一种l-色氨酸工业化生产菌种的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种L-色氨酸工业化生产菌种制备方法，该方法主要步骤为将原始菌种平板划线制备单菌落，将单菌落接入甘油管制备种子瓶，制备冷冻甘油管，取此冷冻甘油管，平板划线，制备单菌落，单菌落转接到斜面上，培养适当的时间，然后用接种环取斜面菌苔一环接入种子培养基中，摇床振荡培养适当的时间，然后接种子罐。该方法克服了生产菌种生长同步性差、活性低、种子瓶、种子罐生长周期长短不一等缺点与不足。本发明所述的菌种制备方法操作简便、制备的菌种活性高，同步化生长好，生长周期稳定，非常适合于L-色氨酸工业化生产。
【专利说明】一种L-色氨酸工业化生产菌种的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物发酵的菌种制备及培养方法，具体地说，涉及一种L-色氨酸工业化生产菌种制备方法。
【背景技术】
[0002]L-色氨酸是重要的营养剂，广泛应用于氨基酸输液、综合氨基酸制剂、营养补充剂、烟酸缺乏症治疗、安神药(调节精神节律、改善睡眠)、食品和饲料添加剂方面，是继蛋氨酸、赖氨酸之后的第三代饲料添加剂，其使用效果是赖氨酸的3~4倍。近年来，随着国内外饲料工业和医药工业的不断发展，L-色氨酸成为一种国际市场发展前景良好、中国市场需求较大的产品。鉴于此，国内外企业争相开发这一产品，发酵水平不断提高。目前种子的制备工艺普遍采用冷冻甘油管制备的种子直接接种子瓶，这种工艺制备的种子使种子瓶、种子罐生长周期不稳定，时长时短，对发酵影响较大，同时菌种的活性不高，同步生长性较差，造成了 L-色氨酸发酵水平提高难和生产水平的不稳定。
【发明内容】
[0003]针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种菌种生长周期稳定的L-色氨酸工业化生产菌种制备方法，该方法获得的菌种应用于L-色氨酸工业化生产，有利于提高产量和维持生产水平的稳定。
[0004]为实现上述目的，本发明采用技术方案包括如下步骤:
[0005]a)冷 冻甘油管制备:取用冷冻真空干燥法制备的冻干菌种管，开封，加入0.1~
1.0mL无菌生理盐水，振荡均匀，制成菌悬液，接种针蘸取，在含有10~IOOppm浓度的四环素平板上划线，置于20~40°C恒温室中培养10~24h，制备单菌落，用接种环挑取单菌落，接入到含有10~IOOppm浓度的四环素甘油管制备培养基中，置于温度20~40°C，振幅25~35mm、转速100~280rpm的摇床上培养10~24h，测定600nm的吸光度值，达到
1.0~10.0时，向其中加入40%的甘油，做成甘油终浓度10~30%的菌悬液，分装到容量为2.0mL的甘油管中，将甘油管置于专用盒中，依次包好纱布和牛皮纸，贴上标签，写好日期、批号，置于_80°C低温冰箱中保藏；
[0006]b)单菌落制备:取步骤a)制备的冷冻甘油管I支，快速解冻，接种针蘸取菌悬液，在含有10~IOOppm浓度的四环素的平板上划线，置于20~40°C恒温室中培养10~24h，即得单菌落；
[0007]c)斜面菌苔制备:用接种环取步骤b)制备的单菌落均匀涂布到含有10~IOOppm浓度的四环素的斜面上，将斜面置于20~40°C恒温室中培养10~24h ；
[0008]d)进罐种子制备:取步骤c)制备的斜面种子，用接种环挑取一环，接入到进罐种子培养基中，置于温度20~40°C，振幅25~35mm、转速100~280rpm的摇床上培养10~24h，600nm测定吸光度值，达到4.0~20.0时，即可进种子罐。
[0009]作为一种优选方案，步骤a)中所述四环素平板培养基的配方为:蛋白胨0.5~2.0%，酵母浸膏0.5~2.0%，氯化钠0.5~2.0%，琼脂粉1.0~2.0%，装液量为:500mL三角瓶装200mL培养基，灭菌前用NaOH调pH至6.5~7.5，灭菌待温度降至40~50°C后，加入四环素母液,使终浓度为10~lOOppm。
[0010]作为一种优选方案，步骤c)中所述的四环素斜面培养基配方为:蛋白胨0.5~2.0%,酵母浸膏0.5~2.0%，氯化钠0.5~2.0%，琼脂粉1.0~2.0%，装液量为:30 X 230mm试管装20~40mL培养基，灭菌前用NaOH调pH至6.5~7.5，灭菌待温度降至40~50°C后,加入四环素母液,使终浓度为10~lOOppm。
[0011]作为一种优选方案，所述甘油管制备培养基的配方为:蛋白胨0.5~2.0%，酵母浸膏0.5~2.0%，氯化钠0.5~2.0%，灭菌前用NaOH调pH至6.5~7.5，装液量为:500mL三角瓶装50~150mL培养基，接种前，加入四环素母液，使终浓度为10~lOOppm。
[0012]作为一种优选方案，所述进罐种子培养基的配方为:葡萄糖1.0~5.0%，酵母浸膏0.5~2.5 %，磷酸氢二钠1.0~3.0 %，磷酸二氢钠0.5~2.0 %，氯化镁0.0I~0.5 %，灭菌前用NaOH调pH至6.5~7.5，装液量为:500mL三角瓶装50~IOOmL培养基，接种前，加入四环素母液,使终浓度为10~lOOppm。
[0013]作为进一步的优选方案，所述四环素母液的制备方法:称取2.0~4.0g四环素晶体，加入到无水乙醇中，用玻璃棒搅拌，待其完全溶解，用无菌水定容到IOOmL,静置20~30分钟，用已灭菌细菌过滤器过滤，即得四环素母液。
[0014]与现有技术相比，本发明所述方法制备的L-色氨酸工业化生产菌种接种进罐种子瓶，生长周期在13h左右，接种种子罐，生长周期在16h左右，解决了采用传统菌种制备方式制得菌种在种子瓶和种子罐 生长周期时长时短、操作时间不固定的问题。因为在生产过程中，员工基本上是按照固定时间来进行工作(如上午10点接进罐种子瓶)，如果种子生长周期不固定，生产过程控制就比较繁琐，劳动效率也不高；同时，由于企业是不间断生产，每个发酵罐的运转周期都是固定的，如果种子罐生长周期不稳定，就会影响到发酵罐的周期，进而影响到发酵水平和产量，造成生产波动。本发明技术方案首先通过单菌落的挑选过程使种子得到纯化；进一步通过斜面菌苔的培养过程，使种子的生长得到同步化；经过纯化、同步化的种子再接进罐种子瓶，得到达到进罐要求的、活性高且性能优异的种子，因此本发明所述生产L-色氨酸菌种，纯度高、生长同步化程度高。本发明L-色氨酸工业化生产菌种的制备方法操作简单、易于工业生产中使用，利于扩大生产规模，从而降低单位生产成本。
【具体实施方式】
[0015]本发明实施例使用的工程菌为大肠杆菌菌株W3110trpEFBK，为利用市售菌株构建的L-色氨酸生产菌，构建方法详见CN201110400855专利。
[0016]本发明实施例中使用的化学及生物试剂均为分析纯或分析纯级别以上。
[0017]实施例1
[0018]①冷冻甘油管制备:取用冷冻真空干燥法制备的冻干管，开封，加入0.1mL无菌生理盐水，振荡均匀，制成菌悬液，接种针蘸取，在含有IOppm浓度的四环素平板上划线，置于20°C恒温室中培养24h，制备单菌落，用接种环挑取单菌落，接入到含有IOOppm浓度的四环素甘油管制备培养基中，置于温度20°C，振幅35mm、转速280rpm的摇床上培养10h，测定600nm的吸光度值，达到1.0时，向其中加入40%的甘油，做成甘油终浓度20%的菌悬液，分装到容量为2.0mL的甘油管中，将甘油管置于专用盒中，依次包好纱布和牛皮纸，贴上标签，写好日期、批号，置于_80°C低温冰箱中保藏；
[0019]②单菌落制备:取新制备冷冻甘油管I支，快速解冻，接种针蘸取菌悬液，在含有IOppm浓度的四环素平板上划线，操作结束后，将平板置于20°C恒温室中培养24h，即得单菌落。
[0020]③斜面菌苔制备:用接种环取步骤②制备好的单菌落均匀涂布到含有IOppm浓度的四环素的斜面(试管尺寸为30X 230mm)上，操作完成后，将斜面置于20°C恒温室中培养24h。
[0021]④进罐种子制备:取斜面菌苔制备的斜面种子，用接种环挑取一环，接入到进罐种子培养基中，置于温度20°C，振幅35mm、转速280rpm的摇床上培养24h，600nm测定吸光度值，达到4.0~20.0时，即可进罐。
[0022]上述甘油管制备培养基的配方为:蛋白胨0.5%，酵母浸膏2.0%，氯化钠0.5%，灭菌前用NaOH调pH至7.5，装液量为:500mL三角瓶装150mL培养基，接种前，加入四环素母液，使终浓度为lOppm。
[0023]上述四环素平板培养基:蛋白胨0.5 %，酵母浸膏2.0 %，氯化钠0.5 %，琼脂粉2.0%,装液量为:500mL三角瓶装200mL培养基，灭菌前用NaOH调pH至7.5，灭菌待温度降至45°C左右，加入四环素母液，使终浓度为lOppm，倒平板，备用；
[0024]上述四环素斜面培养基配方为:蛋白胨0.5 %，酵母浸膏2.0%，氯化钠0.5 %，琼脂粉2.0 %，装液量为:30 X 230mm试管装40mL培养基，灭菌前用NaOH调pH至7.5，灭菌待温度降至45°C左右，加入四环素母液，使终浓度为lOppm，制成斜面，备用。
[0025]上述进罐种子培养基:葡萄糖1.0%，酵母浸膏2.5 %，磷酸氢二钠1.0%，磷酸二氢钠0.5%，氯化镁0.01 %，灭菌前用NaOH调pH至7.5，装液量为:500mL三角瓶装50mL培养基，接种前，加入四环素母液，使终浓度为lOppm。
[0026]种子在进罐种子培养基中生长到OD600mm值为4.0~20.0时所用时间为15h。
[0027]实施例2
[0028]①冷冻甘油管制备:取用冷冻真空干燥法制备的冻干管，开封，加入0.5mL无菌生理盐水，振荡均匀，制成菌悬液，接种针蘸取，在含有50ppm浓度的四环素平板上划线，置于30°C恒温室中培养17h，制备单菌落，用接种环挑取单菌落，接入到含有50ppm浓度的四环素甘油管制备培养基中，置于温度30°C，振幅35mm、转速200rpm的摇床上培养24h，测定600nm的吸光度值，达到5.0时，向其中加入40 %的甘油，做成甘油终浓度30%的菌悬液，分装到容量为2.0mL的甘油管中，将甘油管置于专用盒中，依次包好纱布和牛皮纸，贴上标签，写好日期、批号，置于_80°C低温冰箱中保藏；
[0029]②单菌落制备:取新制备冷冻甘油管I支，快速解冻，接种针蘸取菌悬液，在含有50ppm浓度的四环素平板上划线，操作结束后，将平板置于30°C恒温室中培养17h，即得单菌落。
[0030]③斜面菌苔制备:用接种环取步骤②制备好的单菌落均匀涂布到含有50ppm浓度的四环素的斜面(试管尺寸为30X 230mm)上，操作完成后，将斜面置于30°C恒温室中培养20h。
[0031]④进罐种子制备:取步骤③制备的斜面种子，用接种环挑取一环，接入到进罐种子培养基中，置于温度30°C，振幅25mm、转速200rpm的摇床上培养20h，600nm测定吸光度值，达到4.0~20.0时，即可进罐。
[0032]上述甘油管制备培养基的配方为:蛋白胨1.5%，酵母浸膏1.4%，氯化钠1.5%，灭菌前用NaOH调pH至7.0，装液量为:500mL三角瓶装IOOmL培养基，接种前，加入四环素母液，使终浓度为50ppm。
[0033]上述四环素平板培养基:蛋白胨1.5 %，酵母浸膏1.4%，氯化钠1.5%，琼脂粉1.5%,装液量为:500mL三角瓶装200mL培养基，灭菌前用NaOH调pH至7.0，灭菌待温度降至50°C左右，加入四环素母液，使终浓度为50ppm，倒平板，备用；
[0034]上述四环素斜面培养基配方为:蛋白胨1.5%，酵母浸膏1.4%，氯化钠1.5%，琼脂粉1.5%，装液量为:30 X 230mm试管装30mL培养基，灭菌前用NaOH调pH至7.0，灭菌待温度降至50°C左右，加入四环素母液，使终浓度为50ppm，制成斜面，备用。
[0035]上述进罐种子培养基:葡萄糖3.0%，酵母浸膏2.0%，磷酸氢二钠2.0%，磷酸二氢钠1.65%，氯化镁0.3%，灭菌前用NaOH调pH至7.0，装液量为:500mL三角瓶装75mL培养基，接种前，加入四环素母液，使终浓度为50ppm。
[0036]种子在进罐种子培养基中生长到OD6tltol值为4.0~20.0时所用时间为13h。
[0037]实施例3
[0038]①冷冻甘油管制备:取用冷冻真空干燥法制备的冻干管，开封，加入1.0mL无菌生理盐水，振荡均匀，制成菌 悬液，接种针蘸取，在含有IOOppm浓度的四环素平板上划线，置于38°C恒温室中培养10h，制备单菌落，用接种环挑取单菌落，接入到含有IOOppm浓度的四环素甘油管制备培养基中，置 于温度38°C，振幅25mm、转速IOOrpm的摇床上培养24h，测定600nm的吸光度值，达到10.0时，向其中加入40%的甘油，做成甘油终浓度10%的菌悬液，分装到容量为2.0mL的甘油管中，将甘油管置于专用盒中，依次包好纱布和牛皮纸，贴上标签，写好日期、批号，置于_80°C低温冰箱中保藏；
[0039]②单菌落制备:取新制备冷冻甘油管I支，快速解冻，接种针蘸取菌悬液，在含有IOOppm浓度的四环素平板上划线，操作结束后，将平板置于38°C恒温室中培养10h，即得单菌落。
[0040]③斜面菌苔制备:用接种环取步骤②制备好的单菌落均匀涂布到含有IOOppm浓度的四环素的斜面(试管尺寸为30X230mm)上，操作完成后，将斜面置于38°C恒温室中培养 IOh0
[0041]④进罐种子制备:取步骤③制备的斜面种子，用接种环挑取一环，接入到进罐种子培养基中，置于温度38°C，振幅35mm、转速IOOrpm的摇床上培养10h，600nm测定吸光度值，达到4.0~20.0时(，即可进罐。
[0042]上述甘油管制备培养基的配方为:蛋白胨2.0 %，酵母浸膏0.5%，氯化钠2.0%，灭菌前用NaOH调pH至6.5，装液量为:500mL三角瓶装50mL培养基，接种前，加入四环素母液，使终浓度为lOOppm。
[0043]上述四环素平板培养基:蛋白胨2.0 %，酵母浸膏0.5 %，氯化钠2.0 %，琼脂粉1.8%,装液量为:500mL三角瓶装200mL培养基，灭菌前用NaOH调pH至6.5，灭菌待温度降至40°C左右，加入四环素母液，使终浓度为lOOppm，倒平板，备用；
[0044]上述四环素斜面培养基配方为:蛋白胨2.0 %，酵母浸膏0.5%，氯化钠2.0%，琼脂粉1.8%，装液量为:30X 230mm试管装20mL培养基，灭菌前用NaOH调pH至6.5，灭菌待温度降至40°C左右，加入四环素母液，使终浓度为lOOppm，制成斜面，备用。
[0045]上述进罐种子培养基:葡萄糖5.0%，酵母浸膏0.5%，磷酸氢二钠3.0%，磷酸二氢钠0.5%，氯化镁0.5%，灭菌前用NaOH调pH至6.5，装液量为:500mL三角瓶装IOOmL培养基，接种前，加入四环素母液，使终浓度为lOOppm。
[0046]种子在进罐种子培养基中生长到OD6tltol值为4.0~20.0时所用时间为14h。
[0047]实施例4
[0048]将传统方法制备的进罐种子、实施例1、实施例2和实施3的进罐种子分别接种子罐，各进行三批次的重复试验。达到工艺要求可以接种发酵罐，即OD6tltlnm值为10~30时的培养周期见表1。
[0049]表1不同制备方法制备的进罐种子对种子罐生长周期的影响
[0050]
【权利要求】
1.一种L-色氨酸工业化生产菌种制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤: a)冷冻甘油管制备:取用冷冻真空干燥法制备的冻干菌种管，开封，加入0.1~LOmL无菌生理盐水，振荡均匀，制成菌悬液，接种针蘸取，在含有10~IOOppm浓度的四环素平板上划线，置于20~40°C恒温室中培养10~24h，制备单菌落，用接种环挑取单菌落，接入到含有10~IOOppm浓度的四环素甘油管制备培养基中，置于温度20~40°C，振幅25~35mm、转速100~280rpm的摇床上培养10~24h，测定600nm的吸光度值，达到1.0~10.0时，向其中加入40%的甘油，做成甘油终浓度10~30%的菌悬液，分装到容量为2.0mL的甘油管中，将甘油管置于专用盒中，依次包好纱布和牛皮纸，贴上标签，写好日期、批号，置于_80°C低温冰箱中保藏； b)单菌落制备:取步骤a)制备的冷冻甘油管I支，快速解冻，接种针蘸取菌悬液，在含有10~IOOppm浓度的四环素的平板上划线，置于20~40°C恒温室中培养10~24h，即得单菌落； c)斜面菌苔制备:用接种环取步骤b)制备的单菌落均匀涂布到含有10~IOOppm浓度的四环素的斜面上，将斜面置于20~40°C恒温室中培养10~24h ； d)进罐种子制备:取步骤c)制备的斜面种子，用接种环挑取一环，接入到进罐种子培养基中，置于温度20~40°C，振幅25~35_、转速100~280rpm的摇床上培养10~24h，在600nm测定吸光度值，达到4.0~20.0时，即可进罐发酵。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a)所述四环素平板培养基的配方为:蛋白胨0.5~2.0%，酵母浸膏0.5~2.0%，氯化钠0.5~2.0%，琼脂粉1.0~2.0%,装液量为:500mL三角瓶装200mL培养基，灭菌前用NaOH调pH至6.5~7.5，灭菌待温度降至40~50°C后,加入四环素母液,使终浓度为10~lOOppm。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤c)所述的四环素斜面培养基配方为:蛋白胨0.5~2.0%，酵母浸膏0.5~2.0%，氯化钠0.5~2.0%，琼脂粉1.0~2.0%,液量为:30X230mm试管装20~40mL培养基，灭菌前用NaOH调pH至6.5~7.5，灭菌待温度降至40~50°C后，加入四环素母液，使终浓度为10~lOOppm。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述甘油管制备培养基的配方为:蛋白胨0.5~2.0 %，酵母浸膏0.5~2.0 %，氯化钠0.5~2.0 %，灭菌前用NaOH调pH至6.5~7.5，装液量为:500mL三角瓶装50~150mL培养基，接种前，加入四环素母液，使终浓度为10~lOOppm。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述进罐种子培养基的配方为:葡萄糖1.0~5.0%，酵母浸膏0.5~2.5%，磷酸氢二钠1.0~3.0%，磷酸二氢钠0.5~2.0%,氯化镁0.01~0.5%，灭菌前用NaOH调pH至6.5~7.5，装液量为:500mL三角瓶装50~IOOmL培养基，接种前，加入四环素母液，使终浓度为10~lOOppm。
6.根据权利要求2~5中任一项所述的制备方法，其特征在于四环素母液的制备方法:称取2.0~4.0g四环素晶体，加入到无水乙醇中，用玻璃棒搅拌，待其完全溶解，用无菌水定容到IOOmL,静置20~30分钟，用已灭菌细菌过滤器过滤，即得四环素母液。
【文档编号】C12R1/19GK103614311SQ201310259629
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年6月26日 优先权日:2013年6月26日
【发明者】徐洪利, 左良成, 王文笙, 张建军, 赵体金, 戴晓艳, 宋爱刚, 慕东 申请人:山东鲁抗医药股份有限公司