛋白质合成反应会停止，所以通过使用后者氨基酸、能源连续供给的连续供给法，可以使反应长时间维持，可以更有效率。
另外，用连续供给法进行蛋白质合成时，最好可以使用透析法。比如，使用限外过滤膜透析法，把本发明的胚芽提取物作为透析内液，把含有能源和氨基酸的混合液用作透析外液，可以连续地大量调制蛋白质。透析法中，以透析膜为介能源和氨基酸等的合成基质供给给透析内液，反应副生物等排出到透析外液。透析膜可以使用其本身已知的通常使用的。透析膜的分子量界限可以根据要合成的蛋白质分子量来使用适当的。
这里所说的能源，可以举出腺甙5’-三磷酸(ATP)、鸟甙5’-三磷酸(ATP)、以及磷酸肌酸，氨基酸可以举出20种L型氨基酸。
无细胞类合成的蛋白质，根据需要，也可以通过其本身已知的通常所用方法来从反应系统中进行分离、精制。蛋白质的分离、精制例如通过吸引色层分离法、凝胶过滤色层分离法和离子交换色层分离法等来进行就可以。
下面的实施例将对本发明作进一步的解释，但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域的技术人员在权利要求的范围内所做出的某些改变和调整也应认为属于本实施例1 粗胚芽碎片的调制将北海道产的CHIHOKU小麦种子(未消毒)90kg按1分钟200g的比例添加到磨机(Fritsch公司生产的Rotor Speed Mill pulverisette 14型)中，以7,000rpm的转速将种子柔和地破碎。由于第1次的破碎还残留很多胚芽未被分离的小麦，所以重复进行了4次。通过筛选回收含有具有发芽能力的胚芽的碎片(网眼尺寸0.71mm～1.00mm)后，通过使用扇车的风力分选去除掉种皮等不纯物。然后通过使用四氢化碳和环己烷的混合液[四氢化碳∶环己烷＝2.4∶1(容量比)]的重液分选，将含有具有发芽能力的胚芽的上浮碎片回收，通过室温干燥去除有机溶剂后，再通过使用扇车的风力分选去除种皮等不纯物来得到粗胚芽碎片。通过以上步骤，粗胚芽碎片中胚芽占有的重量比例为6成。
实施例2 RGB彩色空间的色彩信息提取使用KEYENCE公司生产的数码微观测器VH-7000和远距离变焦距镜头对实施例1中所得粗胚芽碎片进行拍摄，取得彩色图片。拍摄条件是卤灯辉度为最大，白色平衡设定为3200K、快门速度为1/120秒、镜头倍数为50倍。
拍摄的图片使用National Instruments公司制作的软件LabVIEW版本6.0和IMAQ Vision版本6.0.1，通过RGB彩色空间进行彩色解析。首先，通过目视从所拍图片中剪切出可以判断为胚芽部分的图片，剪切的图片中含有的全画素作为母集团来演算R，G，B各成分辉度的直方图。胚乳、种皮也以同样的演算直方图，这样就得出图1到图3所显示的结果。
从这些结果上显示出，如[发明实施的形态]中所述，通过适当选择照明等拍摄条件根据色彩信息的差别来分选胚芽是可行的。
实施例3 用色彩分选机进行胚芽分选使用传送带式色彩分选机BLM-300K(制造商株式会社安西制作所、销售商株式会社安西总业)，如下所述，利用色彩的差异来从粗胚芽碎片中分选胚芽。这种色彩分选机的概要，如图4模式所显示的装置相同。
将实施例1中所得粗胚芽碎片大约5000粒/m2供给到米黄色的传送带上，然后用荧光灯给传送带上的粗胚芽碎片进行光照射，检测出反射光。传送带的运送速度为50m/分、受光传感器使用单色的CCD线传感器(2048画素)。
首先，为了从胚芽中去除黑色成分(种皮等)，选用米黄色的传送带，照明选用灯泡色的荧光灯，在胚芽的辉度和种皮的辉度之间设定基准值，偏离基准值的通过吸引去除。将这些重复了6次。接着，为了分选胚乳，分别将传送带换用深绿色，照明换用蓝色的荧光灯，在胚芽的辉度和胚乳的辉度之间设定基准值，偏离基准值的通过吸引去除。这些重复作了7次。吸引去除使用了在传送带的皮带轮前方约1厘米的位置上设置的吸引喷嘴30个(长1厘米左右1个吸引喷嘴所排列的)，是通过将传送带端部放出落下中的种皮或者胚乳吸引的方法来进行。最后通过色彩分选工序破碎变小的胚乳用网眼尺寸为0.71mm的筛子去除。
以上的方法中色彩分选工序用15个小时，得到了重量比为98.3％纯度的小麦胚芽500g。
实施例4 用图片处理来分选胚芽用图7所示的图片处理装置对实施例3中所得胚芽样品123点和实施例1中所得粗胚芽碎片中的胚芽以外的样品83点的形状差异作了评定。
将准备好的胚芽样品或者胚芽以外的样品装到载片上，在超过载片处照射，然后用35万像素单色CCD照相机对样品的影子进行了拍摄。
图5和图6中显示了拍摄图片的例子。
拍摄的图片使用National Instruments公司制作的软件LabVIEW版本6.0和IMAQ Vision版本6.0.1，来进行图片处理。首先进行2进位制处理和去除噪音后，通过探测解析处理演算出了圆度以及伸长度。
越是接近圆的形状圆度就越接近1。越是细长形状伸长度值就越大。
关于胚芽和胚芽以外的所有样品所求得的圆度和伸长度的结果如图8所示。胚芽之间由于形状相似，所以圆度、伸长度都集中在某一范围内。而胚芽以外的样品粉碎时形成了不规则的形状，所以圆度、伸长度都不均衡。利用这个差异，胚芽的分选变得可能。例如，圆度和伸长度如图8所示3条境界线所围成的范围内，胚芽是106样品，胚芽以外的只有3样品。也就是说图片处理前的在粗胚芽碎片中占60％的胚芽纯度经过图片处理分选后可以提高到大约97％。
如果想进一步提高胚芽的纯度，只要使境界线围成的范围变窄小就行，想降低胚芽的纯度提高回收率时，只要使境界线围成的范围变宽大就行。
实施例5 通过目视来进行胚芽的分选从实施例1所得粗胚芽碎片中通过目视进行了判别，使用竹签分选了小麦胚芽。60分钟获得小麦胚芽1g。
实施例6 小麦胚芽提取物含有液的调制将实施例3中所得小麦胚芽碎片悬浊于4℃的蒸馏水中，使用超声波洗净器洗到洗净液变白浊为止。然后悬浊于Nonidet P4的容量比为0.5％的溶液中，使用超声波洗净器洗到洗净液变白浊为止，取得了小麦胚芽。
小麦胚芽提取物含有液的调制，以通常的方法(Erickson，A.H.etal.(1996)Meth.in Enzymol.，96，38-50)为准。以下的操作在4摄氏度进行。首先，将液体氮中冻结的小麦胚芽在乳钵中微粉碎。在所得每1g的粉碎体中加入1ml的把Patterson等人的方法部分改变的提取溶剂(HEPES-KOH(PH7.6)80毫克分子/升、醋酸钾200毫克分子/升、醋酸镁2毫克分子/升、氢化钙4毫克分子/升、L型氨基酸20种各0.6毫克分子/升、以及硫磺内脂8毫克分子/升)中，边注意不要起泡边搅拌。通过15分钟的离心所得30000g上清作为胚芽提取液回收，预先在溶液中((HEPES-KOH(PH7.6)40毫克分子/升、醋酸钾100毫克分子/升、醋酸镁5毫克分子/升、L型氨基酸20种各0.3毫克分子/升、以及硫磺内脂4毫克分子/升)平衡后在交联匍聚糖柱中进行了凝胶过滤。样品浓度调制到了，260nm的光学密度(O.D)为170～250(A260/A280＝1.5)。
实施例7 通过透析法进行连续式小麦胚芽无细胞蛋白质合成连续式小麦胚芽无细胞蛋白质合成是以Endo，Y.et al.，(1992)J.Biotech，25，221-230中记载的方法为准进行的。
将实施例6中所得小麦胚芽提取物含有液放入DISPODIARAIZA(Spectra/PorRCE，MWCO25k，volume0.5ml)中，用反应液10倍容量的透析外液(HEPES-KOH(PH7.6)20毫克分子/升、醋酸钾95毫克分子/升、醋酸镁2.65毫克分子/升、硫磺内脂4毫克分子/升、ATP1.2毫克分子/升，GTP0.25毫克分子/升，肌酸磷酸16毫克分子/升，L型氨基酸20种各0.3毫克分子/升、以及0.005％氮化钠1毫克分子/升)来透析的方法，反应是在20℃条件下进行的。
在以上方法所得条件下，试着进行Green fluorescent Protein(GFP)的合成，观察到490nm励起波长的510nm的荧光，确认了GTP正在合成。
产业上的利用可能性根据本发明的方法，可以有效大量地进行胚芽分选，利用这些胚芽碎片还可以有效制造高品质的胚芽提取物。本发明的方法，蛋白质在无细胞类中的调制，例如，对遗传因子机能解析方面的蛋白质的发现以及进化分子工学领域中调制新酶和抗体等所用的无细胞蛋白质合成用胚芽提取物的制造非常有用。
本申请是基于2001年5月18日的日本专利申请(专利申请号2001-149274、2001-149275)和2002年2月20日的日本专利申请(专利申请号2002-043704)，其内容在这里拿过来作为参考。
权利要求
1.一种无细胞蛋白质合成用胚芽的分选方法，其特征在于，从对植物种子施加机械力得到的胚芽和胚乳破碎物的混合物中，根据胚芽的光学信息来进行胚芽分选。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光学信息即色彩信息。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述根据光学信息进行的胚芽分选是通过色彩分选机进行的。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色彩分选机至少有以下功能的装置，即对粗胚芽碎片进行光照射、检验出粗胚芽碎片的反射光或者透过光、检验值与基准值相比较、以此来分选去除基准内的或者偏离基准的。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光学信息即图片信息。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述根据光学信息进行的胚芽分选，是通过图片分选机进行的。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述图片分选机至少是具有以下功能的装置，即取得植物种子破碎物片的图像数据、通过所得数据来辨别植物种子破碎物片的形状、根据所得形状的不同来分选去除基准内的或者偏离基准的。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述形状的不同是指植物种子破碎物片的面积、外周长、圆度、伸长度等方面的不同。
9.一种无细胞蛋白质合成用胚芽提取物的制造方法，该方法包括植物种子的粉碎、植物胚芽的分选、洗净、微粉碎、以及提取工序，其特征是所述植物胚芽的分选是根据胚芽的光学信息来进行的。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述光学信息即色彩信息。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述根据光学信息进行的胚芽分选通过色彩分选机进行的。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述色彩分选机至少是有以下功能的装置，即对粗胚芽碎片进行光照射、检验出粗胚芽碎片的反射光或者透过光、检验值与基准值相比较、以此来分选去除基准内的或者偏离基准的。
13.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述光学信息即图片信息。
14.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述根据光学信息进行的胚芽分选通过图片分选机进行的。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述图片分选机至少是具有以下功能的装置，即取得植物种子破碎物片的图像数据、通过所得数据来辨别植物种子破碎物片的形状、根据所得形状的不同来分选去除基准内的或者偏离基准的。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述形状的不同是指植物种子破碎物片的面积、外周长、圆度、伸长度等方面的不同。
17.如权利要求1～16任意一项所述的方法，其特征在于，所述植物种子是指小麦、大麦或者水稻的种子。
18.如权利要求9～16中的任何一项的方法所制造出的无细胞蛋白质合成用胚芽提取物。
全文摘要
本发明提供有效制造高效率无细胞蛋白质合成用胚芽提取物胚芽分选方法和无细胞蛋白质合成用胚芽提取物的制造方法。本发明的要旨在于无细胞蛋白质合成用胚芽的分选方法和胚芽提取物的制造方法。其分选方法的特征是从通过对植物种子施加机械力得到的胚芽和胚乳破碎物的混合物中，根据胚芽的光学信息比如色彩信息或者图片信息来进行胚芽分选。其胚芽提取物制造方法的特征是将按以上分选方法所分选的胚芽洗净、微粉碎后进行提取。
文档编号C12P21/02GK1511254SQ0280970
公开日2004年7月7日 申请日期2002年5月16日 优先权日2001年5月18日
发明者远藤弥重太, 岩桥茂雄, 野村一雄, 雄 申请人:远藤弥重太