石柑子hplc指纹图谱的构建方法及其hplc指纹图谱的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药质量检测技术领域，特别是涉及一种石柑子HPLC指纹图谱的构 建方法及其HPLC指纹图谱。
【背景技术】
[0002] 柑子是天南星科石柑属植物石柑子Pothos chinensis (Raf. )Merr.的干燥全草， 是瑶医老班药"五虎、九牛、十八钻、七十二风"之一的萌芦钻。石柑子性平，味淡，具有祛风 除湿、活血散瘀、消积止咳的功效，在瑶族地区常用于治疗跌打损伤、风湿骨痛，疗效显著。 由于中药成分复杂，仅凭单一指标难以准确评价中药的质量。中药指纹图谱是指某种（某 产地）中药所共有的具有特征性的某类或某几类成分的色谱或者光谱图谱。中药指纹图谱 因其具有整体性、模糊性和可量化的特点，能够全面地反应中药的内在质量，目前已成为中 药质量控制最有效的方法之一。
[0003] 但目前尚无石柑子药材的质量标准，对石柑子药材质量的控制就显得非常薄弱， 只包括显微鉴别等常规性检查，缺乏完善的质量评价体系，难以达到对石柑子质量的有效 控制。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供石柑子HPLC指纹图谱的构建方法，该方法采用高效液相 色谱（HPLC)建立其指纹图谱，并用相似度软件进行评价，可全面地对石柑子的质量进行评 价，保证药材质量的稳定性及临床用药的有效性与安全性。
[0005] 其具体的技术方案如下：
[0006] 一种石柑子HPLC指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
[0007] (1)供试品溶液的配制：取石柑子粉末（过四号筛）2g，精密称定，置具塞锥形瓶 中，精密加入50%甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再次称重，用50%甲醇补 足减失的重量，过滤，精密吸取续滤液l〇ml，蒸干，残渣加50%甲醇溶解并定容至2ml，过 0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液，即得；
[0008] (2)对照品溶液的制备：精密称定阿魏酰酪胺、丁香酸、香草酸对照品适量，分别 加甲醇制成每1ml含阿魏酰酪胺60. 42 μ g、丁香酸120. 14 μ g和香草酸71. 25 μ g的混合溶 液，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液，即得；
[0009] (3)高效液相色谱分析：
[0010] 精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μ 1，注入高效液相色谱仪中，
[0011] 色谱条件如下：色谱柱：Thermo 0DS-2 Hypersil色谱柱，填料粒径5 μL?，柱长 250mm，柱内径 4. 6mm ；
[0012] 流动相：以甲醇为流动相A，体积百分含量为0. 4%的磷酸水溶液为流动相B，采用 梯度洗脱方式：从〇_15mim，流动相A的体积百分含量由10%提高至20%，流动相B的体积 百分含量由90%降低至80% ;从15-25mim，流动相A的体积百分含量为20%，流动相B的 体积百分含量为80%;从25-35mim，流动相A的体积百分含量由20 %提高至25%，流动相B 的体积百分含量由80%降低至75%;从35-45mim，流动相A的体积百分含量由25%提高至 28 %，流动相B的体积百分含量由75 %降低至72 %;从45-50mim，流动相A的体积百分含量 为28 %，流动相B的体积百分含量为72 %;从50-60mim，流动相A的体积百分含量由28 %提 高至32 %，流动相B的体积百分含量由72 %降低至68% ;从60-70mim，流动相A的体积百 分含量由32 %提高至40 %，流动相B的体积百分含量由68 %降低至60% ;从70-90mim，流 动相A的体积百分含量由40 %提高至70 %，流动相B的体积百分含量由60 %降低至30 %; 从90-120mim，流动相A的体积百分含量为70 %，流动相B的体积百分含量为30% ;检测波 长：300nm ;柱温：30°C ;流速：1.0ml/min ;
[0013] (4)测定24批石柑子药材并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的石柑子 HPLC的标准指纹图谱。
[0014] 所述的石柑子HPLC指纹图谱的构建方法，其还包括以下步骤：
[0015] (5)所述标准指纹图谱的精密度、重现性及稳定性试验，
[0016] (51)精密度试验：
[0017] 取同一供试品溶液，连续进样6次，以11号峰为参照峰，计算出1-16号共有指纹 峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3%，同时用相似度评价软件计算各色谱 指纹图谱的相似度均大于0. 990,表明仪器稳定，精密度良好；
[0018] (52)重现性试验：
[0019] 取同一批石柑子粉末，精密称取6份，按步骤（51)下供试品制备方法平行制备6 份供试品溶液，分别进样，以11号峰为参照峰，计算出1-16号共有指纹峰的相对保留时间 和相对峰面积的RSD值均小于3%，表明所述石柑子HPLC指纹图谱的构建方法重现性良 好；
[0020] (53)稳定性试验：
[0021] 取同一份供试品溶液，分别于0,2,4,8，16,24h进样检测，以11号峰为参照峰，计 算出1-16号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3%，表明供试品溶 液在24小时内稳定。
[0022] 本发明的另一目的是提供上述方法构建得到的石柑子HPLC的标准指纹图谱，所 述石柑子HPLC的标准指纹图谱具有的16个共有峰的相对保留时间tg分别为：0. 178min、 0· 268min、0. 309min、0. 354min、0. 411min、0. 488min、0. 507min、0. 633min、0. 730min、 0· 922min、L OOOmin、L 318min、L 326min、L 525min、L 544min、L 579min〇
[0023] 本发明具有如下优点和用途：通过高效液相色谱（HPLC)建立石柑子HPLC的标准 指纹图谱，并通过试验确定标准指纹图谱的精密度、重现性及稳定性；通过指纹图谱中共有 峰的有无，可全面地对石柑子的质量进行评价，保证药材质量的稳定性及临床用药有有效 性与安全性。
[0024] 下面结合附图与【具体实施方式】，对本发明进一步详细说明。
【附图说明】
[0025] 图1为石柑子HPLC标准指纹图谱；
[0026] 图2为24批石柑子的HPLC指纹图谱叠加图；
[0027] 图3为不同流动相系统的HPLC色谱图；
[0028] 图4为不同浓度磷酸水溶液的HPLC色谱图；
[0029] 图5为不同提取溶剂的HPLC色谱图；
[0030] 图6为精密度试验叠加图；
[0031] 图7为重复性试验叠加图；
[0032] 图8为稳定性试验叠加图。
【具体实施方式】
[0033] 参见图1~图2,以下通过具体实施例对本发明做进一步的阐述。
[0034] 选用Waters Θ2695-2489型高效液相色谱仪（美国）：PAD检测器，四元梯度栗， Empower2数据处理软件系统；Millipore Advantage AlO超纯水系统（美国）；Mettler Toledo XS205DU型电子分析天平（瑞士）；KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪 器有限公司）；HH-8型数显恒温水浴锅（金坛市科析仪器有限公司）。
[0035] 选用阿魏酰酪胺（自制，纯度彡99.5% )，丁香酸（自制：纯度彡99.0% )，香 草酸（批号：X-030-140801，购自成都瑞芬思生物科技有限公司）；液相用甲醇为色谱纯 (Merck);液相用水为超纯水；提取用水为广东省第二中医院制剂室自制纯化水；其余试剂 均为分析纯。
[0036] 色谱条件：色谱柱：Thermo 0DS-2 Hypersil 色谱柱（4. 6 X 250mm，5 μ m);流动 相：以甲醇为流动相A，以0. 4%磷酸水溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱；检测波长： 300nm ;柱温：30°C ;流速：1. OmL/min。
[0037] 表1梯度洗脱程序
[0038]
[0039]
[0040] 供试品溶液的配制：取石柑子粉末（过四号筛）约2g，精密称定，置具塞锥形瓶 中，精密加入50%甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再次称重，用50%甲醇补 足减失的重量，过滤，精密吸取续滤液l〇ml，蒸干，残渣加50%甲醇溶解并定容至2ml，过 0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液，即得。
[0041] 对照品溶液的制备：精密称定阿魏酰酪胺、丁香酸、香草酸对照品适量，分别加甲 醇制成每1ml含阿魏酰酪胺60. 42 μ g、丁香酸120. 14 μ g和香草酸71. 25 μ g的混合溶液， 过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液，即得。
[0042] 指纹图谱的建立：测定24批石柑子药材HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由 其共有特征峰构成的石柑子HPLC的标准指纹图谱（如图1、2所示），其中2号峰为香草酸， 3号峰为丁香酸，11号峰为阿魏酰酪胺.
[0043] 选定该24批样品，将其导入国家药典委员会颁布的"中药色谱指纹图谱相似度 评价系统（2004A版）"，选取时间窗宽度为0. lmin，以中位数生成对照谱图，经过多点校正 后自动匹配，生成石柑子指纹图谱共有模式，并计算24批样品的指纹图谱与该共有模式的 相似度。以11号峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的16个共有峰的相对保留时 间 tg 分别为：0· 178min、0. 268min、0. 309min、0. 354min、0. 411min、0. 488min、0. 507min、 0· 633min、0. 730min、0. 922min、1.0 OOmin、I.318min、I. 326min、I.525min、I.544min、 1. 579min〇
[0044] 将其导入药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统（A版），进行色谱 峰匹配，以11号峰为参照确定16个共有峰为构成石柑子指纹图谱的特征峰，样品共有峰 的相对保留时间及相对峰面积分别列于表2、表3, 24批石柑子与标准指纹图谱相似度计算 结果分别为：〇· 958、0· 952、0· 916、0· 954、0· 971、0· 919、0· 908、0· 941、0· 926、0· 968、0· 993、 0. 9