专利名称：一株固氮螺菌及其微生物制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株新菌种及其制剂，特别涉及一株固氮螺菌及其微生物制剂。
背景技术：
固氮螺菌属由Tarrand et al. (1978)首次描述，现有15个种，其模式株为A lipoferum。固氮螺菌在自然界中分布广泛,特别是在热带、亚热带、温带的土壤中(Lavrinenko et al., 2010)。已经报导该属的数个种因为具有固氮能力，从而可以促进植株生长(Dobereiner, 1983; Okon, 1985)。腐殖质是富含醌基的、非均相的天然有机混合物，广泛存在于陆地环境和水环境中，可以作为微生物厌氧生长的电子受体(Lovley ei a7.，1996; Wu et al. , 2011)。 腐殖质厌氧呼吸在土壤有机污染物降解中有着重要的作用，能够进行腐殖质厌氧呼吸的微生物可以更为快速有效地降解有机污染物。为了获得可以进行腐殖质还原的菌株，在微生物的富集或分离培养中，经常使用腐殖质含醌部分的模式化合物6- 二磺酸二钠(AQDS)作为电子受体(Straub et al.，2005)。尽管已经在天然或人工生境中分离得到了多株腐殖质还原菌株，但是，在此之前，并未有文章报导可进行腐殖质还原的固氮螺菌属菌种。
发明内容
本发明的目的在于提供一株新的固氮螺菌及其微生物制剂。本发明所采取的技术方案是
申请人:于2012年11月I日将菌株提交位于北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所内的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏中心于2012年11月5日收到申请人提供的菌株SgZ-5T，给予该培养物的保藏号为CGMCC NO. 6778，建议的分类命名为AzospiriIlumhumicireducens SgZ_5T。—种微生物制剂,含有上述固氮螺菌SgZ_5T。本发明的有益效果是
本发明的固氮螺菌，不仅具有固氮作用，还可以进行腐殖质还原，在土壤修复、土质改良及促进作物生长等方面具有广泛的应用前景。本发明的微生物制剂，可以很好地应用于土壤修复、土质改良及促进作物生长。
图I是本发明菌株SgZ_5T的透射电镜 图2是本发明菌株SgZ-5T内含物PHB检测的光学显微镜 图3是本发明菌株SgZ-5T以不同电子供体还原AQDS 图4是本发明菌株SgZ-5T与其他菌株比较AQDS还原能力 图5是本发明菌株SgZ-5T的16S rRNA基因系统发育树。
具体实施例方式申请人:于2012年11月I日将菌株提交位于北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所内的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏中心于2012年11月5日收到申请人提供的菌株SgZ-5T，给予该培养物的保藏号为CGMCC NO. 6778，建议的分类命名为AzospiriIlumhumicireducens SgZ_5T。一种微生物制剂，含有上述固氮螺菌SgZ-5T，余部可以是本领域技术人员所熟知的载体。菌株的富集和分离
本发明菌株SgZ-5T分离自本实验室的微生物燃料电池(MFC)的阳极生物膜。使用的MFC中接种有2g水稻土和10 ml的乙酸钠(1000 mg Γ1)培养液。具体的富集和分离操作如下
取一小片阳极生物膜，置于100 ml添加有乙酸钠(电子供体，终浓度为10 mmol Γ1)和AQDS (电子受体，终浓度为I mmol Γ1)的灭菌矿物盐培养基(MSM)中[MSM，每升培养液中含有 2.5 g NaHCO3, O. 68 g NaH2PO4, O. 25 g NH4Cl, O. I g KCl (Li et al., 2009)，以及1% (V v)的微量元素溶液和1% (V v)的的维生素溶液(Lovley & Phillips, 1988)，pH 7.2]，向瓶中通入无氧的N2/C02 (80/20，v/v)混合气30 min，排除其中存在的氧气，之后使用丁基橡胶塞加铝盖密封，30°C静置培养，观察培养液的颜色变化情况；
5d后，培养液变为橙黄色，表达培养液中添加的AQDS被微生物还原了。因为AQDS本身是无色的，其还原态是橙黄色。之后从瓶中取10% (10 ml)的培养液，接种至100 ml新鲜培养液中，如此富集培养3次。菌株的分离通过平板涂布法进行。将富集培养物梯度稀释，然后涂布在NA (营养琼脂培养基，PH 7. 2)平板上，30 °C培养4 d。其中，NA的组成为每升去离子水中添加5g蛋白胨、3 g牛肉浸膏、5 g NaCl和15 g琼脂。筛选出单菌落并接种至相同的培养基上，以便进行后续研究。得到的菌株在添加了 15% (v/v)甘油的NB培养基中于-80°C保存。除非特别说明，进行形态学、生理学、生化分类学研究时，菌株SgZ_5T均在pH为
7.2的NB培养基上，30°C条件下进行培养。菌株SgZ_5T培养24 h后，进行细胞形态学观察。菌落形态直接在NA培养基上观察。革兰氏反应按Doetsch (1981)所述的方法进行。使用Hugh和Leifson使用的培养基和方法(Leifson，1963)进行氧化发酵测试。麦康凯培养基生长实验如下在麦康凯平板上接种150 μ I细菌悬浮液，30°C培养I周。生物素需求分析按Tarrand等人(1978)描述的方法进行。测试了不同温度下(0，4，10，15，20，25，30，37，40，42，and 45°C )菌株在NB培养基生长一周的情况。在含有0-10% NaCl (w/v)的NB培养基上进行菌株的NaCl耐受生长测试，以增殖1%判定为可生长。在NB培养基上确定菌株的生长pH范围，使用的缓冲系统为pH 4. O - 5. O, O. I M柠檬酸/0. I M柠檬酸钠;pH 6. O - 8. O, O. IM KH2P04/0. I M NaOH; pH 9.0-10.0，O. I M NaHC03/0. I M Na2CO3; pH 11. 0, 0. 05 MNa2HP04/0.1 M NaOH (Zhang et al., 2009)。根据厂家的使用说明书，使用 API 20E, API20NE和API ID 32GN菌株鉴定试剂条(bioM6rieux)确定菌株的其他生理生化特性。菌株的运动性、氧化酶活性、过氧化氢酶活性、脱氧核糖核酸酶活性，吐温-80、吐温-20、卵磷酯、酪蛋白、纤维素和淀粉的水解活性按《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英，2001)进行。所有的测试进行2次。鉴定结果显示
菌株SgZ-5T为革兰氏阴性菌，兼性厌氧，有鞭毛，为螺旋或略为弯曲的棒状，长I. 2 -
1.8Mm，宽2. 5-5. 5 Mm，依靠端生单鞭毛进行运动(见图I);细胞内含有颗粒，苏丹黑染色后光镜检测确认颗粒为聚羟基丁酸(PHB) (Schlegel et al. , 1970)(见图2)。菌株在NA培养基上有氧生长24 h (30°C)后，形成奶油色、图形、光滑、凸起并不透明的菌落，菌落直径为I. O - I. 5 _。菌株582-57在咄培养基上，25 37°C，pH 5.5-8.5 (最佳7. 2)和O - 1% NaCl的条件下可以生长。菌株具有运动性、氧化酶活性、过氧化氢酶活性、七叶甙水解活性、可利用葡萄糖盐、己二酸，无脱氧核糖核酸酶活性、无法进行亚硝酸盐还原、无法利用苯乙酸，无法通过氧化发酵测试。菌株SgZ-5T与近源菌株的部分生理学特性比较见表I。表I、菌株特性比较表
权利要求
1.一株固氮螺菌，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏号为CGMCC NO.6778。
2.一种微生物制剂，含有权利要求I所述的固氮螺菌。
3.权利要求I所述的固氮螺菌在腐殖质还原中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株固氮螺菌及其微生物制剂。固氮螺菌SgZ-5T保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNO.6778。本发明的固氮螺菌SgZ-5T，不仅具有固氮作用，还可以进行腐殖质还原，在土壤修复、土质改良及促进作物生长等方面具有广泛的应用前景。
文档编号C12N1/20GK102965307SQ20121044908
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月9日 优先权日2012年11月9日
发明者杨贵芹, 周顺桂, 韩陆超 申请人:广东省土壤科学博物馆