乳酸菌发酵麦胚提取物的制备方法及其抗肿瘤作用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了乳酸菌发酵麦胚提取物的制备方法及其抗肿瘤作用，属于食品生物【技术领域】。该方法利用从泡菜中筛选的乳酸菌LactobacillusplantarumDy-1，CGMCC?No.6016，作为发酵菌株；优化发酵条件，以获得具有抗肿瘤效果和较高产量的LFWGE；采用该提取物进行了多种人源肿瘤细胞及其荷瘤动物试验，结果表明其提取物具有显著的抑制肿瘤细胞增殖的功能；并对发酵提取物的组成进行了分析，其中富含醌类、糖类、蛋白质和多肽类等。本发明对麦胚进行简单预处理（非高温加热），生产成本低，采用直投式发酵，方便快捷，安全稳定，便于质控。
【专利说明】乳酸菌发酵麦胚提取物的制备方法及其抗肿瘤作用
【技术领域】
[0001]本发明涉及食品生物【技术领域】，特指以小麦胚芽(简称麦胚)为原料，通过乳酸菌发酵，实现营养物质的生物转化，制备具有抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤生长的发酵麦胚提取物(LFWGE)，该发明产品可用于功能性食品或药物的制备。
【背景技术】
[0002]目前，中国因恶性肿瘤导致死亡的人数占全球的1/4，且数量仍在不断攀升。而对于癌症的治疗主要有手术、化疗、放疗及祀向疗法(免疫疗法、基因疗法、血管生成抑制剂及定向疗法)等方式，其副作用仍会给患者带来许多痛苦。因此，开发天然安全、无毒副作用的抗肿瘤活性物质及其功能食品是癌症患者的渴求。
[0003]麦胚是小麦籽粒的生命源泉，占籽粒总重的2%?3%，是小麦制粉加工的副产物之一。其富含优质的蛋白质、脂肪、多种维生素、矿物质及其他一些微量生理活性成分，被营养学家们誉为“人类天然的营养宝库”，因而，麦胚的开发利用一直受到国内外的广泛关注。近年来，在美国、加拿大和日本等国家，麦胚不仅被广泛地加工成各种健康食品，利用微生物发酵麦胚获得具有一定生理功能的提取物已成为新的研究热点，而国内相关研究则相差甚远。
[0004]日本专利(200510069392.8)公开了一种抗肿瘤制剂的制备方法。该方法是将麦胚芽、大豆胚芽、米胚芽等以一定的比例混合，将混合物用110°c热蒸汽加热，并将蒸汽加热产物在30°C下用曲类(小麦曲霉)等发酵48h，所得的发酵提取物具有抗肿瘤效果，其抑制率在5%?15%，该专利未对发酵提取物中的抗肿瘤成分进行分析。
[0005]匈牙利专利(99/08694)公开了一种以2，6_ 二甲氧基对苯醌为活性物质的检测方法及其抗肿瘤产品(Avemar)。该方法是将麦胚粉碎，用商用面包酵母发酵，将上清液进行冷冻干燥或喷雾干燥，以其干燥粉配制成一定浓度的水溶液加入到肿瘤细胞中，能够抑制肿瘤细胞的代谢和转移。并以氯仿或乙醇提取其中的2，6-二甲氧基对苯醌为标志物，采用HPLC进行定量。此外，未对提取物的其它成分进行分析。
[0006]美国专利(2010/135580A2)采用面包酵母对新鲜麦胚进行发酵，将其上清液冷冻干燥成粉，干燥粉用乙醇提取并通过分子筛和电泳等方法获得多肽，相对分子质量在5?100KD之间。采用该范围的多肽进行肿瘤细胞和荷瘤动物试验，具有减少肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞增殖作用。
[0007]上述日本专利是采用小麦曲霉发酵多种胚芽获得的抗肿瘤混合发酵提取物，匈牙利和美国专利则是采用面包酵母发酵麦胚获得的抗肿瘤发酵提取物，而采用乳酸菌发酵麦胚获得抗肿瘤提取物尚未见专利或其他文献报道。
[0008]本发明采用自行分离的乳酸菌和商用酵母菌中筛选出优良的出发菌株，优化发酵条件，以获得具有抗肿瘤效果和较高产量的LFWGE ;采用该提取物进行了多种人源肿瘤细胞及其荷瘤动物试验，结果表明其提取物具有显著的抑制肿瘤细胞增殖的功能；并对发酵提取物的组成进行了分析，其中富含醌类、糖类、蛋白质和多肽类等。
【发明内容】
[0009]本发明提供的是一种以新鲜麦胚为原料，通过乳酸菌发酵，从中提取、分离、纯化获得具有抑制肿瘤细胞增殖活性的LFWGE的制备方法及其应用技术。
[0010]采用乳酸菌发酵麦胚，控制发酵条件，获取发酵提取物，并对其进行分离纯化；采用MTT、细胞凋亡和细胞周期法研究其组分的体外抗肿瘤功能；采用荷瘤裸鼠模型(人源肿瘤细胞)研究该提取物体内抗肿瘤功能；综合评价本发明LFWGE的抗肿瘤特性。
[0011]本发明通过以下步骤实现:
[0012](I)菌种的筛选:从泡菜中筛选出I株乳酸菌(Lactobacillus pi an tarum Dy-1,保藏单位名称:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址:中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号；保藏日期:2012年4月18日；保藏编号=CGMCCN0.6016;分类命名:植物乳杆菌Lactobacillus plantarum),选择其作为发酵菌株；或者是选择商业上已鉴定好的优良乳酸菌(植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus case)一种或几种。
[0013](2)麦胚发酵:称取筛分除杂后的新鲜麦胚，粉碎过30?80目筛，置于锥形瓶中，按照重量比1:6?1:15比例，优选1:7的比例加入蒸馏水，再加入乳酸菌到麦胚中，其中乳酸菌占新鲜麦胚粉的质量为2?8%，混合均匀；将锥形瓶用纱布封口，置于恒温培养箱中，在20?40°C下发酵12?72h，其中优选发酵温度30?35°C，发酵24?48h后，发酵物在室温下 8000 ?15000rpm/min 离心 10 ?40min,其中优选 10000 ?12000rpm/min 离心 20 ?30min;收集上清液，并将其进行热风干燥、喷雾干燥或冷冻干燥，优选冷冻干燥，从而获得到 LFWGE。
[0014]或者进一步按照下述步骤进行:
[0015]LFffGE的分离纯化与分析:采用高效液相(流动相是甲醇与水的比例按照20%?15%,流速为lmL/min,柱温为25°C,检测波长为288nm。)、凝胶过滤层析(SephadexG-50和SurpedexS-200)、SDS-PAGE (5%的浓缩胶，10%?12%的分离胶)等技术对发酵麦胚提取物中的抗肿瘤主要组分进行分离纯化，并通过体外抗肿瘤试验，确证LFWGE中抗肿瘤的主要组分(蛋白质、多肽)。
[0016]上述具有抗肿瘤活性食品的应用
[0017]将本发明的LFWGE以一定的比例直接加入到发酵乳制品以及其他酸性饮料中，制成功能性饮料；也可将其加入固体食品的制作中，如面包、面条、香肠以及饼干等。
[0018]将本发明的LFWGE加入到食品中并无特别的重量要求，加入量一般优选1%?15%，优选4%?10%。
[0019]本发明的优点:
[0020]( I)本发明以小麦制粉过程中的副产物一麦胚为原料，来源广、蕴藏量大，通过对其生物转化，将大大提升小麦加工副产物深加工的水平，引导企业应用现代生物技术生产健康、闻值化的广品。
[0021](2)本发明对麦胚进行简单预处理(非高温加热)，生产成本低，采用直投式发酵，方便快捷，安全稳定，便于质控。[0022](3)本发明利用自主分离的乳酸菌，制备具有抗肿瘤功能的发酵提取物，具有自主知识产权。
[0023](4)本发明对从提取物中的两组蛋白质的抗肿瘤功能进行了研究，确定其低分子量组分具有显著的抗肿瘤功效。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1LFWGE对结肠癌HT-29细胞的生长抑制率，
[0025]图2细胞凋亡图谱，
[0026]图3LFWGE浓度对结肠癌细胞周期的影响，
[0027]图4LFWGE水溶性蛋白SDS-PAGE图谱，
[0028]图5凝胶过滤层析多肽图谱，
[0029]图6LFWGE对荷瘤裸鼠瘤体积的影响，
[0030]图7LFWGE对荷瘤裸鼠肿瘤的抑制率，
[0031]图8荷瘤裸鼠血清肿瘤坏死因子_α含量，
[0032]图9荷瘤裸鼠血清干扰素-Y的含量，
[0033]图10荷瘤裸鼠血清白细胞介素-4的含量。
【具体实施方式】
[0034]下面结合实施例对本发明做进一步阐述。
[0035]体外抗肿瘤功能:将本发明的LFWGE以0.125?4mg/mL的浓度加入到人的HT-29结肠癌细胞中，培养一段时间(如48h)，观察评价其抗肿瘤效果。其方法如下:
[0036]①细胞增殖试验:采用MTT法。
[0037]②细胞凋亡与细胞周期试验:采用流式细胞仪进行分析。
[0038]与未加本发明发酵麦胚提取物的情况相比较，肿瘤活细胞数可降至50%或以下，最优的可使活细胞数降至10%或以下；其肿瘤凋亡率可达50%或以上，最高可达90%或以上。
[0039](5)体内抗肿瘤功能:将4?6周龄的BALB/c裸鼠的腹部皮下接种人结肠癌HT-29细胞(接种量:I X IO6?2 X IO7细胞/裸鼠)，2?15天后肉眼可见裸鼠接种部位有肿瘤长出后开始灌胃；将荷瘤裸鼠随机分成5组，即阴性对照组、5-FU阳性对照组、LFffGE高剂量组、LFffGE低剂量组和LFWGE高剂量组+5-FU组，每组10?12只裸鼠，连续灌胃14?50天；每日测定瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，根据肿瘤重量计算抑瘤率；在试验末期测定荷瘤裸鼠血清中干扰素(IFN-Y )、白介素-4 (IL-4)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的浓度。
[0040]与阴性对照组相比较，灌胃LFWGE组的抑瘤率可达30%?60%。
[0041]实施例1
[0042]称取粉碎的新鲜麦胚粉20.0g于500mL锥形瓶中，向其中加入IOOml的蒸馏水，再加入0.4g的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum Dy-1),混合均勻；将锥形瓶用纱布封口，置于恒温培养箱中在30°C下发酵24h后，将其在12000rpm/min下离心20min收集上清液进行冷冻干燥。
[0043]称取0.5g的冻干粉溶于50ml的去离子水中，过0.22um的滤膜，将滤液按照0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、l.0mg/mL、2.0mg/ml、4.0mg/ml 分别加入到 HT-29 结肠癌细胞中，培养细胞24h、48h、72h，并分别通过MTT法测定LFWGE对结肠癌HT-29细胞的抑制率(图1)。结果表明，提取物浓度与肿瘤细胞增殖抑制率呈正相关，最大抑制率达到94.2%ο
[0044]将1.0mg/mL的LFWGE加入到结肠癌细胞中，培养细胞48h后，收集细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡(图2)。结果表明，早期凋亡是66.5% (图2，右下角)，晚期凋亡是27.6%(图2，右上角)。将0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL的LFWGE加入到结肠癌HT-29细胞中，培养细胞48h后，收集细胞，流式细胞仪检测细胞周期(图3)。结果表明，随着浓度的增加，G1期也随之延长，而S期则随之缩短，说明LFWGE能有效阻滞细胞的G1期。
[0045]实施例2
[0046]取实施例1 中的滤液同样以 0.125mg/mL、0.25mg/ml、0.5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml、4mg/ml分别加入到HT-29结肠癌细胞中，培养细胞24h、48h、72h，并分别通过MTT法测定LFWGE对结肠癌HT-29细胞的抑制率。结果表明，提取物浓度与肿瘤细胞增殖抑制率呈正相关，最大抑制率达到89.6%。
[0047]将lmg/ml的LFWGE加入到SGC-7901细胞中，培养细胞48h后，收集细胞，流式细胞仪检测细胞的凋亡。早期凋亡是48.5%，晚期凋亡是22.4%。将0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml的LFWGE加入到胃癌细胞中，培养细胞48h后，收集细胞，流式细胞仪检测细胞周期。结果表明，随着浓度的增加，G1期也随之延长，而S期则随之缩短，说明LFWGE能有效阻滞细胞的61期。
[0048]实施例3
[0049]IOOg粉碎的新鲜麦胚加入IL的蒸馏水和4g的植物乳杆菌混合均匀，混合物在250rpm的转速下，30°C发酵48h。所得发酵产物进行IOOOOrpm离心15min，上清液被收集并进行冷冻干燥，获得LFWGE冻干粉。利用SDS-PAGE检测LFWGE中水溶性蛋白的分布(图4)。为了分离LFWGE中蛋白成分，采用(NH4) 2S04沉淀法将LFWGE水溶液中的蛋白沉淀析出，沉淀溶解在PBS中，并将所得的溶液通过S印hadexG-50和SurpedexS-200凝胶过滤层析，分别收集到峰I和峰2组分(图5)，并将其冷冻干燥。采用MTT法分别测定了峰I和峰2组分对HT-29细胞的抑制率。结果表明，峰I对HT-29细胞具有显著的抑制率，最大可达到 88.6% (表 I)
[0050]实施例4
[0051]将上述制备的LFWGE溶解于生理盐水中，制备成浓度为0.2g/ml和0.lg/ml水溶液，并且通过无菌膜处理备用。人HT-29结肠癌细胞接种到4-6周龄的BALB/c裸鼠腹部皮下，2 天后采用 2g/kg/d、lg/kg/d、2g/kg/d+5-FU (25mg/kg/d, 1.p, 7 天)剂量的 LFWGE 给荷瘤裸鼠灌胃，连续灌胃30天，同时与灌胃相同剂量的生理盐水组和腹腔注射(25mg/kg/d, 1.p，7天)的5-FU组进行比较，通过测定瘤体积的变化和最后的抑瘤率来确定LFWGE的抗肿瘤效果(图2，3)。结果表明，2g/kg/d、lg/kg/d、2g/kg/d+5-FU LFWGE剂量组的抑瘤率分别达到 49.37%、40.7%, 47.8%。
[0052]用酶联免疫试剂盒测定荷瘤裸鼠血清中肿瘤坏死因子(TNF-α )，干扰素(IFN-Y )，白细胞介素-4 (IL-4)的含量。结果表明，LFWGE可以同时增加IFN-Y、IL-4以及TNF-α的含量(图8，9，10)。从而提高了裸鼠对ΗΤ-29细胞的抑制作用。[0053]表1LFWGE中蛋白分离的各组分对HT-29细胞增殖抑制率
[0054]
【权利要求】
1.乳酸菌发酵麦胚提取物的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行: (1)菌种的筛选:从泡菜中筛选出I株乳酸菌(Lactobacillusplantarum Dy-1,CGMCCN0.6016)，鉴定其功能特性，选择其作为发酵菌株；或者是选择商业上已鉴定好的优良乳酸菌(植物乳杆菌ilactobacillus 短乳杆菌{Lactobacillus嗜酸乳Vi^iLactobacillus 干酪乳杆菌case) 一种或几种； (2)麦胚发酵:称取筛分除杂后的新鲜麦胚，粉碎过30~80目筛，置于锥形瓶中，按照重量比1:6~1:15比例，优选1:7的比例加入蒸馏水，再加入乳酸菌到麦胚中，其中乳酸菌占新鲜麦胚粉的质量为2~8%，混合均匀；将锥形瓶用纱布封口，置于恒温培养箱中，在20~40°C下发酵12~72h，其中优选发酵温度30~35°C，发酵24~48 h后，发酵物在室温下 8000 ~15000rpm/min 离心 10 ~40min,其中优选 10000 ~12000rpm/min 离心 20 ~30min ;收集上清液，并将其进行热风干燥、喷雾干燥或冷冻干燥，优选冷冻干燥，从而获得到 LFWGE。
2.根据权利要求1所述的乳酸菌发酵麦胚提取物的制备方法，其特征在于进一步按照下述步骤进行: LFffGE的分离纯化与分析:采用高效液相，其中流动相是甲醇与水的按照体积比例20%~15%，流速为lmL/min，柱温为25 °C，检测波长为288nm ;柱子为S印hadexG-50和SurpedexS-200的凝胶过滤层析；质量含量为5%的浓缩胶，质量含量为10%~12%的分离胶SDS-PAGE，对发酵麦胚提取物中的抗肿瘤主要组分进行分离纯化得到LFWGE中抗肿瘤的主要组分为蛋白质或多肽。
3.根据权利要求1所述的乳酸菌发酵麦胚提取物的应用，将LFWGE以一定的比例直接加入到发酵乳制品以及其他酸性饮料中，制成功能性饮料；或者将其加入固体食品的制作中，加入量以质量百分比为1%~15 %。
【文档编号】A23L1/172GK103461858SQ201310259726
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年6月26日 优先权日:2013年6月26日
【发明者】董英, 张家艳, 徐斌, 周兴华, 肖香 申请人:江苏大学