一种小麦籽粒可溶性提取物中铁和锌化学形态的hplc-icp-ms分析检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析化学检测领域，具体涉及一种小麦籽粒可溶性提取物中铁和锌化 学形态的HPLC-ICP-MS分析检测方法。
【背景技术】
[0002] 通过传统育种和现代分子生物学手段及农艺管理措施提高小麦籽粒(包含面粉） 中铁（Fe)和锌（Zn)的生物有效性是缓解我国人体微量元素营养缺乏现状的有效途径。小 麦籽粒中铁和锌的生物有效性不仅取决于其总养分浓度，同时也取决于铁和锌在籽粒中存 在的化学形态。目前，尚无小麦籽粒中铁和锌化学形态的分析检测方法。这种分形方法的 欠缺便使得研究者无法获知小麦籽粒中具体哪种形态的铁和锌对应较高的生物有效性。如 果能将小麦籽粒中不同形态的铁或锌分离提取，通过将具体某一形态的铁或锌化合物进行 体外消化/Caco-2细胞培养和小白鼠喂养试验便可评价其生物有效性。因此，这种分形方 法的建立能够使我们获知小麦籽粒中哪种具体形态的铁或锌生物活性较高，而且能将其分 离提取，制成产品，有很大的应用价值。总之，这种分形方法的欠缺不能为小麦籽粒铁和锌 富集强化及生物有效性提高途径提供理论基础，极大程度限制了相关领域的研究应用。
[0003] 高效液相色谱-电感耦合等离子体-质谱联用技术（HPLC-ICP-MS)是元素形态定 性和定量分析的有效途径，它融合了高效液相色谱HPLC高效分离的特点及电感耦合等离 子体ICP和质谱MS联用具有的低检测限、宽动态线性范围及能跟踪多元素同位素信号变化 等优点。本发明首次尝试用HPLC-ICP-MS分析检测小麦籽粒可溶性提取物中铁和锌的化学 形态及其含量。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于针对现有技术中存在的上述缺点，提供一种小麦籽粒可溶性提 取物中铁和锌化学形态的HPLC-ICP-MS分析检测方法，本发明提供的检测方法能够将铁的 化学形态明显区分为2~3种，将锌的化学形态区分为2种，并能定量检测各形态的含量。
[0005] 为了实现上述目的，本发明提供的技术方案如下： 一种小麦籽粒可溶性提取物中铁和锌化学形态的HPLC-ICP-MS分析检测方法，包括以 下步骤： 1) 待测样品溶液制备：称取50~150 mg待测小麦粉，再加入7 mL Tris-HCl缓冲液，混 合均匀，温育18 h，然后取上层液体，在13°C，21000 g下离心10 min，上清液用0.2 的 微孔滤膜过滤，得含小麦籽粒可溶性提取物的待测样品溶液，-4°C贮存，备用； 2) 采用电感耦合等离子体-质谱联用技术，即ICP-MS测定待测样品溶液，分别得可溶 性提取物中铁和锌的总浓度，用C表示； 3) HPLC与ICP-MS连接，采用高效液相色谱-电感耦合等离子体-质谱联用技术，即 HPLC-ICP-MS测定待测样品溶液，并根据HPLC-ICP-MS测定的色谱图出现的不同波峰和峰 面积，分别计算与波峰相对应的不同化学形态的铁和锌的浓度；铁或锌某一具体化学形态 的浓度，用X表示，单位为mg/kg，按式①计算： :，:_麵_十屬： 式① 式中： C :可溶性提取物中铁或锌的总浓度，单位mg/kg ; Ax :色谱图中铁或锌某一具体化学形态对应的波峰面积； A :色谱图中铁或锌对应的波峰总面积； HPLC工作条件：色谱柱：体积排阻层析柱，用于分离纯化不同形态的铁和锌化合物；流 动相：Tris-HCl缓冲液，流速为0. 47 mL/min ;检测器：紫外检测器；检测波长：214 nm ;柱 温：18°C恒温；进样量：100 PL ; ICP-MS工作条件：射频功率：1. 5 kW，运载气体：0. 85 L/min，喷雾器栗速：0. 2 L/min， 碰撞反应气体：氢氦混合气，氢气流速3 mL/min，氦气流速2 mL/min ;测量同位素为=56Fe和 66Zn。通过向碰撞池中引入氦气可以消除高盐基体可能带来的多原子离子对铁锌同位素的 干扰；其它如冷却气流速等参数设定均无特别要求，在常规范围内即可。
[0006] 所述的，Tris-HCl缓冲液pH为L 5,浓度为(λ 05 mol/L。
[0007] 所述的，步骤（I)中待测小麦粉为小麦籽粒全面粉或分部位磨制的小麦面粉，如糊 粉层、胚乳粉等。所述的待测小麦粉，称取时，面粉中铁和锌的总量控制在3 Pg以内，铁和 锌浓度高的部位称样量少。
[0008] 所述的，步骤（1)中温育温度为37°C，摇床转速120 rpm。
[0009] 所述的，步骤（2)中，ICP-MS测定待测样品溶液可溶性提取物中铁和锌的总浓度 时，采用现有技术中常规方法测定即可。
[0010] 所述的，步骤（3)中体积排阻层析柱，又称多孔凝胶色谱柱，其固定相为有机凝胶； 色谱柱型号优选Superdex 75 10/300 GL，柱长300 mm，直径10 mm，孔径13 Mm，填充剂为 球形复合交联琼脂糖和右旋糖酐。可分离获得相对分子量在0.7到70 kDa的物质，特别适 用于对未知样品的探索分离，大的组分分子在色谱柱中停留时间短，小的组分分子在色谱 柱中停留时间较长，经过一定时间后，各组分按分子大小得到分离。
[0011] 所述的检测方法，每批次样品测定前依次用空白溶液和铁和锌标准溶液检测 ICP-MS仪器的信号稳定性，所述标准溶液中铁和锌浓度均为10 μ g/L。
[0012] 所述的检测方法，同一样品测定1~2次。同一样品2次测定之间，用含20 mmol/L EDTA的50 mmol/L pH7. 5的Tris-HCl缓冲液100 μL清洗1~2次，去除残留在层析柱的金 属。
[0013] 所述的检测方法，测定不同批次样品时，不同样品测定之间，用胃蛋白酶、植酸酶、 氯化钠和10%醋酸的混合液100 ML清洗，去除残留在层析柱的金属，流速：0.2 mL/min，温 度36°C ;所述的混合液中各成分浓度分别为：胃蛋白酶I mg/mL、植酸酶2 mg/mL和氯化钠 0· 5 mol/L，其余为10%醋酸。
[0014] 检测完样品之后，用含10 mmol/L EDTA的50 mmol/L pH 7. 5的Tris-HCl缓冲液 清洗色谱柱1~2 h。
[0015] 本发明检测方法可用于检测的铁的化学形态区包括：高分子量结合态（HMW-Fe)、 中等分子量结合态（MMff-Fe)和低分子量结合态（LMW-Fe)，锌的化学形态包括高分子量结 合态（HMff-Zn)和低分子量结合态（LMff-Zn)，并能检测各形态对应的含量。
[0016] 本发明方法中铁和锌的标准溶液等可以直接购买，优选Sigma公司产品，不同浓 度的溶剂可根据情况自行配制。
[0017] 本发明一种小麦籽粒可溶性提取物中铁和锌化学形态的HPLC-ICP-MS分析检测 方法，具有如下优点： 1.首次尝试用HPLC-ICP-MS分析检测小麦籽粒铁和锌的化学形态，能将铁的化学 形态区分为高分子量结合态（HMff-Fe)、中等分子量结合态（MMff-Fe)和低分子量结合态 (LMff-Fe)，将锌的化学形态区分为高分子量结合态（HMff-Zn)和低分子量结合态（LMff-Zn)， 并能定量检测对应各形态的含量。
[0018] 2.检测方法简单易操作，相同工作条件下，一次进样即可同时测定样品中不同化 学形态铁和锌，辅助试剂价廉易得，检测结果真实可靠，是一种比较理想的小麦籽粒内部铁 和锌化学形态的初步分形检测方法。
【附图说明】
[0019] 图1为实施例1小麦胚乳粉可溶性提取物中铁的化学形态分离色谱图，第一个波 峰出现在16. 6 min，为高分子量结合态铁的化合物（HMff-Fe);第二个波峰出现在30. 2 min， 为中等分子量结合态铁的化合物（MMff-Fe);第三个波峰出现在36. 0 min，为低分子量结合 态铁的化合物（LMff-Fe); 图2为实施例1小麦胚乳粉可溶性提取物中锌的化学形态分离色谱图，第一个波峰出 现在17. 2 min，为高分子量结合态锌的化合物（HMff-Zn);第二个波峰出现在35. 8 min，为低 分子量结合态锌的化合物（LMff-Zn); 图3为实施例2小麦全籽粒面粉可溶性提取物中铁的化学形态分离色谱图，第一个波 峰出现在16. 6 min，为高分子量结合态铁的化合物（HMff-Fe);第二个波峰出现在35. 9 min， 为低分子量结合态铁的化合物（LMff-Fe); 图4为实施例2小麦全籽粒面粉可溶性提取物中锌的化学形态分离色谱图，第一个波 峰出现在16. 7 min，为高分子量结合态锌的